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摘要：目的：建立MALLS-HPGPC联用检查右旋糖酐40的分子量与分子量分布的方法。方法：用TSK Gel G4000PWXL（7.8 mm×300 mm）色谱柱，DAWN DSP-F激光光散射检测器、RI2414型示差折光检测仪，流动相0.71%Na2SO4溶液（内含0.02%的叠氮化钠），测定右旋糖酐40的分子量及分子量分布。结果：本方法测定的右旋糖酐40的分子量，平均回收率为99.95%，RSD为0.36%（n=9）。结论：MALLS-HPGPC联用测定右旋糖酐40的分子量与分子量分布，操作简便、快捷、结果准确重现性好，可作为右旋糖酐40的分子量与分子量分布检查的常规分析方法。
关键词：MALLS-HPGPC法；右旋糖酐40；分子量与分子量分布；激光光散射检测器
右旋糖酐40又名低分子右旋糖酐，是高分子葡萄糖聚合物，平均分子量40000，为血容量扩张剂，其分子量与人血白蛋白相近，注射后能提高血浆胶体渗透压，吸收血管外的水分而补充血容量，维持血压，使已经聚集的红细胞和血小板解聚，降低血液黏滞性，从而改善微循环，防止血栓形成。此外尚具渗透性利尿作用。主用于各种休克及血栓性疾病。也可用于肢体再植和血管外科手术，预防术后血栓形成。其临床疗效及过敏反应的发生与分子量高低及分子量分布密切相关，所以快速准确地测定其分子量及分子量分布成为研究和控制本品质量的关键[1][2]。
分子量与分子量分布测定方法有：光散射法、凝胶色谱法、粘度法、超离心沉降法、冰点下降法等。在中国药典2015年版中，右旋糖酐40的分子量与分子量分布检查采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC；High Performance Gel Permination Chromato-graphy），但本方法步骤繁多，工作量大，检测样品耗时长。而多角度激光散射检测器（Multiple Angle Laser Light Soattering；MALLS）与HPGPC（MALLS/HPGPC）联用检测多糖的分子量与分子量分布，实验操作简单，数据处理系统完全自动化，并即刻给出结果。分析时间短，可提高工作效率，又可防止色谱柱的老化。我们参照相关文献建立HPGPC/MALLS联用检测右旋糖酐40的分子量与分子量分布[2][3][4][5]。
1 分析原理（HPGPC/MALLS联用理论）[3]
一定波长的激发光照射一定浓度的溶液时，对于溶液来说，散射光的强度对散射角和溶液浓度的依赖性与溶质的分子量、分子尺寸和形态有关。一般对于稀溶液，根据光的电磁波理论并考虑散射光的内干涉效应，可得到：
其中：n为阿佛加德罗（Avogadro）常数；λ为入射光在溶液中波长；λA=λ/n；n为溶剂折光指数；dn/dc为溶液的折光指数增量（溶液折射率与浓度变化的比值）；C 为被测样品的浓度（g.mol-1）；Rθ为剩余瑞利因子（excess rayleigh factor）是单个角度的散射光（大于溶剂的散射光数量）除以入射光强度所得的分数；M 为被测样品的分子量；P（θ）为散射因子，用于表征散射光的不对称性，它是粒子尺寸和散射角的函数；A2 是第二维里常数（表示溶质和溶剂之间的相互作用）。
光散射强度与分子的大小及分子量有直接的关系，而GPC能分离不同尺寸及分子量的分子。MALLS利用色谱柱分离出的样品在不同角度的散射量，由示差折光检测器（differential refractive Index detector，RI）得到的洗脱液浓度及dn/dc值，即可得到各个切片的分子量。此方法不需要标准品及标准曲线，不但可以直接测得大分子的绝对分子量MW（重均）Mn（数均）Mz（Z均）及均方根旋转半径Rw（重均）Rn（数均）Rz（Z均）等数据，还可获得聚合物的分布、分枝率及分子的形状等信息。
图1 MALL S-HPGPC联机检测装置图
2 仪器与试药
2.1仪器
美国Waters HPLC高效液相色谱仪：Waters 510A型高压泵、7725i手动进样器、RI2414型示差折光检测器；美国怀雅特技术公司（Wyatt Technology Corporation）：DAWN DSP-F激光光散射检测器、Optilab rEX型DNDC仪、ASTRA色谱工作站。
2.2试药
右旋糖酐分子量标准对照品（Dextran Standard）D7（M84400），D6（M41100），D5（M21400）：中国药品生物制品检定所；硫酸钠：Sigma公司；叠氮化钠（NaN3）：进口超纯试剂；右旋糖酐40原料：山东金洋药业；注射用水：自制。
3 方法与结果
3.1 色谱条件
日本TOSOH公司的测多糖专用凝胶柱（Tsk gel G4000 Pwxl柱，7.8mm×300mm及保护柱Tsk gel Guard column Pwxl）；流动相为0.71%Na2SO4溶液（内含0.02%的叠氮化钠）；柱温35℃；流速为0.5mL.min-1；进样量20μL。
3.2 试验参数的测定
激光散射检测器（DAWN calibration constant）：取高纯度甲苯注入激光散射检测池，按ASTRA软件程序操作，在主菜单下选择Calibration，测得结果为：4.1640e-04。
示差折光检测器（RI calibration constant）：取一系列浓度的氯化钠水溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg.ml-1）分别注入示差折光检测池，记录信号浓度响应曲线（V-C），得出标准曲线图，输入氯化钠水溶液的dn/dc值（0.174），用RICAL数据处量软件处理，得到结果为：5.1972e-04.
延迟体积（volume delays）：取适当浓度的牛血清蛋白样品注入HPGPC/MALLS系统，得到结果为：0.162。
标准化系数（Normalization coefficients）：因各检测角度对激光散射信号的响应存在差异，要求以900设定小分子的散射信号为基准，对其它角度信号进行校正，我们取分子量为41100的右旋糖酐对照品用流动相溶解并稀释成约10 mg.ml-1的溶液，在HPGPC/MALLS系统进样测定，选择主菜单Normalize命令，由HPGPC/MALLS系统软件自动计算各测量角度对于900测量角度的校正系数并存储结果。
被测样品的dn/dc值测定：取经干燥的右旋糖酐40原料用流动相溶解并稀释成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg.ml-1的一系列溶液，注入Optilab rEX型DNDC仪，测得dn/dc值为：0.1359±0.0032 Ml.g-1。
3.3 检查方法
取本品适量，加流动相稀释成每1ml约含10mg的溶液，振摇，室温放置过夜，作为供试品溶液。以0.71％硫酸钠溶液（内含0.02%叠氮化钠）为流动相；色谱柱：测多糖专用凝胶柱Tsk gel G4000 Pwxl，7.8mm×300mm、保护柱Tsk gel Guard column Pwxl；检测器：RI2414型示差折光检测器和DAWN DSP-F激光光散射检测器串联；柱温：35℃，流速：0.5ml.min-1。
取20μl供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。数据采用ASTRA软件处理。重均分子量应为32000～42000，10％大分子部分重均分子量不得大于120 000，10％小分子部分重均分子量不得小于5000。
从右旋糖酐40溶液示差、光散射信号图谱可看出：激光散射信号（90°）与示差检测器信号（AUX1）出峰时间及峰形均有一定差异，这主要是因为光散射检测器为分子量响应检测器，其信号强弱与被测物分子量大小及浓度成正比，而示差检测器为浓度型检测器，其信号强弱与被测样品浓度成正比。所以样品中分子量大而浓度低的部分光散射有响应，而示差无信号[1]。
从下图2右旋糖酐的光散射角的三维图可见，各散射光角度信号均一平滑，样品测定对各光散射信号无角度依赖性。
图4 Debye-plot图
3.4 检测限
示差响应信号与样品的浓度成正比，现以示差的响应信号作基准作检测限试验：取供试品溶液加流动相稀释至右旋糖酐40浓度为3mg.ml-1时，取20μl注入色谱仪，仍有较大的响应值（大于3倍基线噪声），完全可以满足分析要求。
3.5 耐用性
3.5.1 柱温、流速对分离的影响：
分别选用不同的柱温、流速试验：①30℃、0.6ml.min-1；②35℃、0.5 ml.min-1；③40℃、0.4 ml.min-1试验结果发现：柱温高、流速快时，分析时间缩短；流速慢、柱温低，保留时间延长，不适于大批量样品的分析；但流速太快，则柱压过高，对柱有损伤。综合试验结果，选用柱温35℃±1℃，流速0.5 ml.min-1，其分离度、柱效、峰形均优，且能延长柱使用寿命。
3.5.2 稳定性试验
取右旋糖酐40原料约1g，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，放置过夜后，分别在0、1、2、4、8、24小时，按右旋糖酐40分子量与分子量分布测定方法，取样20μl进行分析，记录检查结果，平均分子量、10%小分子部分、10%大分子部分分子量RSD%分别为0.97%、1.7%、0.9%。样品溶液较稳定，在正常分析时间内，对测试结果不构成影响。
3.6 精密度（重复性试验）
取同一份10mg.ml-1的右旋糖酐40溶液按右旋糖酐40分子量与分子量分布测定方法，重复测定6次，记录色谱图，从测定结果知，相对标准偏差均小于2%，表明重复性较好。
3.7 准确度
为考察本方法测定结果的准确性，试验中同时分别测定了右旋糖酐标准对照品，精密称取MW分别为21400、41100、84400的右旋糖酐标准品，加流动相溶解，制成约10mg.ml-1的溶液，分别量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。平均回收率为99.95%，相对标准偏差为0.36%，本方法准确度较高。
4 结果
从上试验结果可知：HPGPC/MALLS联用测定右旋糖酐40分子量与分子量分布，专属性强，耐用性、精密度、准确度均符合中国药典2005年版规定，方法简便、快捷，而且无须对色谱柱进行标定，除了能给出分子量与分子量分布结果，还能得到有关分子形状及均方旋转半径等其它信息，是一种高效、准确的测定方法。
5讨论
5.1色谱柱的选择
高效凝胶渗透色谱法中，被测高聚物的分子量分布范围应位于色谱柱的有效范围内，右旋糖酐40分子量为40000，所以选用分子量分离范围为5000～400000的Tsk gel G4000 Pwxl测多糖专用凝胶柱。
5.2流动相的选择
TSK-gel PW系列柱的填料是亲水的球性多孔高聚物。使用pH值范围是2-12，用于分离蛋白质、多肽、多糖、DNA、RNA、水溶性的有机聚合物和其他水溶性大分子样品等，为避免填料与样品间的离子相互作用，推荐采用0.5mol/LNaAc、0.30.5mol/L Na2SO4作为流动相。我们参照中国药典2005年版收载的右旋糖酐40分子量和分子量分布的检查方法，以0.71％Na2SO4溶液（内含0.02%叠氮化钠）为流动相。
5.3 数据处理软件
ASTRA软件可控制Watty DAWN DSP-F激光光散射检测仪的操作，在流动模式下，仪器可同时收集动态和经典光散射数据，其动态光散射信号可在18角度的任何一个角度获取，对每一切片（每3秒一次）的自相关函数进行处理，从而得到每一切片的分子量和旋转半径，程序里还包括一个传出/传入设备--把结果传出到ASCII程序，它可以以表格的形式处理数据，或传入到统计数学包，估计出溶液粘度和可达到的最大分子尺寸，从而得到分子的绝对分子量（包括数均、重均和Ｚ均分子量）和均方根旋转半径等分子尺寸信息以及它们的分布情况。
5.4 小结
MALLS-HPGPC法测定多糖的分子量与分子量分布，是八十年代以来产生的一种新技术，已在美国、日本及欧洲广为使用，我国在2000年左右开始引进此项技术，最早用于羟乙基淀粉的研究，但中国药典及国家公开的药品标准、欧洲药典、美国药典等均未收录此方法。新方法、新检测设备的使用，大大提高了目标检测项目的检测准确度和精密度，对代血浆同类产品的质量控制起到指导作用。
参考文献：
[1]王玉生 方丽等 右旋糖果酐40的临床合量应用 蚌埠医药 1995：13（1）：32。
[2]王其宇 HPGPC法在右旋糖酐原料药生产质控中的应用 安徽化工 2001：111（3）；45～46。
[3]右旋糖酐40 中华人民共和国药典2015年版二部 北京化学工业出版社。
[4]光散射与凝胶色谱仪联接与应用技术 Wyatt技术公司技术资料：1～10。
作者简介：柯云翠（1968--），性别：女，民族：汉族，籍贯：湖北，单位：杭州民生药业有限公司 职务：高级工程师，研究方向：液体制剂研究。
论文作者:柯云翠 杨玢,徐林儿
论文发表刊物:《健康世界》2016年第21期
论文发表时间:2016/11/28
标签：分子量论文; 右旋糖酐论文; 溶液论文; 检测器论文; 色谱论文; 浓度论文; 样品论文; 《健康世界》2016年第21期论文;