王永梅[1]2003年在《黄芩甙抗CVB_（3m）和调控CVB_（3m）感染小鼠心肌免疫损伤及细胞凋亡的实验研究》文中研究说明目的：观察SB对细胞活性的影响，研究SB体外抗CVB_(3m)的作用效果与机制；探讨SB在大鼠体内药代动力学参数；阐明SB体内抗CVB_(3m)的作用机制和对CVB_(3m)感染所致的心肌免疫损伤(细胞凋亡及CMC)的靶效应。 方法：①采用微量细胞培养技术和生物染料摄入法，以CPE及细胞活性为判定指标，观察不同浓度的SB抗CVB_(3m)作用及对细胞活性的影响。确定SB对细胞的TD_0、TD_(50)和抑病毒率和抑病毒指数。②以40mg/kg的剂量给大鼠灌胃后，于不同时间收集尿液并取心、肝、肾，采用高效液相色谱法测定样品中SB的含量。③应用克隆测序法鉴定CVB_(3m)诱导BALB/c小鼠心肌炎模型。④通过建立CVB_(3m)腹腔注射诱导的BALB/c小鼠心肌炎模型，观察SB对CVB_(3m)感染小鼠发病后的整体状态变化，包括体重变化、进食水情况，比较各组小鼠VMC的发病率和死亡率，并观察了SB对小鼠心脏体重比、心肌病理组织学及超微结构变化的影响，全面整体的评价了SB对VMC小鼠的整体保护作用。⑤采用免疫组化检测造模小鼠灌服SB后不同时间心肌细胞中iNOS、Fas的表达，并应用TUNEL法检测心肌细胞凋亡，探讨SB对感染心肌细胞凋亡的影响。⑥应用RT-PCR技术检测感染小鼠给药后不同时间心肌组织中CVB_(3m)RNA的复制和iNOS、Bcl-2、Fas的mRNA表达，博士学位论文黄琴贰抗CvB、和调控cV队感染小鼠心肌免疫损伤及细胞凋亡的实验研究探讨SB在CVB、感染过程中调节心肌组织中细胞凋亡的机制。结果一体外实验实验发现低于T氏的SB对细胞活性未见明显影响，并在一定浓度范围内有促细胞生长的作用。药物组对CVB加增殖均有抑制作用，尤以SB组作用最明显，优于X口、黄琴及Ri bavirin组，抑制率为109.既;各组抑病毒指数均高于2，有明显的抑病毒作用，与R ibavirin组比较，SB及X口的抑病毒指数有显着差异。二、药代动力学实验经检测尿液SB含量及计算，SB在大鼠体内的代谢符合二室动物模型。并发现SB在心、肝中含量较高。叁、动物实验(一)克隆测序鉴定模型。模型组7天小鼠的心肌内CVB如扩增产物克隆测序结果与CVB、Naney株全序列判读828bp，错配5个碱基，符合率为99.5%。(二)感染小鼠多在3一4天后出现病态表现，症状严重者可导致死亡，死亡多发生在5一10天。模型组93%发病，总死亡率70%;SB组的发病率和死亡率均低于模型组及病毒灵组，并有显着性差异。病毒感染后，感染小鼠心脏重量增加，体重下降，心脏重量系数增高，模型组尤为明显，与正常组比较有显着性差异(P<0 .05);SB与模型组比较，各项均有显着差异(P<0 .05)。SB对心肌博士学位论文黄琴贰抗CVB、和调控CvB、感染小鼠心肌免疫损伤及细胞凋亡的实验研究病理组织学及电镜超微结构均有明显改善作用，SB组作用优于病毒灵组(P(0 .05)。(叁)分别采用免疫组化法及TUNEL法检测造模小鼠给药后不同时间心肌细胞1 NOS、FaS的表达及心肌细胞凋亡情况。结果SB在恻C急性期能明显增加心肌细胞iNOS及FaS的表达，诱导心肌凋亡细胞，与模型组相比有显着差异(P<O.05)。而在恢复期能明显减少心肌细胞iN伍及Fas的表达，减少心肌凋亡细胞，与病毒灵组相比有显着差异(P<0 .05)。 (四)达。结果:应用RT一咫R方法，检测心肌细胞内C跟，的刚A表达和iNOSInl俐A表正常组CVB潇酮A与1 NOS而酮A的表达均为阴性。模型组小鼠的心肌内C姐加刚A与iN咙而州A的表达均明显高于正常组，CVB、的表达第5天达到高峰，后逐渐下降，CVB枷的表达增强与iN咙而酮A的表达增强同时存在。SB组3一5天iNOS 11识NA的表达均明显高于模型组(P<0 .05)，5天后逐渐阳氏;与病毒灵组比较有显着差异(P(0.05)。(五)应用RT一PCR方法，检测心肌细胞内Bd一2和Fas的而州A表达。结果:1、正常对照组在实验过程中见少量Fasmf州A的表达，其余各组可见大量表达，在造模第3一7天表达量均呈上升趋势，随后各组的含量均呈下降趋势，SB组的含量显着高于模型组和病毒灵组(P<0 .05)。2、正常组的心肌可见到一定量的Bd一Zml酮A表达，造模第3一7天，模型组的Bcl一2的耐训A量逐渐增加，高于正常组，SB组的含量则明显低于模型组。7天后模型组Bd一2的表达逐渐博士学位论文黄答贰抗CVB、和调控Cv氏感染小鼠心肌免疫损伤及细胞凋亡的实验研究降低，而SB组Bcl一2的表达逐渐升高，渐恢复正常。结论一、体外实验通过比较SB作用于细胞与病毒的不同环节，提示SB具有保护细胞减轻病毒感染功效及直接杀伤CVB、的作用。二、药代动力学实验灌胃给药后，SB在大鼠体内的代谢符合二室动物模型。并发现SB在心、肝中含量较高。叁、动物实验(一)采用克隆测序法鉴定造模毒株，方法先进，指标灵敏、可靠，适于推广应用;证实本实验所选用毒株为柯萨奇病毒氏亲心肌株;本实验模型符合急性诩C模型。(二)通过比较观察心脏体重比、病理组织学及电镜超微结构变化，发现SB对CVB:、VMC小鼠有明显的整体保护作用，使小鼠死亡率明显阳氏，VMC发病率降低，生存质量明显提高;并对心肌细胞损伤均有明显保护作用，优于病毒?
周丽[2]2004年在《柴胡、黄芩提取物调控CVB_（3m）小鼠心肌免疫损伤及细胞凋亡的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：观察柴胡、黄芩提取物对CVB_(3m)感染小鼠病毒性心肌炎的量效关系；阐明黄芩提取物抑制CVB_(3m)复制及调控CVB_(3m)感染小鼠心肌免疫损伤，柴胡提取物抑制心肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的作用机制。 方法： 1．通过建立CVB_(3m)腹腔注射诱导的BALB／c小鼠心肌炎模型，不同浓度柴胡、黄芩提取物对小鼠心脏体重比、心肌病理组织学，确定保护小鼠心肌的最佳给药剂量。 2．采用RT-PCR法检测造模小鼠灌服黄芩提取物后不同时间心肌组织中CVB_(3m)的RNA及FasLmRNA的表达，探讨黄芩提取物对CVB_(3m)复制及对CVB_(3m)感染小鼠心肌免疫损伤的调控作用。 3．应用免疫组化法检测感染小鼠给药后不同时间心肌组织中Fas、Bcl-2及Caspase3的蛋白表达，应用TUNEL法检测心肌细胞凋亡，探讨柴胡提取物在CVB_(3m)感染过程中对于心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白的调节机制。 结果 (一)观察不同浓度柴胡、黄芩提取物对小鼠心脏体重比、心肌病理组织学变化影响。 (1)两药都存在着明显的量效关系，高剂量组与模型组及低剂量组均存在着显着差异。 (2)柴胡提取物中高剂量组的发病率与模型组无明显差异，但死亡率明显低于模型组，差异显着；黄芩提取物高剂量组的发病率和死亡率均低于模型组，有显着差异。 (二)采用RT-PCR法检测造模小鼠给药后不同时间心肌组织中CVB_(3m)RNA的表达及FasL mRNA的表达。 (1)正常组CVB_(3m)的表达为阴性；模型组小鼠心肌内CVB_(3m)的表达明显高于正常组；黄芩提取物组的CVB_(3m)的表达明显低于模型组。 (2)正常组小鼠心肌无FasL mRNA表达，黄芩提取物组小鼠心肌FasL表达均低于模型组，两者比较差异显着。 (叁)应用TUNEL法检测心肌细胞凋亡，免疫组化方法检测心肌细胞内Fas、Bcl-2及Caspase3蛋白表达。 (1)CVB_(3m)病毒性心肌炎小鼠凋亡的心肌细胞明显，与对照组有显着差异(p＜0.5)；同时， 模型组Fas、Bcl－2、Caspase3表达与对照组相比均有显着差异(p＜0.05)。 (2)柴胡提取物能减轻心肌细胞凋亡，减少Fas，Caspase3表达，轻度升高Bcl－2的表达。 结论 一、柴胡提取物及黄芩提取物对于病毒性心肌炎小鼠心肌有保护作用，且两药都存在着明显的量效关系；二、黄琴提取物能够有效的抑制CVB、的复制及减轻FasL的表达，从而减轻病毒性心肌炎小鼠心肌炎心肌的病变。叁、柴胡提取物能够降低Fas，Caspase3表达，轻度升高Bol一2的表达，减轻心肌细胞的凋亡，保护心肌:
参考文献：
[1]. 黄芩甙抗CVB_（3m）和调控CVB_（3m）感染小鼠心肌免疫损伤及细胞凋亡的实验研究[D]. 王永梅. 南京中医药大学. 2003
[2]. 柴胡、黄芩提取物调控CVB_（3m）小鼠心肌免疫损伤及细胞凋亡的实验研究[D]. 周丽. 辽宁中医学院. 2004
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