郑福英[1]2004年在《间接ELISA检测新型鸭瘟抗体和IFA检测新型鸭瘟病毒的研究》文中进行了进一步梳理本研究对新型鸭瘟病毒(暂定名)的提纯方法,检测新型鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法,对病毒抗原进行定位的间接免疫荧光法,不同继代代次的鸭胚尿囊液对鸭的致病力与抗原检出率的关系进行了研究,确定了病毒抗原的最佳提纯方法,间接ELISA的最佳反应条件和其敏感性、特异性和重复性,对病毒抗原进行了定位,确定了不同代次的病毒对鸭的致病力与抗原检出率的关系。结果表明:以50%饱和度(NH4)2SO4法或10%PEG6000沉淀法粗提,再经Sephadex G-200层析纯化,可获得纯度较高的病毒抗原;间接ELISA方法检测新型鸭瘟血清抗体有很高的敏感性,特异性和重复性;间接免疫荧光法证实病毒含量以鸭的肝、脾最高,其次为血液、脑、鼻腔分泌物;随着继代次数增多,该病毒对鸭的致病力明显减弱,20代后基本不能使鸭发病,但能在鸭体内顺利增殖,对病毒检出率没有影响。本研究共分四部分:第一部分:新型鸭瘟病毒的提纯从自然发病死亡且有典型症状的病例中分离到一株病毒,接种12日龄番鸭胚传代,收集接种后48h-120h死亡,胚体有典型病变的鸭胚尿囊液,分别以50%饱和度(NH4)2SO4法、60%饱和度(NH4)2SO4法、8%PEG6000沉淀法、10%PEG6000沉淀法粗提鸭胚尿囊液中的病毒,再经Sephadex G-200层析,纯化粗提病毒样品,并控制不同流速。结果表明以50%饱和度(NH4)2SO4法和10%PEG6000沉淀法粗提病毒效果相当,Sephadex G-200层析时控制流速为0.5ml/min时效果较好,大于0.5ml/min很难将病毒与杂蛋白分开,小于0.5ml/min时峰域变宽、拖尾,同样影响分离效果。第二部分:间接ELISA检测新型鸭瘟血清抗体将纯化病毒作为包被抗原,包被浓度1.17ug/孔,包被后37℃1h转入4℃过夜包被效果较好;封闭后以37℃1h、血清加入后以37℃1h、酶标抗体加入后以37℃1h反应,效果较理想,酶标抗体工作浓度0.25ug/ml。经检测
吴英[2]2015年在《鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析及UL55基因功能初步研究》文中认为鸭瘟(duck plague)又称鸭病毒性肠炎(duck virus enteritis),是鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病。本病发病快、死亡率高,是目前世界各国水禽业危害最严重的传染病之一。该病的病原鸭瘟病毒(Duck Plague virus, DPV)是疱疹病毒科(Herpesvirales)、α疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)、马立克氏病毒属(Mardivirus)的成员之一。但由于DPV的研究起步晚,其分子生物学研究远远落后于其它疱疹病毒。一段时间以来对于DPV的研究多集中于流行病学、诊断和防治等方面；与其分子生物学特性相关的基础研究,如病毒的基因组结构、物理图谱、病毒基因功能以及病毒在机体细胞和组织中的复制及致病机理、病毒感染过程以及机体抗病毒感染机制等多方面研究均有许多不明之处。因此本论文的主要目的就是希望对本实验室测序获得的鸭瘟病毒基因组序列进行解析；并通过构建一个可以对DPV进行细菌遗传学操作的平台,为DPV的基因功能研究提供技术手段的支持,此外利用该平台用两步RED重组敲除UL55基因,验证此平台的可行性并初步阐释UL55功能。主要研究内容如下：1鸭瘟病毒中国强毒株基因组信息解析对本实验室测序获得的鸭瘟中国强毒株的基因组序列进行生物信息学分析。鸭瘟病毒中国强毒株基因组组成为双股线状双链DNA:UL-IRS-US-TRS,是典型的D型疱疹病毒基因组结构。DPV CHv基因组全长162,175 bp,GC含量为44.89%,包括潜在的76个能编码功能蛋白的ORF。BLAST搜寻相似性序列发现五条与DPV CHv同期或之后提交的其他鸭瘟病毒毒株全基因组序列,他们间具有高度同源性,进化树分析显示六株DPV病毒按地域和毒力差异进行分类,DPV CHv处于进化树的中间位置。对基因组编码区的ORF进行扫描分析发现,六株DPV在UL、US区域分别有23、5个ORF在核苷酸水平上存在整个ORF的缺失、部分序列插入、缺失等情况出现,这些突变的产生可能是造成六株不同来源毒株毒力和地理差异的主要原因。而DPV基因组中不存在核苷酸序列插入或缺失的53个ORF在氨基酸水平上高度同源,多为DPV基因组的保守性基因,不受病毒传代致弱及地域差异的影响,编码蛋白大多为与病毒DNA代谢相关的结构蛋白。密码子使用模式分析结果显示其在基因组密码子的使用上偏向A/T结尾的密码子,其密码子使用模式主要受突变压力的影响。将其与人类、大肠杆菌、酵母的密码子使用模式进行比较,结果表明鸭瘟病毒的密码子使用模式与酵母系统更为接近。2鸭瘟病毒UL55基因生物信息学分析DPV UL55基因由561bp核苷酸组成,包括一个完整的开放性阅读框,编码一个由186个氨基酸组成的20.7981kDa蛋白质。UL55蛋白没有信号肽及跨膜区。密码子分析显示UL55基因偏向A/T结尾的密码子,密码子使用模式与人类最接近。UL55蛋白整体表现出亲水性,抗原表位主要集中在相应亲水区域的无规则卷曲,其功能与病毒的装配、出芽、成熟和释放相关。基于核苷酸序列的进化树分析显示DPV属于马立克氏病毒基因属的一员。3鸭瘟病毒UL55基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备通过将UL55基因通过克隆到表达载体pET32a(+)上实现对UL55蛋白的原核表达,试验表明重组UL55基因能在大肠杆菌BL21(DE)中进行融合表达。通过优化诱导表达条件,UL55重组蛋白能在37℃条件下,通过0.8mmM的IPTG诱导表达4h产生大量非可溶形式的包涵体蛋白。将包涵体蛋白通过裂解后进行纯化及复性处理再与兔抗DPV CHv多克隆抗体进行免疫印迹反应,结果表明纯化复性后的UL55蛋白具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。复性后的UL55蛋白免疫兔子制备的高免血清能够与UL55重组蛋白发生良好的免疫反应。4原核表达UL55蛋白作为抗原检测DPV血清的间接ELISA方法的建立本方法是基于纯化的重组UL55原核表达蛋白建立的可以检测DP血清的间接ELISA法,该方法特异性强,对抗鸭病毒性肝炎病毒(DHV)、鸭疫里默氏菌(RA)、鸭大肠杆菌(E.coli)、鸭源沙门氏菌(Salmonella)、肿头性出血症病毒和鸭源流感病毒的阳性血清进行检测,结果均为阴性；该方法的对酶标板内或板间重复试验显示变异系数均小于10%,能检出经1：6400倍稀释的DPV弱毒疫苗免疫鸭的阳性血清。将其与经典的中和试验及DPV全病毒包被的ELISA同时检测50份感染了DPV的临床鸭血清样本,发现其对DPV IgG的检出率介于中和试验和DPV-ELISA之间。由于其制备方法简便、操作简单,特异性、灵敏性较高。且不存在散毒的风险,具有良好的应用前景,为进一步组装成试剂盒奠定了基础。5鸭瘟病毒UL55基因转录、表达时相分析以β-actin基因作为内参基因,用相对荧光定量方法对UL55基因在体外感染宿主细胞中的转录情况进行了分析。转录时相分析结果表明UL55基因在转录后的0-8h内处于一个较低的水平；12h后开始迅速增加直至在感染后36h达到转录峰值,之后开始逐步下降,直到感染后的60h仍然可以检测到大量转录的UL55基因,UL55基因的转录过程可以被核酸抑制剂更昔洛韦抑制,说明UL55基因是严格依赖于DNA合成的γ2基因。Western-blot分析体外感染宿主细胞中UL55基因的表达时相表明UL55蛋白的表达水平也表现出相似的规律,进一步佐证了UL55基因为γ2基因的结论。6细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台构建通过多步克隆构建了含TK基因同源臂、报告基因EGFP和细菌人工染色体核心功能元件的重组鸭瘟病毒转移载体pUC18/EGFP-TKAB-BAC11,将其与DPV CHv病毒核酸共转染获得了重组病毒DPV CHv-BAC-G。利用EGFP报告基因的指示作用,通过8轮噬斑纯化获得了纯化的重组病毒。提取环化时期的重组病毒DPV CHv-BAC-G,电击转化至DH10B细胞中,获得了能够在细菌中复制的重组病毒转化子。将克隆化的病毒质粒pBAC-DPV转染至宿主细胞DEF,成功拯救出重组病毒DPV CHv-BAC-G。拯救出的重组病毒可以以细菌和病毒两种形式存在,能够实现在细菌和宿主细胞内的同时复制,有利于利用原核系统成熟的基因操作手段研究原本仅能在细胞水平研究的鸭瘟病毒,成功建立细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台。7重组鸭瘟病毒UL55基因缺失株的构建及其体外生物学特性研究在构建的细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台基础上,利用大肠杆菌细胞内的两步RED重组技术构建UL55基因缺失株及其回复突变株。构建的回复突变株克隆能够通过转染DEF细胞获得拯救产生与亲本相同的致细胞病变,酶切图谱与亲本株DPV CHv-BAC-G无差异,是为真正的回复突变株。空斑试验、一步生长曲线和致病性比较结果表明,构建的UL55缺失株和回复突变株与预期结果一致,能产生与亲本株DPV CHv-BAC-G相似细胞病变效应、形成形态及大小相似的空斑、在感染细胞中展现出相同的增殖周期。8 DPV UL55基因在感染宿主细胞体内的定位分析以制备的兔抗UL55多克隆抗体作为一抗,用间接免疫荧光的方法检测UL55基因编码蛋白在感染细胞内的动态分布。结果显示,UL55蛋白最早在感染后的5.5h内开始在细胞质大量表达,并随着时间的推移表达量逐渐增多,其表达量在感染后的22.5h达到峰值。之后UL55蛋白的表达量逐步下降,并从细胞质内的散在分布颗粒逐渐形成荧光斑向核膜周边转移,大量存在于核膜两极。之后随着时间的推移,UL55蛋白的荧光逐渐消失,推测其随着病毒复制周期的结束和细胞的崩解而消失。9 DPV UL55与UL26.5基因在感染宿主细胞体内的定位分析UL55蛋白和UL26.5蛋白在细胞内的共定位结果显示,UL26.5和UL55蛋白在感染细胞内邻接并部分重迭,但当DPV不表达UL55蛋白时,UL26.5蛋白的定位没有变化,表明UL55基因的缺失并不影响UL26.5在核内的定位和其功能的发挥,预示着UL26.5蛋白形成的核衣壳的装配由包括UL55在内的多个蛋白完成,UL55蛋白参与病毒的装配,但并不是必需。
何琴[3]2012年在《鸭瘟病毒UL16基因的原核表达及其功能研究》文中研究指明论文对本实验室鉴定的鸭瘟病毒(duck plague virus, DPV)UL16基因(GenBank登录号EU195095)做了如下研究：DPVUL16基因特性预测与分析、克隆和原核表达、兔抗DPVUL16多克隆抗体制备、DPV感染DEFs后UL16基因的转录时相和表达时相分析、UL16蛋白在DEFs中的细胞定位分析、以重组DPVUL16蛋白作为包被抗原间接ELISA检测DPV抗体方法建立。结果如下：1. DPVUL16基因特性预测UL16基因包含一个1089bp大小的完整开放阅读框(ORF)。氨基酸序列与GenBank中提交的16株其它α疱疹病毒的UL16氨基酸序列多序列比对发现,DPVUL16蛋白与MeHV-1、GaHV-2及GaHV-3禽类疱疹病毒的UL16蛋白的亲缘关系最近。DPV UL16蛋白在疱疹病毒科中有1个高度保守的结构域Herpes_UL16superfamily,为典型的疱疹病毒皮层蛋白。无信号肽和跨膜区结构,有2个潜在的糖基化位点,16个潜在的磷酸化修饰位点。DPVUL16氨基酸序列的无规则卷曲和转角的亲水区有12个潜在的抗原位点。主要分布在细胞的线粒体、胞浆中。对UL16基因密码子的偏嗜性分析显示其偏嗜性不强,同义密码子中使用频率较高是以A、T碱基结尾。与大肠杆菌、酵母和人的密码子偏嗜性比较分析发现,DPVUL16基因与原核生物和真核生物的密码子偏嗜性都较接近,预计较容易选择表达系统。2.DPV UL16基因克隆、原核表达及多克隆抗体的制备根据UL16基因序列,设计PCR引物,扩增包括UL16完整ORF在内的1098bp的核酸片段,把此片段插入克隆载体pMD18-T,构建重组质粒pMD18-T-UL16。 pMD18-T-UL16重组质粒用Hind Ⅲ和Xho I双酶切,凝胶电泳回收目的片段,再将目的片段与同样双酶切的原核表达载体pET-32b(+)连接,构建重组原核表达质粒pET-32b(+)-UL16。阳性重组原核表达质粒pET-32b(+)-UL16转化入Rossetta(DE3)表达菌。IPTG诱导表达,约为60kDa的融和UL16蛋白成功表达。纯化复性重组蛋白,并免疫新西兰大白兔,制备兔抗DPVUL16多克隆抗体。制备的血清进行琼脂扩散实验,测得效价为1：8,Western-blot显示制备的血清亦能与表达的重组蛋白特异性识别。3.DPV体外感染DEFs后UL16基因mRNA转录时相和表达分析采用实时荧光染料定量PCR法对DPV UL16基因mRNA在DEFs中的转录时相分析,DPV感染后0-18h转录水平较低,18h后能检测到的UL16mRNA逐渐增多,36h达到高峰,48h后又逐渐下降。同时采用DNA合成抑制试验研究UL16基因的转录,DPV感染DEFs后,在维持液中加入DNA合成抑制剂阿昔洛韦(ACV),36h后检测UL16基因的转录,结果显示UL16基因未转录,表明UL16基因的转录依赖病毒DNA复制。采用Western-blot法对DPV UL16基因表达时相分析,DPV感染后早期UL16表达量极少,48h时UL16蛋白的表达量达到高峰。由此可以推断DPVUL16基因为一晚期基因,编码DPV结构蛋白,可能参与病毒粒子的的包装与成熟。4. DPV体外感染DEFs后UL16基因产物的亚细胞定位分析兔抗DPV UL16多克隆抗体为一抗,间接免疫荧光法检测DPV感染DEFs后UL16蛋白在DEFs中的亚细胞定位。结果显示感染后的18h,在靠近胞核的胞浆周围可观察到少量的特异性荧光,随着感染时间推移,在胞浆中可观察到大量的特异性黄绿色荧光,呈不连续的颗粒状分布。随着感染时间的增加到晚期,细胞溶解凋亡,能观测到特异性荧光渐少。由此推断UL16蛋白合成后可能大量分布于胞浆中的细胞器,如高尔基体,参与病毒粒子后期的装配成熟。5. DPVUL16蛋白间接ELISA检测刂DPV抗体方法的建立以重组DPVUL16蛋白为包被抗原,建立检测DPV抗体的间接ELISA法。对反应条件进行优化,融合蛋白的最佳包被浓度为1.25μg/mL,血清的最佳稀释度为1：160,酶标二抗的最适稀释度为1：10000,阴阳性临界值为0.598,批内和批间的变异系数都小于10%,与鸭DHBV, DHV, RA, E.coli, S.anatum, H5N1和DSHDV阳性血清均无交叉反应。用建立的该方法与经典的血清中和试验检测临床疑似鸭血清,结果显示符合率为95.5%。表明建立的间接ELISA方法具有快速、特异、敏感、可重复性,可用于检测DPV及流行病学调查。
赵丹丹[4]2015年在《鸭瘟病毒gB蛋白单克隆抗体的制备及胶体金试纸条检测方法的建立和应用》文中认为鸭瘟是由鸭瘟病毒引起的一种急性、败血性传染病,以头颈肿胀、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黄白色溃疡,头颈部皮下有黄白色胶冻样渗出为特征。该病一旦发生,发病急、死亡快、死亡率高,对养鸭业危害严重。免疫预防是控制鸭瘟的重要措施,但近年来不断出现鸭瘟疫苗免疫效果不佳的情况,鸭瘟病毒是否发生变异,找出其中的原因至关重要。快速诊断是控制鸭瘟的重要措施之一,目前已建立了PCR、ELISA、间接免疫荧光技术、微量中和试验等检测鸭瘟的方法,但是这几种检测方法均需特殊的仪器设备,且耗时长,不适于在基层推广应用。因此,建立一种更加快速、灵敏的病毒检测方法迫在眉睫。胶体金免疫层析技术是近年来发展起来的集胶体金标记技术、蛋白层析技术于一体的新型快速免疫检测技术。该技术操作简便、耗时短,不需要特殊的仪器设备,特别适合在基层推广应用。单克隆抗体具有性质均一稳定、特异性高等特点,可以作为病毒诊断方法的一个良好的工具。作为鸭瘟病毒的高度保守性蛋白之一,gB蛋白的免疫原性良好,高度的特异性和保守性决定了该蛋白能够为建立新的检测方法提供良好的材料。本研究通过对近几年来从各地采集的鸭瘟病料,扩增DPV主要基因gB gC基因并进行测序比对分析,从分子水平上研究鸭瘟病毒变异情况。制备针对鸭瘟病毒gB蛋白的单克隆抗体,并利用制备的单抗,建立了胶体金试纸条检测方法。本研究设计鸭瘟病毒gB gC基因的特异性引物,将近几年来各地送检疑似鸭瘟病料处理后,采用鸭胚尿囊膜接种法分离鸭瘟病毒,提取病毒DNA作为模板。PCR扩增目的基因,连接于载体pMD-18T上,将PCR鉴定为阳性的菌液测序,与NCBI上已发表的鸭瘟强毒株2085(序列号:JF999965)及鸭瘟弱毒疫苗株VAC(序列号:EU082088)序列进行比对,同时比对不同毒株之间的同源性。结果显示,测序的9株鸭瘟病毒的同源性在99%~100%之间,表明鸭瘟病毒主要基因未发生变异。利用生物学软件Protean分析,选择鸭瘟病毒抗原表位较多的一段序列设计引物,PCR扩增目的基因。连接到载体pMD-18T上,测序正确后再连接到原核表达载体pET-28a上。将获得的重组质粒转化至Rosetta感受态细胞中进行诱导表达。表达的蛋白经纯化后测其浓度并经western blot鉴定分析。以表达的DPV-gB蛋白作为抗原,免疫7周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选及亚克隆,共获得4株能稳定分泌抗DPV-gB蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为A8D7、E6C3、H11F8、H6F6。间接ELISA检测腹水效价分别为1:103、1:103、1:105、1:103。亚类鉴定结果分别为IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,轻链均为kappa链。Western blot结果显示4株单抗均能与DPV-gB蛋白特异性结合。IFA结果显示制备的4株单抗是针对DPV产生的。在获得DPV-gB特异性单克隆抗体的基础上,采用柠檬酸叁钠还原法制备胶体金颗粒,以制备的H6F6单抗作为标记抗体(标记的最适pH值为8.0~8.5,最佳标记浓度为15倍原液稀释),将纯化的A8D7单抗(浓度为2倍原液稀释)和羊抗鼠IgG(浓度为10倍稀释)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线和质控线,经条件优化建立了鸭瘟病毒胶体金试纸条检测方法。检测结果显示:该试纸条能够特异地检测鸭瘟病毒,与DRV、EDS-76V、AIV-H9N2、TMUV均无交叉反应;阳性尿囊液稀释50倍后用该试纸条检测依然为阳性;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异;利用制备的胶体金试纸条和PCR方法对38份临床样品进行检测比较,结果显示两者符合率为91.6%。所制备的试纸条具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,便于DPV的快速诊断和检测。
孙涛[5]2008年在《鸭瘟病毒UL-6基因主要抗原域的原核表达和应用》文中提出此文对本研究小组发现的鸭瘟病毒(DPV)UL6基因(GenBank登录号EF055890)开展了以下系列研究:DPV UL6基因密码子偏爱性分析及多肽抗原表位预测,主要抗原域的克隆、原核表达和抗体制备,利用表达蛋白建立检测DPV抗体的间接ELISA方法,应用表达蛋白制备亚单位疫苗进行攻毒保护试验,基于UL6抗原域蛋白的间接免疫荧光和间接免疫组化检测石蜡切片中DPV方法的建立、UL6基因产物在DPV强毒人工感染鸭组织中的表达动态及定位监测等,结果如下:1.采用软件DNAStar Protean程序,综合运用二级结构、亲水性、可塑性和抗原性指数等参数,对DPV CHv毒株UL6基因(GenBank登录号EF055890)的氨基酸序列进行B细胞表位预测,分析结果显示在位于UL6蛋白羧基端第Thr507-Gln515、Thr521-Met529、Asp531-Phe539、Gly544-Asn562、Thr568-Gln585、Lys592-Val604、Ala681-Ala778和Tyr780-Lys790区域内含有主要抗原决定簇。将UL6编码蛋白密码子偏爱性特征与大肠杆菌、酵母及人的密码子偏爱性相比较,为选择合适的表达系统提供参考。2.以DPV CHv毒株基因组作为PCR反应模板,利用Oligo6.0软件设计一对引物,整体扩增涵盖具有优势表位的基因片段(1483-2385bp),进行原核表达。以兔抗DEV多克隆血清进行Western blotting,检测显示抗血清可与该融合蛋白发生特异性反应。利用重组表达蛋白所带的6×His标签用镍柱亲和层析两种方法对其进行纯化,获得较高纯度的重组蛋白。过柱纯化蛋白分别对家兔进行免疫,制备兔高免血清,ELISA效价高达1:512000。3.以纯化的鸭瘟病毒UL6M蛋白为抗原,建立了用于检测鸭血清中抗DPV特异性IgG抗体的间接ELISA方法。并对其进行了标准化研究,确定了最佳工作条件。结果显示,抗原包被浓度为3.125ug/孔的包被反应板可获得良好的敏感性,与DEV标准阳性血清呈阳性反应,而与鸭乙型肝炎病毒(Duck hepatitis B virus,DHBV)、鸭病毒性肝炎(Duck virus hepatitis,DHV)、鸭传染性浆膜炎(Riemerella anatipestiferinfectious,RA)、鸭大肠杆菌(E.coli)、鸭沙门氏菌(Salmonella bacillus,SB)5种疾病阳性血清均无交叉反应。批间、批内试验变异系数不超过10%。这一结果表明该法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于鸭瘟病毒感染鸭的血清抗体检测4.应用基因工程技术获得的UL6主要抗原域蛋白制备亚单位疫苗,攻毒保护试验显示:重组亚单位疫苗免疫雏鸭,免疫后7d左右能刺激机体开始出现抗体,14d抗体效价达到最高(OD为2.535),能够显着高于对照组(P≤0.05),与弱毒疫苗免疫组比较,效价的消长时间与弱毒免疫组变化相似,在56d体内均维持较高水平。重组蛋白组发病率、死亡率分别为50%(5/10)、40%(4/10)明显低于对照组的100%(10/10)、100%(10/10),表明UL6主要抗原域重组蛋白在雏鸭体内具有良好的免疫原性,但保护效率较弱毒疫苗组略差。5.检测鸭瘟病毒UL6基因产物在人工感染雏鸭组织中的表达动态与定位分布表明:感染鸭瘟病毒强毒4h,法氏囊、胸腺等免疫器官即可见UL6衣壳蛋白的表达。随后,十二指肠、空肠、回肠、直肠等消化道组织靶细胞可见UL6衣壳蛋白持续稳定地表达,3d后直至死亡鸭体内各组织器官均可检测到UL6表达蛋白的存在。由此推测DPV UL6蛋白为晚期基因中率先表达的一类,并持续参与病毒DNA复制全过程。
张坤[6]2012年在《鸭瘟病毒SDWF株的分离鉴定及致病性研究》文中提出鸭瘟(DuckPlague，DP)，是由鸭瘟病毒(Duckplaguevirus，DPV)引起的鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性接触性传染病，其特征是流行广泛、传播迅速、发病率和死亡率高，严重威胁养鸭业的发展。鸭瘟于1923年由Baudet首次在荷兰报道，之后在许多国家均有流行。1957年黄引贤在我国广州报道了本病。至今，全国各养鸭地区均有本病流行的报道，为了更有效的防治DPV，有必要发展简单、快速的检测方法和良好的病原检测及定位手段，并对其致病机理进行深入研究。本研究内容包括四部分：一、鸭瘟病毒SDWF株的分离鉴定通过鸭胚尿囊膜接种，从疑似鸭瘟病例中分离到1株病毒，采用血清中和试验、动物回归试验和PCR方法对分离毒株进行了鉴定，并对毒株的生物学特性进行了研究。致病性试验结果表明，分离毒株人工感染SPF鸭的症状及剖检变化与自然感染病例相同；分离株无血凝活性；鸭胚半数致死量ELD50为10-4.33/0.2mL；对氯仿、乙醚敏感；不耐酸碱、不耐热。分离毒株PCR鉴定结果显示，PCR产物与预期大小一致，其产物序列与鸭瘟病毒标准强毒株相应片段核苷酸的同源性为99.9%。上述结果表明，分离毒株为DPV，且为强毒株，命名为SDWF株。二、鸭瘟病毒环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法的建立与应用为建立一种简便、快速、灵敏、特异的DPV检测方法，本研究根据GenBank中登录的DPV基因组序列，设计3对特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物，经优化反应体系，建立了LAMP快速检测方法。结果表明，LAMP方法能够在63℃恒温下，1h内实现目的核酸的大量扩增。结果判定时只需要在扩增产物中加入SYBRGreenⅠ染料，就可以直接在可见光或紫外光下观察颜色变化。该方法敏感性可达0.245pg/μL，比普通PCR灵敏性高10倍；对Ι型鸭肝炎病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸭新城疫病毒、鸭源偏肺病毒等的核酸无交叉反应；利用建立的LAMP检测方法对40份临床样品的阳性检出率为30%。该方法简便快捷，省时省力，是一种适用于基层实验室快速、准确检测DPV的方法。叁、鸭瘟病毒强毒株感染SPF鸭动态病理组织学研究将纯化的DPV人工感染2月龄SPF鸭，定期剖杀试验组和对照组鸭，对各组织器官的病理组织学变化进行观察，并进行血常规和血液生化指标检测。结果显示：人工感染后24h，感染SPF鸭中枢免疫器官胸腺、法氏囊淋巴细胞数量减少，组织间隙增大；肝脏、脾脏组织病变较为严重，其余组织器官均出现程度较轻的病理变化。感染后48～96h，中枢免疫器官的淋巴细胞极度减少，网状细胞增生，组织器官结构模糊不清，严重充血、出血；其余组织器官出现细胞变性、出血等病理变化。感染后120h，组织细胞变性、坏死，出现大片坏死区。点眼滴鼻组SPF鸭感染DPV后组织学变化与皮下注射组相似，只是发生的时间推后约24～48h。对照组SPF鸭病理组织学观察未见损伤。WBC、HGB、AST、ALT等发生显着变化。该结果表明，接种DPV强毒感染SPF鸭的组织器官严重受损，特别是免疫器官，甚至会引起免疫抑制。四、间接免疫荧光染色（IFA）检测鸭瘟病毒及在鸭体内的抗原定位将纯化的DPV免疫清洁级新西兰白兔，高免血清经辛酸-硫酸铵法和葡聚糖G200柱纯化，制得第一抗体。以FITC标记的山羊抗兔IgG为第二抗体，通过反应条件的优化，建立了DPV间接免疫荧光（IFA）快速诊断方法。试验结果表明：一抗的最佳稀释度为1:100，感作时间为4℃过夜；二抗的最佳工作浓度为1:200，感作时间为37℃1h，DPV特异性黄绿色荧光最清晰。以IFA对DPV人工感染鸭的各组织器官进行检测，在死亡鸭的脾脏、胸腺、法氏囊、肝脏、食道、泄殖腔、肠道、肾脏、肺脏及气管中均检测到DPV抗原，以肝脏、脾脏等组织中荧光最强。表明这些器官是DPV感染后的主要靶器官。
赵丹丹, 刁有祥, 杨国平, 陈浩, 提金凤[7]2016年在《鸭瘟病毒gB蛋白单克隆抗体的制备》文中研究表明【目的】制备鸭瘟病毒(DPV)gB蛋白单克隆抗体,为建立DPV快速诊断方法及进一步鉴定DPV的抗原表位奠定基础。【方法】克隆DPVgB基因,构建其表达载体并进行原核表达,纯化DPV gB蛋白,以其作为抗原免疫8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,进行间接ELISA及亚克隆筛选,并对单抗亚类及抗原性进行鉴定。【结果】PCR扩增出915bp的目的基因,成功连接于pET-28a载体,并转化大肠杆菌Rosetta进行诱导表达,获得4株稳定分泌抗DPV gB蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为A8D7、E6C3、H11F8、H6F6,间接ELISA检测其腹水效价分别为1∶103、1∶103、1∶105、1∶103,亚类鉴定结果分别为IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,轻链均为kappa链。Western blot结果显示4株单抗均能与DPV gB蛋白特异性结合,IFA结果表明4株单抗是针对DPV产生的。【结论】成功获得了特异性针对DPV gB蛋白的单克隆抗体。
练蓓[8]2011年在《鸭瘟病毒gC基因部分特征分析及gC基因疫苗诱导鸭免疫发生的研究》文中研究表明论文对本实验室注册的DPV gC基因(GenBank登录号EU076811)开展下列研究：病毒体外感染宿主鸭胚成纤维细胞gC基因的转录和表达时相分析及亚细胞定位检测；DPVgC基因疫苗诱导实验鸭细胞免疫和体液免疫的研究。获得以下结果：鸭瘟病毒感染鸭胚成纤维细胞gC基因的转录时相分析应用荧光定量PCR方法对DPV感染鸭胚成纤维细胞(DEF)后病毒gC基因mRNA表达水平的变化进行了动态检测,结果表明,最早可在DPV感染宿主细胞后1h检测到该基因转录产物,随着感染时间的延长,转录产物量逐渐增加,并于感染后28-36h达到转录峰值,随后转录产物量逐渐下降,但在72h仍保持较高水平。根据转录谱推测DPVgC基因可能属晚期基因。鸭瘟病毒感染鸭胚成纤维细胞gC基因的表达时相分析应用Western Blot方法对DPV感染DEF后病毒gC蛋白的表达水平变化进行了动态检测。在感染后4-72h的细胞蛋白提取物中均可观察到与DPV gC蛋白预测大小相一致的条带。4h时,在约45kDa的位置目的条带隐约可见,从16h起逐渐变大变清晰，48h左右达到最大值。综合分析DPVgC基因的转录表达时相模式,其在感染晚期得到大量表达,推测该基因为病毒的晚期基因。鸭瘟病毒gC基因产物在鸭胚成纤维细胞中的亚细胞定位应用间接免疫荧光对DPV感染DEF中gC基因的表达进行亚细胞定位检测,结果表明,特异性荧光最早可在感染后4h检测到,这时细胞质内荧光的量相对较少,随感染时间延长,荧光强度逐渐增强,且大量聚集在细胞质的近核区域,随后荧光强度减弱,在感染60h后基本消失。根据gC基因表达产物的这种分布特征,可初步推测为病毒基因组中的gC基因在宿主DEF的细胞质中完成gC蛋白的合成,合成的gC蛋白参与后期病毒的组装和成熟过程。鸭瘟病毒gC基因疫苗诱导实验鸭细胞免疫的研究鸭瘟病毒gC基因疫苗(pcDNA-DPV-gC)以不同途径和不同剂量免疫实验鸭,以生理盐水、空载质粒pcDNA3.1 (+)和鸭瘟弱毒疫苗为对照,采用淋巴细胞增殖试验(MTT法)和流式细胞仪(FACS)分析法,分别对鸭外周血中T淋巴细胞的转化功能、CD4+和CD8+T淋巴细胞数进行了检测。结果表明,pcDNA-DPV-gC基因疫苗接种实验鸭后外周血T淋巴细胞对ConA的反应性有明显增强,CD4+和CD8+T淋巴细胞数也显着高于对照组,在免疫后第3d,基因疫苗免疫组与对照组比较差异显着(P<0.05),且在免疫后5d-7d达到最大值。比较不同免疫途径,基因枪途径诱导鸭外周血T淋巴细胞增殖、CD4+和CD8+T淋巴细胞免疫应答优于肌肉注射途径；比较不同免疫剂量,基因枪和肌肉注射途径均存在一定的剂量相关性,以基因枪6μg和肌肉注射200μg诱导细胞免疫应答的能力较强。鸭瘟病毒gC基因疫苗诱导实验鸭体液免疫的研究采用间接ELISA和中和试验分别对实验鸭血清中特异性血清IgG抗体和中和抗体动态变化进行了检测。结果表明,不同途径基因疫苗接种实验鸭后均能诱导产生DPV特异性血清抗体和中和抗体,基因枪和肌肉注射各组间无明显差异,而弱毒对照组在各采样时间点均较基因枪和肌肉注射各组高。以上结果表明,制备的pcDNA-DPV-gC基因疫苗免疫鸭后能够诱导机体产生良好的体液和细胞免疫应答,基因枪免疫较肌肉注射更能诱导细胞免疫应答的产生。与弱毒疫苗相比,pcDNA-DPV-gC基因疫苗诱导细胞免疫应答的能力优于DPV弱毒疫苗,而DPV弱毒疫苗诱导体液免疫的能力更强。
参考文献：
[1]. 间接ELISA检测新型鸭瘟抗体和IFA检测新型鸭瘟病毒的研究[D]. 郑福英. 山东农业大学. 2004
[2]. 鸭瘟病毒中国强毒株基因组解析及UL55基因功能初步研究[D]. 吴英. 四川农业大学. 2015
[3]. 鸭瘟病毒UL16基因的原核表达及其功能研究[D]. 何琴. 四川农业大学. 2012
[4]. 鸭瘟病毒gB蛋白单克隆抗体的制备及胶体金试纸条检测方法的建立和应用[D]. 赵丹丹. 山东农业大学. 2015
[5]. 鸭瘟病毒UL-6基因主要抗原域的原核表达和应用[D]. 孙涛. 四川农业大学. 2008
[6]. 鸭瘟病毒SDWF株的分离鉴定及致病性研究[D]. 张坤. 山东农业大学. 2012
[7]. 鸭瘟病毒gB蛋白单克隆抗体的制备[J]. 赵丹丹, 刁有祥, 杨国平, 陈浩, 提金凤. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2016
[8]. 鸭瘟病毒gC基因部分特征分析及gC基因疫苗诱导鸭免疫发生的研究[D]. 练蓓. 四川农业大学. 2011
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