溺死大鼠肺组织和水样中硅藻检验的定量对比研究
李 影，陈轶群，赖 杰，杨学灏，杨博文，任 亮*
（华中科技大学同济医学院法医学系，武汉 430030）
摘 要： 目的 研究大鼠肺组织中硅藻与水样中硅藻数量的比值判断死亡原因的应用价值和判断标准。方法 取36只成年SD大鼠随机分入双蒸水组、高浓度硅藻组、低浓度硅藻组三个大组中（各12只），各大组再分为溺死组和死后抛尸组，每组（n =6）应用微波消解-真空抽滤法，对肺组织中硅藻含量与水样中硅藻浓度进行分析。结果 动物实验证实大鼠溺水死亡后，肺组织中检出的硅藻量与水样中硅藻浓度有关,溺死大鼠的肺组织与水样硅藻含量比平均值为0.47±0.07且其95%置信区间为(0.32，0.61)。结论 肺组织硅藻检验的定量分析结果可作为推断水中尸体死亡原因的辅助依据，本研究提供了一种基于肺组织与水样硅藻含量比的溺死判断标准。关键词： 溺死；硅藻检验；微波消解；真空抽滤；定量分析
硅藻又称矽藻，是一种广泛分布于各类自然水体中的单细胞生物。自从20世纪初以来，硅藻被发现可随水进入溺死者的肺及其他脏器，硅藻检验逐渐成为溺死诊断的重要辅助手段[1]。在死者的肺、肝等内脏器官或骨髓中发现硅藻一般被认为是溺死的证据之一[2]。但是在非溺死者的器官、组织中有时也可检出硅藻[3]，而溺死者也存在硅藻检验阴性的情况，故业内对于硅藻检验结果的解释和应用存在争议[4]。为了解决这些争议，一些学者提出硅藻检验判定溺死的定量标准：Ludes等的研究表明，当水中尸体肺组织中硅藻检出值大于20个/ 10 g，可以判断为生前溺死[5]；王磊等的研究则认为，肺组织中硅藻数量大于2个/ 5 g，可考虑为溺死[3]。不同的学者对于这个定量标准都有自己的看法，然而不同水体中的硅藻数量、种类及分布都有自己的特点，因此这些仅考虑肺而不考虑水体情况的判断标准并不适用于所有溺死相关案件[6]。本研究以该争议为切入点，配制不同浓度的硅藻水样模型并构建大鼠溺死模型、死后抛尸模型，然后用微波消解-真空抽滤法[6]对动物大鼠肺中硅藻进行定量分析，并对硅藻检验分析结果进行对比和探讨。
1 材料与方法
1.1 实验动物及硅藻
成年SD大鼠，体质量250～350 g，雌雄不限（华中科技大学同济医学院实验动物中心）。
闺蜜说我瞎操心，这种时刻我最该担心的是我自己的处境。俗话说男人有钱就变坏，周桥现在接触到的层面或许比以前要宽阔，会受到更多的诱惑，一定要有一颗谨慎之心。
小环藻属硅藻土（中科院水生生物研究所）。
1.2 实验仪器与试剂
仪器：电子天平（乐祺LQ-C100001），Tropex微波消解系统、高分子聚合材料消解罐、G-100电子恒温加热器（Preekem科学仪器有限公司），HL-6多联真空抽滤设备（珠海黑马医学仪器有限公司），多聚醚砜滤膜抽滤杯（珠海黑马医学仪器有限公司，300 mL，滤膜有效滤过直径18 mm，过滤微孔直径0.45 μm），光学显微镜（Nikon）。
从表1中的数据我们可以看出，溺死大鼠肺中硅藻含量与水样中硅藻浓度有关。在不含硅藻的双蒸水中溺死的大鼠肺中未检测出硅藻，而在低硅藻浓度的水样中溺死的大鼠肺中硅藻检出值明显小于在高硅藻浓度水样中溺死的大鼠（P ＜0.05）。
江西茶叶出口企业要在茶叶制造过程中采用国际标准和国外先进标准，以绿色消费需求和高效生态农业为导向，切实提高茶叶的卫生标准和质量安全。种植茶树这个初始阶段在茶叶生产的整个过程中非常重要，因为这涉及对茶树病虫害的管理。在茶叶的加工制造过程中，对采茶、制茶、包装、保存等方面制定严格的标准，这样有利于提高出口茶叶在安全、卫生、环保等方面的品质，从而减少茶叶出口时所面对的绿色贸易壁垒，为顺利开辟国外市场、创立名牌创造条件。
1.3 实验动物分组
以往对产教融合的研究，往往是以企业为主体，忽视了职业院校这一主体。通过创新产教融合的人才培养模式，可以解决在产教融合过程中存在的问题，从而提高人才培养质量。
1.4 水样模型、动物模型制作及检材提取
水样模型制作：随机取不同量的小环藻属硅藻土（分别重0.82、2.78 g），分别加入到15 L双蒸水中，充分混匀后得到含不同浓度的小环藻的水样模型。双蒸水组直接使用双蒸水作为水样进行实验。
溺死组动物模型制作：参考文献[7]记载的溺死动物模型制作方法，模拟新西兰大白兔溺死模型建立SD大鼠溺死模型。将大鼠放入金属捕鼠笼里，静置2 min使呼吸、心跳等体征恢复正常后浸入水样模型中，浸入1 min后提出水面，待30 s后再次沉入水面以下，以此为循环重复5次使大鼠充分溺死，死后在水样中持续浸没30 min后取出。解剖大鼠，并提取完整的肺及相应水样，记录器官质量后密封存放备检。
死后抛尸组动物模型制作：将大鼠采用尾静脉空气栓塞法处死，然后采取与溺死组模型相同的方法在水样模型中浸没30 min后取出。后续操作与溺死组相同。
1.5 硅藻检验
1.5.1 微波消解
1.5.3 切片制作
从以上实验数据可以看出，肺组织硅藻定量分析在生前溺水的死因判断中具有重要的意义。硅藻广泛分布于各类自然水体中，其种类繁多形态各异。有生命体征的个体在溺水过程中，大量硅藻随溺液进入肺泡，并从破裂的肺泡毛细血管进入循环，随后分布到全身各器官[1]，故在水中尸体的内脏器官中检测出硅藻被认为是溺死诊断的支持性证据。一般而言，在肺中检测出硅藻也是溺死诊断的必要条件。即便尸体高度腐败，其器官内硅藻由于不受该因素的影响，仍能用来鉴定溺死，而至今尚无其他实验室方法可以代替[9]。因此硅藻检验仍是溺死鉴定的最佳实验室方法之一，而明晰关于硅藻检验的定性、定量标准，建立可信赖的溺死判断标准的意义重大。
经测定，双蒸水中不含硅藻，低浓度组水样中硅藻含量为1667个/ mL，高浓度组水样中硅藻含量为5467个/ mL，死后抛尸组大鼠肺内均未检测出硅藻。
取大鼠肺组织2 g及现场水样1 mL分别置入消解罐内；加入2 mL浓硝酸、1 mL双氧水后95 ℃预热5 min，然后封口进行微波消解。微波消解程序设置：5 min内将微波功率提升至1000 W，温度控制在190℃，气压控制在50 kPa，保持15 min后停止微波辐射，以自然吸气排风冷却方式使高分子聚合消解罐外部温度降至50 ℃。然后将50 mL双蒸水加入高分子聚合消解罐以缓冲组织消解液的酸度，置于通风橱中等待抽滤。
待抽滤杯中的液体抽滤完毕后，拆下抽滤杯，取出多聚醚砜滤膜，置于烤片机上50℃烘干15 min。分别用滴管吸取乙酸和丁香油酚按照体积比3∶7的比例混匀搅拌成混合液备用，该溶液即为使多聚醚砜滤膜透明化的试剂。用滴管吸取混合试剂，均匀滴3滴于载玻片上后将多聚醚砜滤膜小心覆盖于载玻片上，再均匀滴3滴混合试剂于聚醚砜滤膜上，然后覆盖盖玻片于聚醚砜滤膜上封片并置于烘干机上50 ℃烘干15 min后，完成切片制作。
1.6 计算及统计分析方法
切片硅藻计数方法使用“三区四象限二野法”进行统计[8]。
实验数据采用SSPS 18.0统计软件进行统计分析。
2 结果
将多聚醚砜滤膜过滤杯固定于HL-6多联真空抽滤设备接口上，并倒入100 mL双蒸水缓冲消解液的酸度，等待抽滤。将抽滤设备负压设置为-60 kPa，开启抽滤开关，然后将消解液缓慢倒入抽滤杯中进行抽滤。待液面接近滤杯底部时，再用150 mL双蒸水分三次均匀冲洗滤杯内壁，然后等待抽滤完毕。
将36只成年SD大鼠随机分入双蒸水组、高浓度硅藻组（简称高浓度组）、低浓度硅藻组（简称低浓度组）共三个大组中。每大组都包括溺死组和死后抛尸组两个小组，每个小组6只。
溺死组大鼠肺组织硅藻计数见表1。
表1 溺死大鼠肺组织硅藻计数(n =6) (个/g)
Table 1 Diatom counts in deceased rat's lung tissues (n =6)(quantity/g)
试剂：双蒸水（自制），分析纯硝酸、30%双氧水溶液、乙酸（广州白云化工厂），丁香油酚（上海国药）。
为了消除水样硅藻浓度对检验结果的影响，我们引入肺组织与水样硅藻含量比的概念，即用单位质量的肺检材中硅藻的数量与单位体积水样中硅藻数量做比值（以下简称肺水硅藻比），其结果如表2所示。经过SPSS18.0统计学软件进行方差分析，我们发现低浓度组与高浓度组中溺死大鼠的肺水硅藻比没有显著差异（P ＞0.05），而各溺死组与死后抛尸组的肺水硅藻比差异均有统计学意义（P ＜0.05）。
表2 肺组织与水样硅藻含量比(n =6)
Table 2 Ratio of diatom counts in deceased rat's lung tissues to the related water sample (n =6)
3 讨论
通过分析实验数据，我们有如下发现：1）溺死大鼠肺中硅藻检出量与水样中硅藻浓度呈正相关；2）在不同硅藻浓度水样中溺死的大鼠，其肺组织与对应水样硅藻含量比没有显著差异；3）死后抛尸各组大鼠肺中未检测出硅藻。我们将各溺死组数据一同进行统计学分析，发现溺死大鼠的肺水硅藻比为平均值为0.47±0.07，其95%置信区间为（0.32，0.61），而死后入水大鼠及双蒸水中溺死的大鼠肺中均未检测出硅藻，此差异足以用来判断和鉴别生前溺死与死后入水，因而该项指标可作为推断水中尸体死亡原因的辅助依据。
1.5.2 真空抽滤
中科院遗传资源研发中心（南方）是由中科院遗传发育所与常州市人民政府及常州高新区管委会合作共建，中心包括现代农业和再生医学两大基地以及神农大科学装置平台、临床级干细胞库平台、高等模式动物平台、种子库平台、教育培训平台五大平台。目前，总投资预计10亿元的神农大科学装置已由中国科学院向国家发改委申报列入重点项目，立项后将建成国际上首个可以对基因型、表型、养分、环境、气象等因素进行全面检测与分析的作物品种筛选设施。该中心拥有高水平的农业创新平台，农业科研能力突出，建成后将对常州市农业育种提供强有力的支撑。
以往传统单调的教学模式如今被注入了一股新的血液，便是生活化教学。其多样的教学方法和丰富的教学内容为全面提高小学生语文综合素质提供了莫大的帮助。因此，小学语文生活化教学作为一种全新的教学理念，也要求相关教育者一起把握生活化的特点，有效提高小学生的语文学习成果。
本研究中，双蒸水中溺死的大鼠肺中均未检测出硅藻，由此看出硅藻检验阴性仍不能排除溺死的诊断。法医学实践中对于在游泳池、浴缸等硅藻缺乏的水中发现的尸体，需结合尸检发现和案情综合分析鉴定，此时硅藻检验结果的意义因客观条件制约而有限[1]。
法医学实践中遇到有关涉水尸体案件的性质判定时，法医工作者需要谨慎地将案情、尸检情况、溺水地点等信息结合进行全面评价，在充分排除其他死因的基础上，利用硅藻检验的结果辅助诊断溺水死亡。硅藻检验的方法很多，近年来报道的微波消解-真空抽滤技术比过去长期使用的强酸-乙醇消化法更加安全环保，能很好地控制操作过程中的外源性污染，并具有很高的硅藻回收率，更加有利于进行定量分析[10]。本研究利用微波消解-真空抽滤的方法，实现高回收率的硅藻检验的同时进行了定量分析，发现溺死大鼠肺中硅藻检出量与水样中硅藻浓度有正相关关系，确定了肺组织硅藻检验的定量分析结果可作为推断水中尸体死亡原因的辅助依据的同时，也提供了一种基于肺组织与水样硅藻含量比的溺死判断的标准。本研究结果表明，生前溺死的诊断不能仅仅依靠肺中检验出硅藻的量进行判断，还需要引入水样中硅藻的浓度并进行对比定量分析，才能最终得出相对客观的结论。
最后，完善合同条款，明确对方服务标准和要求，如服务时间、开机率、服务季报及重大维修专项报告等；付款实行分期季付或半年付，且先服务后付款，尤其是最后一期付款前，维保服务提供方应完成整机主要参数指标情况比照，并由医院对维保服务成效确认后才可进行支付。
值得一提的是，有学者的研究数据表明溺水死亡尸体的肺硅藻含量高于尸体所在水域[11-12]，而本研究的结果与该结论之间存在差异。同时，也有其他学者通过类似的溺死动物造模实验得出支持本研究结论的实验结果[13-16]。这个差异存在的原因可能在于以下几个方面：1）前者的数据建立在实际案件之上，这些案件中的死者溺死过程以及死者生前的生理、精神状态可能更加复杂，从而影响到死者真正在水中存活的时间[17]；2）案件中检材样本的提取涉及到案发、发现尸体及水样提取时的时间、地点和季节差异，自然水体的流动性，溺水深度及水压的差异等，而本研究中实验动物的溺死过程为实验人员严格控制，实验动物溺死时间大致相同，器官、水样的提取时间一致，溺死模型建立未涉及水深、水压及水体流动性等方面；3）尚未有研究阐明人体与实验动物在肺组织与对应水样硅藻含量比上的差异；4）电镜与光镜的观察精度也不同[14]。因此，本研究结论的实际应用尚需更深入的实验印证、更多的实际案例对比以及更全面的经验总结。
首先，生产前沿面的构造、投入要素、期望产出及非期望产出均同上文所述一致。假定 为动态要素，则每个生产决策单元期的投入产出值可以表示为
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Quantitative Comparison of Diatoms in Both the Lungs of Rats Died from Drowning and Drowning Media
LI Ying, CHEN Yiqun, LAI Jie, YANG Xuehao, YANG Bowen, REN Liang*
(Department of Forensic Medicine of Tongji Medical College, HuaZhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China)
ABSTRACT: Death cause of corpse in water plays an important part for forensic medical examination, yet difficult to diagnose as “true drowning” based solely on postmortem phenomenon. Currently, diatom testing, albeit considered as the“golden standard” for drowning diagnosis, remains controversial. This study aimed to investigate the value of quantitative diatom from deceased rats' lung tissues against the involved water samples, to discover and diagnose the death cause of corpses out of drowning. Thirty-six SD rats were randomly divided into 6 groups, conducting with different experimental treatments to their life end. All the deceased rats' lung tissues were collected, having diatoms recovered from each of them through microwave digestion-vacuum filtration. The comparison indicates that the lung-tissue-carried diatom quantity is of positive correlation with the diatom density of related water samples. The average ratio (diatom counts in lung tissues of drowned rats to the ones in related water sample) is 0.47±0.07, with the 95% CI as 0.32, 0.61. Accordingly, quantitative diatom in lung tissue can be an auxiliary reference for estimating the death cause of submerged cadaver, thus offering a standard for drowning diagnosis by the ratio of diatom counts in the deceased's lung tissue to the relevant water sample.
KEY WORDS: drowning; diatom analysis; microwave digestion; vacuum filtration; quantitative analysis
中图分类号： DF795.1
文献标识码： A
文章编号： 1008-3650(2019)04-0313-04
DOI： 10.16467/j.1008-3650.2019.04.007
基金项目： 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（No.2016FYDC003）
第一作者简介： 李影，女，吉林四平人，本科在读，研究方向为法医学。E-mail: 1506764934@qq.com
* 通讯作者简介： 任亮，男，河南安阳人，博士，讲师，研究方向为法医病理学、法医毒理学。E-mail: 36918280@qq.com
收稿日期： 2017-08-19；2017-11-06
引用 本文格式：李影，陈轶群，赖杰，等. 溺死大鼠肺组织和水样中硅藻检验的定量对比研究[J]. 刑事技术，2019,44(4):313-316.