陈惠[1]2004年在《基因突变技术提高phyA植酸酶在毕赤酵母中表达量及热稳定性的研究》文中提出植酸酶作为单胃动物的饲料添加剂,其使用效果已在世界范围内得到了确证。但是,目前植酸酶在饲料中的推广和应用还相当有限,主要原因在于:(1)植酸酶基因工程菌的产酶量有待进一步提高;(2)植酸酶的热稳定性欠佳不能完全满足饲料加工、贮藏的要求。目前,蛋白质工程技术已成为修饰和改造天然酶的有效手段,为植酸酶产量的提高和热稳定性的改善开辟了新的途径。本研究在对本课题组已注册的植酸酶phyA基因核苷酸序列及氨基酸序列分析的基础上,通过对phyA基因进行同义突变、定点突变以及结构延伸突变,获得在毕赤酵母中高效表达并且热稳定性良好的植酸酶,其结果主要如下: 1、对来源于本课题组自主分离的黑曲霉N25(Aspergillus niger China Strain)的植酸酶基因phyA(GenBank:基因注册号为AF218813,蛋白质序列号为AAF25481)进行PCR介导的定点突变。在不改变其所编码氨基酸条件下,选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因保守序列中第81位和第85位的Arg密码子进行同义突变,构建了含正确突变的酵母表达载体pPIC9k-phyA~m。电击转化毕赤酵母GS115,经筛选培养基MM、MD平板筛选和产物的酶活性测定,筛选出突变的高酶活酵母转化子2株。这2株转化子的Southern blotting结果显示突变基因phyA~m以单交换方式单拷贝整合到酵母染色体DNA中;表达产物的SDS-PAGE分析表明,重组酵母中的植酸酶能有效分泌和表达,其酶蛋白分子大小为70.15kD;转化子酶活测定结果可知,经密码子优化的突变重组酵母的酶活力明显高于未进行优化的重组酵母转化子。密码子优化后的突变重组酵母株PP-NP~m-8于麦芽汁培养基中诱导36h后,酶活力可达47600 U·ml~(-1),比未优化重组酵母株PP-NP-2(23667 U·ml~(-1))提高了1.01倍,经十代传代实验汪实重组转化子遗传稳定性良好。 2、采用反向长距离PCR技术对上述重组酵母PP-NP~m-8的植酸酶突变基因phyA~m进行PCR介导的定点突变,即将植酸酶43位的苯丙氨酸替换为酪氨酸(F43Y),将其354,358位的异亮氨酸、亮氨酸分别替换为甲硫氨酸和苯丙氨酸(1354M,L358F),得到了两个突变体PP-NP~(m-1)(F43Y)及PP-NP~(m-2)(I354M,L358F)。含突变基因的重组表达载体pPIC9k-phyA~(m-1),pPIC9k-phyA~(m-2)在毕赤酵母GS115中表达,对表达产物
殷亮[2]2010年在《N-糖基化对Aspergillus niger 963植酸酶phyA2酶学性质的影响》文中研究说明糖基化(Glycosylation)是真核细胞蛋白质翻译后修饰的方式之一,对于蛋白质的结构和功能具有重要的影响。曲霉来源的植酸酶是一种重要的磷酸酯酶,属于组氨酸酸性磷酸酶家族(EC.3.1.3.2),具有典型的该家族植酸酶活性位点保守序列RHGARYP。研究表明,这类植酸酶都是糖蛋白,氨基酸序列中存在10个左右的糖基化位点(N-X-T／S),必须经过糖基化修饰才具有生物学功能,但这种修饰对于植酸酶蛋白的意义及其不同的糖基化位点在催化反应中扮演的角色目前尚不清楚。本研究中我们利用Megaprimer PCR介导的基因定点突变技术,构建了植酸酶phyA2基因两个N-糖基化突变体,来研究不同位点糖基化修饰的缺失对植酸酶蛋白的影响。主要研究结果如下：(1)以已克隆的黑曲霉Aspergillus niger 963的植酸酶phyA2基因为模板,利用Megaprimer PCR介导的定点突变技术在核酸水平上成功地实现了两个N糖基化位点的诱变,并构建了毕赤酵母表达载体pPIC9-N87Q和pPIC9-N102Q。转化酵母工程菌株GS115,在发酵罐水平上成功表达出了两个重组蛋白。对重组蛋白进行SDS-PAGE检测和Western-blotting免疫印记分析,发现突变体蛋白表观分子量降低了约10kD左右。(2)对野生型和突变体蛋白酶活性的最适温度及其热稳定性进行了研究,结果表明：野生型植酸酶phyA2、突变体N87Q和N102Q的最适温度都在50℃左右,而与野生型相比,突变体N87Q的酶活在45℃～50℃保持一个相对较高的水平。60℃处理1h后,N87Q剩余约50%的酶活性,与野生型(WT)相比稳定性降低了约20%。N102Q处理10min后,剩余约10%的酶活性,15min后完全丧失活性。70℃处理2min后,野生型WT和突变体N87Q剩余80%左右酶活,而N102Q活性则迅速降低到25%,其后它们的酶活基本保持不变。80℃处理2 min后,突变体和野生型酶活迅速降低到一个较低的水平,4min又升高约10%,其后基本保持在一个相对稳定水平。且N102Q随着处理温度的升高,稳定性反而增强。(3)对野生型和突变体蛋白最适pH和pH稳定性研究发现：突变体N87Q与野生型WT最适pH基本一致,在pH2.0和pH 6.0处出现两个峰,而N102Q峰值出现在pH2.5和pH 6.0,但pH2.5处的酶活力明显降低。pH稳定性研究表明：与野生型相比,N87Q稳定性变化不大,在整个pH范围内均保留了约70%的酶活,而N102Q在pH<3的环境下酶活损失约50%,而在pH>8的环境下完全失活。(4)金属离子、EDTA和SDS对突变体和野生型酶活的影响差异不大。其中1mmol/L的Fe2+、Fe3+、Ca2+、Co2+、Mn2+、K+和EDTA对酶具有显着地激活作用,而Mg2+、Zn2+ Cu2+对酶促反应具有极强的地抑制作用,Ag+轻微的抑制了酶促反应,而作为较强变性剂的SDS对酶活的影响反而不大。(5)突变体和野生型的比活,酶促反应动力学常数Km和Vmax基本没有差异。比活=100,000IU／mg左右,Km=0.435mmol/L, Vmax=3,547,357.218IU/mg.min。
彭远义[3]2004年在《植酸酶产生菌的选育及高表达工程菌的构建研究》文中指出植酸酶是一类能催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐的酶，它具有解除植物性饲料(或食品)中植酸的抗营养作用、提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率、促进生长发育、提高动物生产性能、减少粪便中磷的排放量、降低磷对环境的污染等多种功能，因而受到国内外的广泛关注。植酸酶主要存在于植物和微生物中，其中以微生物产生的植酸酶具有良好的开发前景，但微生物天然菌株产酶水平较低，加上天然植酸酶的某些性质不能完全适合饲料加工和养殖业的要求，从而限制了植酸酶在生产中的推广应用。通过植酸酶产生菌的筛选和基因克隆，并利用分子生物学技术构建基因工程菌，或在分子水平上改造植酸酶基因，以提高植酸酶产量或改变植酸酶酶学性质，从而降低生产成本，提高其使用有效性，己成为世界性的研究热点之一。 本研究的目的旨在通过从土壤中筛选酸性植酸酶高产菌株，并进一步通过诱变选育提高其产量，对高产突变菌株植酸酶基因进行克隆和分析，在此基础上，构建植酸酶高产基因工程菌，从而为植酸酶产品的工业化生产奠定基础。主要结果如下： 1 植酸酶高产菌株的筛选 利用植酸钙选择性子板培养基从土样中筛选出102株酸性植酸酶产生菌，从中挑选出透明圈较大的菌株32株，经分离纯化后分别进行摇瓶复筛，28℃、220r/min发酵5天后，在37℃、pH2.5或pH5.5条件下用钒钼酸铵法检测其酶活，结果发现有3株菌产酶活性较高且产酶性能较为稳定。其中编号为03214号的菌株在37℃、pH2.5时酶活性最高，达345U/mL发酵液；编号为041和0324号的菌株在37℃、pH5.5时酶活性最高，分别达285U/mL和250U/mL发酵液。根据产酶活性情况，选取03214号菌株作进一步鉴定和诱变选育的出发菌株。经初步鉴定，03214号菌为黑曲霉，编号为Aspergillus niger03214。 2 植酸酶高产菌株黑曲霉N14的诱变选育 以Aspergillus niger03214为出发菌株，通过紫外线诱变处理不同时间，经平板初筛和摇瓶复筛，获得一株产酶活性较高的突变株03214-3，酶活为373U/mL发酵液，比出发菌株提高了8％左右。以突变株03214-3为出发菌，经0.8mg/mL的亚硝基胍诱变处理不同时间，最终获得了产酶活性较原始菌株Aspergillus niger03214提高了22.3％，达422.3U/mL发酵液的突变菌株，编号为Aspergillus nigerN14。 将黑曲霉N14在PDA斜面上连续传7代，分别测定各代菌株酶活，结果其酶活稳定在410～430U/mL发酵液之间，说明突变株黑曲霉N14具有良好的遗传稳定性，可作为下一步基因工程研究的出发菌株。 3 黑曲霉N14基因组DNA的提取及植酸酶phyA基因的克隆，，画.‘，，妇..圈.翻‘通~ 以A，e啥1111”nigerN14为出发菌，采用改良氯化节法和斑迹抽提法提取基因组DNA，经紫外分光光度计测得DNA的ODZ曰心D翔均在1.80左右，表明这两种方法均适合提取黑曲霉基因组DNA。但在所用菌丝体重量相同的条件下，以氯化节法提取的pNA浓度较高。 根据曲霉菌属植酸酶基因具有高度同源性的特点，结合已报道植酸酶神州基因序列，自行设计一对特异性引物(上游引物:5，月队GGG叼℃八TGGGCG子巳n刃口，;下游引物:5，CAGC以六GCA阳心咙火CTCCGC3，)，采用乃仰七。t DNA聚合酶(高保真DNA聚合酶)，通过PCR方法从黑曲霉N14基因组DNA中扩增出了预期的约1.skb的特异性产物，将其与pMD18.T载体连接后，转化大肠杆菌Dll5Q，.经质粒抽提、五之口月111、tl双酶切鉴定和PcR鉴定，确认该目的基因已得到成功克隆。4黑曲霉N14植酸酶夕句以基因序列分析 DNA序列测定表明，本试验所克隆的目的基因片段含有植酸酶户州基因的完整序列(GeneBank AcceSSIOn:AY4269”)，夕句讨基因全长15仅无p，其中包含一段长102bp的内含子序列，编码467个氨基酸，5’端有拼编码19个氨基酸的信号肤序列。植酸酶活性位点序列CRvTEAQvLsRHGA即n红DsKCK位于氨基酸序列的+71~+93。黑曲霉N14植酸酶夕勺讨基因中G+仁含量达54.7%，密码子第叁位碱基的G+C含量高达67%。黑曲霉N14植酸酶助州基因与报道的产植酸酶活性最高的天然黑曲霉标准株N刊心乃135(来源于孟，己心iuus niger介uum夕va:a~ori)的尸句“基因(GeneBankA以尤SSion:M94550)及A.nigerN25PhyA基因(GeneBankA。戈SSion:AF21如13)、A.nigervar~夕句“基因(枷eBank Aa笼ssfon:ID2421)、A.niger5K-57夕hJ讨基因(G闭eBaDk八口戈SSion:川叨227(X))同源性分别为%.7%、%.8%、%.4%和91.7%，而编码的氨基酸序列同源性分别为98%、97.8%、%.7%和95.7%。进一步采用公pa叮IProtParam等软件对黑曲霉N14植酸酶夕句“基因编码氨基酸序列及编码的蛋白质二级结构预测进行分析，结果表明，黑曲霉Nl助h)“基因所编码氨基酸序列存在10个潜在的N-糖基化位点，与黑曲霉NRRU 135和黑曲霉N25的p勺讨基因所编码氨基酸序列上的N-糖基化位点个数及位置完全相同，而糖基化对微生物表达的植酸酶的生物合成和热稳定性至关重要;理论PI为4.95，分子量为5 n42.0，分子式为q6eH蝴3Ns990，消。;负电荷氨基酸残基 (As尹Glu)有51个，正电荷氨基酸残基(A犯+切s)有34个。实验结?
陆益新[4]2016年在《隔孢伏革菌植酸酶在毕赤酵母中的高效表达研究》文中指出植酸酶作为在饲料添加剂添加于单胃动物饲料中,可提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收率,并减轻动物粪便中磷对环境的污染,植酸酶的喂养效果已得到了确认,因此具有极高的应用价值,但植酸酶在天然材料中含量太低,难以获得大量产品,价格昂贵；同时酶的热稳定性难以完全满足饲料加工的要求。因此,提高植酸酶基因的表达水平,改善植酸酶的稳定性是一个函待解决的问题。本研究按照毕赤酵母对遗传密码子的偏好性,利用重迭PCR方法人工合成6-phyA,将其插入到pPIC9K载体,构建成6-phyA整合型毕赤酵母表达载体,通过电转化转入GS115酵母细胞,并筛选出Mur高拷贝转化子,建立了隔孢伏革菌植酸酶分泌表达量高的毕赤酵母株。主要结果如下：1.根据GenBank隔孢伏革菌植酸酶编码序列成功合成34条引物,并利用重迭延伸PCR技术合成了6-PhyA基因。对合成的植酸酶序列进行了毕赤酵母密码子嗜好性分析,结果较为理想,经软件分析,其翻译为氨基酸序列与野生型100%同源。2-通过对信号肽的选择开展研究,试图通过6-PhyA本身的信号肽与仪信号肽相融合,以促进植酸酶的表达,但是效果不理想,通过用酿酒酵母细胞研究6-PhyA野生型信号肽作用,发现在强启动子GPD的驱动下,未发现其能介导6-PhyA在酿酒酵母细胞中的表达,由此证明,野生型信号肽的存在并不能促进植酸酶的表达。3.将植酸酶基因克隆到表达载体pPIC9K中,电击化转入毕赤酵母GS115,获得重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K/L6ph。经甲醇诱导72h后,产酶量达到最高峰,酶活力达到23.7U/mL,实现了植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达。4.对植酸酶酶学性质的研究表明,SDS-PAGE分析表明表达植酸酶的分子量为50 kD左右。PhyA植酸酶最适温度为37-C,最适pH值为5.5,适合单胃动物的消化道环境；在55℃作用60min后,残余酶活是味保温处理的样品活性的44%,超过55℃保温处理,酶活急剧下降；金属离子对植酸酶的活性没有影响。
康伟[5]2006年在《黑曲霉植酸酶A在毕赤酵母中的表达和酶学性质表征》文中研究指明黑曲霉NRRL 3135中的分泌型植酸酶A是一种糖蛋白,能水解植酸生成正磷酸盐。它属于大分子量组氨酸酸性磷酸酯酶,而且具有耐酸性和高活性,因此可以作用饲料工业用酶来促进动物体内植酸的分解,降低有机磷对环境的污染。但是由于热稳定性问题,极大限制了黑曲霉NRRL 3135中植酸酶A在工业生产中的应用。毕赤酵母GS115作为表达异源蛋白的宿主已经被广泛的应用,并且表达的蛋白质都被糖基化,而且热稳定性有所提高。我们将一段含有大约1.4kb的phyA的基因正确插入到载体pPICZaA并且整合到毕赤酵母GS115染色体中,然后用甲醇进行诱导表达。获得了分子量为95kD糖基化重组植酸酶。酶学性质测定表明该重组植酸酶的活力为100U/mg左右,最适作用温度55℃,最适pH5.5。热失活试验表明该重组植酸酶在85℃加热10分钟仍然有48%的活性剩余。可见在毕赤酵母GS-115中表达的重组植酸酶的热稳定性有所提高。
赵冬敏[6]2007年在《植酸酶基因phyA的克隆及在毕赤酵母中的高效表达》文中认为植酸(肌醇六磷酸)是植物饲料中磷的主要贮存形式。由于单胃动物(如家禽、猪等)体内缺乏分解植酸的酶,因此植酸磷难以得到有效利用。植酸酶,即肌醇六磷酸磷酸水解酶,在饲料中添加植酸酶则可提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收,并减轻动物排泄物中磷对环境的污染,这使得植酸酶作为饲料添加剂具有广泛的应用前景。植酸酶广泛存在于植物、动物和微生物中,但是天然材料中植酸酶活性很低,为了得到大量的植酸酶,人们利用基因工程技术构建植酸酶基因工程菌株实现高效表达;在分子水平上对植酸酶基因进行改造,如提高耐热性、催化活性以及对单胃动物胃肠道pH的适应性等,使其更适合作为饲料添加剂在动物体内发挥催化作用。本文以自行筛选的产胞外植酸酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger N-J为出发菌株,克隆植酸酶phyA基因,并将其连接构建到毕赤(Pichia pastoris)酵母分泌型表达载体pPICZαA中,利用电击转化的方法将pPICZαA/phyA转入毕赤酵母中,构建植酸酶酵母工程菌株,高效表达了有良好应用性质的胞外植酸酶。本实验的主要结果如下:1.产胞外植酸酶的黑曲霉菌株的筛选将从不同地方采集的土壤样品在含有植酸钙的筛选培养基上进行筛选,能够水解植酸钙产生透明圈的菌株即为阳性菌株,微生物学鉴定为黑曲霉,命名为Aspergillus niger N-J。2.黑曲霉A. niger N-J植酸酶phyA基因的克隆利用改进的氯化苄法提取A. niger N-J基因组,并以基因组DNA为模板,通过PCR扩增出大小约为1.4 kb的植酸酶phyA基因片段。序列分析表明phyA开放阅读框长度为1347 bp,包含编码448个氨基酸的植酸酶成熟肽的完整序列;其核苷酸序列与A. niger NRRL3135 phyA基因(GenBank Accession No. Z16414)的同源性为96.44%,推导出的氨基酸序列同源性为97.77%。在phyA基因编码的氨基酸序列中,存在11个潜在的N-糖基化位点及组氨酸酸性磷酸酶的活性位点保守序列RHGARYP,位于氨基酸序列的+62~+68。3.黑曲霉A. niger N-J植酸酶phyA基因在毕赤酵母中的高效表达将pMD-T/phyA质粒经双酶切后构建植酸酶酵母表达载体pPICZαA/phyA。将重组表达载体pPICZαA/phyA质粒用Pme I线性化后电击转化毕赤酵母Pichia pastoris GS115,经抗生素Zeocin和酵母PCR筛选获得多株酵母工程菌。对5株酵母工程菌进行植酸酶的诱导表达和生物学活性测定,其中一株高表达工程菌株ZαA-phyA-2,甲醇诱导(终浓度为2%)96 h后发酵液植酸酶活力达242,000 U/mL,比出发菌株酶活力(8 U/mL)提高了30,000倍,表达植酸酶的比活力为503,000 U/mg蛋白,从而实现了植酸酶phyA基因在毕赤酵母中的高效表达。4.毕赤酵母表达植酸酶性质的研究SDS-PAGE分析表明表达植酸酶的表观分子量为66~80 kD左右。表达的植酸酶对于植酸钠和pNPP的Km值分别为0.196 mM和18.15 mM;kcat/Km分别为2.0×106 M-1s-1和104.7 M-1s-1。其最适反应pH值为5.5,在pH值为2.5~5.5的范围内能保持较高的酶活力;在pH 5.5和反应时间为10分钟的条件下,表达植酸酶的最适反应温度为55℃;90℃下加热处理15分钟仍可保持68.8%左右的酶活力,比世界范围内广泛应用的植酸酶饲料添加剂NatuphosR在相同条件下处理后剩余的酶活力高13%左右;利用荧光光谱分析表明,表达的植酸酶在90℃下热处理60 min后红移4 nm,用6 M脲处理完全变性后红移8 nm,说明表达的植酸酶具有较稳定的叁级结构。
赵述淼[7]2004年在《烟熏曲霉植酸酶基因phyA的克隆及其在毕赤酵母中的表达》文中研究指明植酸酶是一种能将植酸磷(六磷酸肌醇)降解为肌醇和无机磷酸的酸性磷酸酶类。在饲料中添加植酸酶不但可以提高动物对磷的吸收，降低环境中磷的污染，而且能解除植酸对金属离子、氨基酸的螯合作用，大大提高饲料的利用效率。 自然界中大量高活性的植酸酶主要存在于真菌中，大多数是丝状真菌。国内外科技工作者对植酸酶基因克隆及其表达的研究已有许多成功的报道，大幅度提高了植酸酶的产量，并且实现了工业化的生产。一般认为黑曲霉(Aspergillus niger)产生的植酸酶活性最强，因此工业化生产的工程菌中的植酸酶基因大都来自于黑曲霉，但是这种来源于黑曲霉的植酸酶不能耐受较高的温度，在干燥和制粒加工过程中酶活大量丧失。而烟熏曲霉(A．fumigatus)中分离的植酸酶能够耐受90℃～100℃的高温，并且能在较宽的pH范围内降解植酸，具有较大的市场潜力。 本研究根据已发表的植酸酶phyA基因全序列设计一对引物，用PCR方法从烟熏曲霉(A．fumigatus)CCTCC AF93024总DNA中扩增到去除信号肽和内含子后约1.3kb的phyA基因编码区片段，对该片段进行了克隆及序列测定。以此片段成功构建了pPIC9K-phyA表达载体，并转化毕赤酵母GS115(Pichia pastoris)。通过表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE电泳分析，重组转化子中植酸酶得到了有效分泌和高效表达。摇瓶诱导发酵48h发酵液中植酸酶的活性可以达到113u／mL；表达产物在pH2.0～8.0均有活性，最适作用pH为6.0，最适作用温度为60℃，并且具有较好的耐热性，90℃处理10min后仍有74％的活性。
陈艳[8]2004年在《淀粉液化芽孢杆菌中性植酸酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的高效表达》文中提出淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一种嗜热菌，其产生的中性植酸酶具有广阔的应用前景。本研究克隆了淀粉液化芽孢杆菌植酸酶基因，采用表达载体pET-30a(+)Vector、pPIC9K Vector及其相应的宿主菌E. coli 21和Pichia pastoris GS115对其进行表达，并对表达产物的活性和耐热性能进行了系统性评价。主要研究结果如下： 通过对植酸酶基因序列的同源性比较，根据其保守区域设计上游引物5BAP01和下游引物3BAP01。以提取的淀粉液化芽孢杆菌BA基因组为模板，利用TD-PCR技术克隆了淀粉液化芽孢杆菌植酸酶基因BAP，并构建了重组质粒pGEM-T Easy BAP Vector。测序表明，其长度为1167 bp，ORF为11bp～1159 bp，编码383个氨基酸，5’端有一个编码26个氨基酸的信号肽序列，其全长理论分子量为41.9 kDa。 淀粉液化芽孢杆菌植酸酶基因和已报道的杆菌植酸酶序列具较高同源性，如与AF029053(B. subtillus)、AF453255(B. amylotiquefaciens)、U85968(Bacillus sp.DS11)、AY220075(B. subtillus)、AY055220(B. amyloliquefaciens)、AY518208(Bacillus sp.)的DNA序列的同源性分别为100％、96％、92％、92％、92％、92％，所编码蛋白同源性分别达到100％、97％、94％、94％、94％、93％。 通过带限制性内切酶位点的引物(5BAP01带BamHI位点，3BAP01带XhoI位点)，将淀粉液化芽孢杆菌编码的中性植酸酶基因定向插入到原核表达载体pET-30a(+)上，得到重组表达质粒BAP-pET-30a(+)Vector。在大肠杆菌BL21(DE3)中得以表达，SDS-PAGE凝胶电泳显示在50.2 kDa处有一特异条带，比推导出的分子量41.9 kDa大。单位发酵液的酶活力为480.6 U／ml，表达量占到了大肠杆菌可溶性蛋白的33.5％，为出发菌株酶活的1.27倍。采用金属Ni~(2+)亲和层析对基因表达产物进行纯化，产物具有正常的生物学功能。 根据酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点和已克隆的中性植酸酶基因限制性内切酶图谱，设计具有SnaBI位点的上游引物5BAPK01和具有NotI位点的下游引物3BAPK01。采用亚克隆技术，将淀粉液化芽孢杆菌植酸酶基因以N-端融合的方式正确插入到酵母表达载体pPIC9K上的α-因子信号肽编码序列的3’硕士学位论文淀粉液化芽抱杆菌中性植酸酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母的高效表达端，构成重组表达载体BAP一pPICgK。用电击法将经BgiH单酶切线性化的BAP一PPICgK转化入毕赤酵母Gslls菌株，从而整合到酵母染色体DNA中得到重组转化子。筛选到的基因工程菌经培养后，上清液的发酵活力为4120 U/ml，为出发菌株的10.9倍。sDs一PAGE凝胶电泳检测，表达的植酸酶的分子量约为45 kDa，这表明植酸酶基因在毕赤酵母得到了高效表达g 对两种表达系统的植酸酶生物学特性研究显示，云动11 BAPE菌株与Piohia pastori:BAPK菌株表达的淀粉液化芽饱杆菌的植酸酶具有相似性，最适反应温度均为65一70’C，属嗜热性酶。其最适反应pH为7.0一7.5，在6.。一7.5这一范围内，酶活性均在70%以上。pH值稳定性结果表明，植酸酶BAPE和BAPK在pHS.0一9，O之间极为稳定，残余酶活在85%以上，而pH低于5.0时，酶活性迅速下降，到pH为4.0以下，已无酶活性。热稳定性研究揭示，重组酵母植酸酶BAPK的耐热性优于大肠杆菌植酸酶BAPE，BAPK在70℃和80℃处理2 min，残余酶活为80.54%和68.42%，处理10 min的残余酶活分别为70.03%和50，69%;而植酸酶BAPE在70℃和80℃处理2 min，残余酶活为71.02%和40.34%，处理10 min后，残余酶活为4823%和20.12%。由此可以看出，同种基因经两种不同系统表达得到的植酸酶均适合在动物的肠道内发挥作用，重组酵母植酸酶BAPK耐热性更佳。
刘生峰[9]2004年在《植酸酶基因在毕赤酵母中高效表达及工程菌培养基初步优化》文中提出植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐的一类酶，将其添加到单胃动物植物性饲料中，可以释放植酸中的无机磷以及被植酸络合的Ca~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)等矿物元素和一些蛋白质，从而解除植酸抗营养作用、提高动物饲料的营养价值，同时也减少了动物粪便中植酸磷的含量，降低了磷对环境的污染程度。研究表明，饲料中添加植酸酶可使其中磷利用率提高60％，粪便中磷排出量减少40％，还可以提高饲料转化率，改善动物的生产性能，因此对提高养殖业的经济效益及环境保护均具十分重要意义。 植酸酶主要存在于微生物和植物中，动物体内也有少量存在，但真正具有开发价值的主要是微生物产生的植酸酶，尤其是曲霉产生的酸性植酸酶。国外早在1991年就成功地利用DNA重组技术获得第一株酸性植酸酶的工程菌，并已投入商品化生产。目前已开始从事植酸酶的植物和动物基因工程的研究，已成功将植酸酶基因导入苜蓿、烟草、小鼠和猪的唾液腺中。国内对植酸酶的研究起步较晚，到目前为止，植酸酶野生菌株产酶水平低下的问题仍然没有得到彻底解决，目前市场上应用的植酸酶制剂多属进口产品，且价格昂贵。因此，提高植酸酶野生菌株产酶水平，降低其生产成本，对实现植酸酶产品国产化并获取自己专利具有十分重要意义。而提高野生菌株产酶水平的主要思路集中在通过基因工程手段克隆植酸酶基因或进行适当改造，然后将这些优良基因导入适当的宿主菌，进一步筛选出高产工程菌株，优化发酵工艺条件从而实现植酸酶基因的高效表达。 因此，本实验着力于将已构建的可进行诱导调控分泌表达的毕赤酵母整合型表达载体转化毕赤酵母受体菌，进而筛选出高产稳产植酸酶的工程菌，为植酸酶的规模化生产提供优良菌种，并对工程菌株的产酶培养基进行初步优化从而为规模化生产提供科学依据。主要实验结查如下：西南农业大学硕士学位论文 1、用乃aI酶切携带植酸酶基因表达片段的重组质粒pPICgK夕句)A，回收DNA，用GenePulser电击转化毕赤酵母，涂布MD平板，又用含不同浓度G418的YPD平板进行抗性筛选，得到98个可检测到植酸酶活力的阳性转化子，它们在MD、MM平板上均表现快速生长，说明其甲醇利用表型是Mut干。用特异性引物，对转化菌株进行PcR检测，扩增出了特异条带，表明外源基因整合进了宿主细胞。挑选转化子经过BMGY摇瓶培养、BMMY诱导发酵后，用钒铝酸按法测定了表达产物的酶活性，结果表明重组菌株可有效表达具有生物学活性的植酸酶。经摇瓶复筛后得到l株产酶活性为143958.3UZmL发酵液，并且具有良好遗传稳定性的高产工程菌株(E22)，其产酶活性是出发菌株酶活性(422U/mL)的341 .13倍。 2、重组酵母E一22在诱导培养168h之内，植酸酶的表达随时间的延长而增加，到144h接近高峰，之后基本保持稳定。菌体湿重在诱导培养72h之内有所增加，随后基本保持稳定。重组植酸酶部分酶学性质的研究结果表明:重组酶在pH值2.5一3.0和5.0一5.5时酶活性最高，且在pH4.5一6.5之间均有较高的酶活性，最适作用温度为55℃。sDs一PAGE的结果显示重组植酸酶的分子量介于70kDa~97kDa之间。重组植酸酶粗酶比活力为461575.8 u/mg。 3、用5因素的均匀设计试验对工程菌株的产酶培养基进行了初步优化，酵母提取物、甲醇、蛋白陈、YNB、生物素在培养基中的浓度分别取2%，4%，1%，0，0.0001%;在此条件下发酵液的酶活力达到108758.3 U/mL发酵液，高于均匀设计中各试验点的酶活力值，是使用BMMY培养基同条件(诱导培养96h，37℃测酶活)下酶活力(97666.7U/mL)的1 1 1.4%。
谢涛[10]2006年在《表达载体信号肽改造提高毕赤酵母植酸酶phyA基因表达量研究》文中研究说明植酸酶可以提高饲料中磷的利用率和减少粪便中磷的排出量，对减少畜禽粪便中磷对环境的污染和提高饲料利用率有重大价值，提高植酸酶的表达量，对工业化生产有重要意义。 本研究以本课题组构建的植酸酶毕赤酵母基因工程菌PP-NP~m-8和PP-NP~(m-4)-8为出发菌株，根据毕赤酵母的信号肽序列，按照酵母偏爱密码，人工合成毕赤酵母的新型信号肽MS，并构建了新型酵母表达载体pPIC9k-MS，并进行了酶切鉴定。将本课题组来源于黑曲霉N25植酸酶phyA基因的突变基因phyA~m和突变基因phyA~(m-4)分别插入pPCI9K-MS载体中，构建重组质粒pPIC9k-MS-phyA~m和pPIC9k-MS-phyA~(m-4)，并进行PCR鉴定，然后电击转化毕赤酵母，筛选获得了植酸酶毕赤酵母基因工程菌株PP-MS-NP~m-77和PP-MS-NP~(m-4)-16。 植酸酶毕赤酵母基因工程菌PP-MS-NP~m-77和PP-MS-NP~(m-4)-16表达产物的SDS-PAGE分析表明，酶蛋白分子大小为70.15KD。PCR鉴定结果表明，突变基因phyA~m和突变基因phyA~(m-4)都已整合到酵母染色体DNA中。连续传10代培养实验证实，植酸酶毕赤酵母基因工程菌的遗传稳定。 植酸酶毕赤酵母基因工程菌PP-MS-NP~m-77酶活性测定结果表明，在BMGY／BMMY培养基中诱导36h后酶活力可达179150u／ml，比出发菌株PP-NP~m-8的63667u／ml提高了2.81倍，在麦芽汁培养基中，诱导36h后酶活力达188130u／ml，比PP-NP~m-8的47600u／ml提高了3.95倍。 植酸酶毕赤酵母基因工程菌PP-MS-NP~(m-4)-16酶活性测定结果表明，在BMGY／BMMY培养基中诱导36h后酶活力可达201800u／ml，比出发菌株PP-NP~(m-4)-2的133800u／ml提高了1.51倍，在麦芽汁培养基中，诱导36h后酶活力达209600u／ml，比PP-NP~(m-4)-2的136900u／ml提高了1.53倍。 本研究通过表达载体信号肽的改造，构建了新型酵母表达载体，提高了植酸酶在毕赤酵母中的表达量，为植酸酶工业化生产提供了基础材料和科学依据，具有重要的学术价值和应用前景。
参考文献：
[1]. 基因突变技术提高phyA植酸酶在毕赤酵母中表达量及热稳定性的研究[D]. 陈惠. 四川农业大学. 2004
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[3]. 植酸酶产生菌的选育及高表达工程菌的构建研究[D]. 彭远义. 西南农业大学. 2004
[4]. 隔孢伏革菌植酸酶在毕赤酵母中的高效表达研究[D]. 陆益新. 扬州大学. 2016
[5]. 黑曲霉植酸酶A在毕赤酵母中的表达和酶学性质表征[D]. 康伟. 吉林大学. 2006
[6]. 植酸酶基因phyA的克隆及在毕赤酵母中的高效表达[D]. 赵冬敏. 山东农业大学. 2007
[7]. 烟熏曲霉植酸酶基因phyA的克隆及其在毕赤酵母中的表达[D]. 赵述淼. 华中农业大学. 2004
[8]. 淀粉液化芽孢杆菌中性植酸酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的高效表达[D]. 陈艳. 浙江大学. 2004
[9]. 植酸酶基因在毕赤酵母中高效表达及工程菌培养基初步优化[D]. 刘生峰. 西南农业大学. 2004
[10]. 表达载体信号肽改造提高毕赤酵母植酸酶phyA基因表达量研究[D]. 谢涛. 四川农业大学. 2006