留存14年手套上DNA的提取和分析论文

留存14年手套上DNA的提取和分析

司访^1,2，李倩男³，吕登飞⁴，曾昭书^5,*

（1.郑州大学基础医学院，郑州450000；2.河南警察学院，郑州450000；3.开封市公安局，河南开封475000；4.鹤壁市公安局，河南鹤壁458000；5.郑州大学基础医学院法医学系，郑州450000）

摘要: 目的使用四种方法对保存14年之久的手套的不同部位进行DNA提取检测，以探索针对手套上陈旧性DNA的有效检验方法。方法在手套内衬虎口处、五个掌指关节偏下1cm处、掌心处等各部位剪取检材，分别用Chelex-100法、磁珠法（M48法）、硅膜法、直接扩增法进行提取并STR基因座扩增，经电泳检测分型结果。结果使用硅膜法和直接扩增法得到了较为完整的STR分型图谱。结论通过对比发现，四种方法中硅膜法和直接扩增法均能获得有效结果，尤其是直接扩增法操作简单、快捷、耗费检材少故可优先尝试，同时本例手套显示内衬食指与中指指根偏下处检测效果更优。

关键词: 陈旧性手套；脱落细胞；DNA提取

随着DNA技术在侦查破案中的应用与普及，DNA作为案件的直接证据也为犯罪分子所熟知，以至于各种反侦查行为不断出现。在盗窃、抢劫、强奸、杀人等案件中有很多犯罪分子通过戴手套来防止在犯罪现场留下指纹等物证，这样会减少DNA的遗留，给破案增加了难度。但在犯罪现场及外围现场发现的罪犯遗弃手套往往能为案件的侦破提供关键性线索。对于丢弃时间短的手套按照脱落细胞的提取方法能较易检测出戴手套者的DNA分型，而陈旧性手套因其保存年限较长以及环境和气候变化等原因导致附着其上的DNA降解严重，会使其STR分型检测困难。本文通过Chelex-100法、磁珠法、硅膜法、直接扩增法等不同的DNA检验方法分别提取一只保存14年的完好棉质手套的不同部位并进行STR分型，对比得出了所用方法的优劣，应可为此类物证的检验提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要实验仪器与试剂

ABI 9700 PCR仪和ABI 3500xL测序仪(美国AB公司)；PowerPlex^®21 System扩增试剂盒（简称:PP21，Promege公司）；IGS Sniffer法医痕量DNA提取试剂盒（硅膜法）；M48磁珠试剂盒（德国QIAGEN公司）。

1.2 检材提取

分别剪取^[1]手套内衬虎口处、五个掌指关节偏下 1 cm处、掌心处^[2]各1.0 cm×1.0 cm大小的检材2份共3组（即每组14份），分别以Chelex-100法、磁珠法、硅膜法(IGS Sniffer UItra)提取DNA，每法每种检材各用2份；取上述相同部位0.2 cm×0.2 cm大小的表层纤维各2份，用于直接扩增法。

1.3 实验方法

1.3.1 Chelex-100法

将检材剪碎置于0.5 mL离心管中，加入500 μL去离子超纯水，室温浸泡1 h以上，13000 r/min离心5 min；弃上清液，沉淀物中加入150 μL 5% Chelex-100，10 mg/mL 蛋白酶 K 1.5 μL，56 ℃保温 1 h 以上，100 ℃变性8 min，13000 r/min离心5 min，取上清液进行扩增。

将检材按文献[3]方法进行处理。

按IGS Sniffer法医痕量DNA提取试剂盒操作方法进行。

Chelex-100法七个部位均未得到STR分型图谱。磁珠法中掌心处得到1个基因座，食指中指指根偏下处得到4个基因座，其他部位均未得到STR分型图谱，无法进行同一性认定，综合两个部位的检测结果于表1。硅膜法中掌心处及食指中指指根偏下处得到较完整的STR分型图谱（表1）；其他部位得到不完整的STR分型图谱，无法进行同一性认定。直接扩增法能得到掌心处及食指中指指跟偏下处较完整的STR分型图谱（表1）；其他部位得到不完整的STR分型图谱，无法进行同一性认定。经过比对，得到的STR分型与当年犯罪嫌疑人的DNA分型一致。

(5)及时更换磨耗到限的丝杆和铜螺母。日常检修时，须做好丝杆和铜螺母的清洁保养，清洁完毕后涂上适量的润滑脂，以减少丝杆与铜螺母之间的磨耗。在车门关闭状态用力向左还向右推门页，若门页可以移动4 mm以上，需检查丝杆和铜螺母状态，并更换磨耗大的丝杆或铜螺母。

将检材剪碎置于1.5 mL离心管中，加入190 μL裂解液G2和10 mg/mL 蛋白酶K溶液10 μL，56 ℃消化1 h以上；13 000r/min离心5 min；弃载体，加入MTL 500 μL，磁珠30 μL，震荡摇匀吸附（DNA）15 min，磁珠以磁力架吸收并弃液体后释放；加入500 μL浓度80%的酒精、振荡摇匀后再置磁力架吸弃液体，重复此过程5次，末次吸弃液体后敞口，65℃干燥10 min；加入30 μL去离子超纯水，65 ℃温浴10 min；置磁力架上吸出液体进行扩增。

1.3.4 直接扩增法

1.3.2 磁珠法

1.4 PCR扩增及检测

手套上的脱落细胞多为角化的上皮细胞，DNA或降解或量微，故提取较为困难。本案中的检材为一只14年前的陈旧性手套，其上DNA降解更严重。本文中除了常规的Chelex-100法、磁珠法（M48法）、硅膜法^[5]之外，为提高DNA提取率，减少抑制性成分，还使用了DNA直接扩增法，由于直接扩增法不需经过单独的裂解、纯化、洗涤等步骤，DNA数量较其它常规提取方法能得到更为全面的保存，同时污染的风险也会降低。

综上所有未定之论，也不妨《青松红杏图》受人景仰几百年，自康熙始至解放后崇效寺被撤之前，此图尚存于世，一直作为镇寺之宝，被无数文人雅士留墨题咏。

2 结果

1.3.3 硅膜法

表1 三种方法检测出的DNA分型结果
Table 1 STR genotypes obtained with three methods

3 讨论

将PP21^[4]试剂盒中的Primer Pair Mix、Master Mix和水按2∶2∶2的比例配制扩增试剂，将配制好的扩增液、提取好的样本按6∶4的比例加入扩增专用管，扩增体系10 μL；剪取检材载体适量，按照PP21试剂盒说明进行直接扩增，样本每管加入Master Mix 3 μL、Primer Mix 3 μL 并补水至 15 μL (检材量大时，可适当增加反应体系)，使用 ABI 9700 PCR仪进行扩增30个循环，用ABI 3500xL测序仪按推荐参数进行电泳分析。

设计师行为表达为二部网络模型，如图9所示。图中，产品创新方案子网(Product网或P网)是产品创新方案的网络，每个节点表示一个方案，节点之间的连线(边)表示产品间的引用关系；设计师子网(Designer网或D网)是设计师的协作网络，每个节点表示一个设计师;两个子网之间的连线连接设计师及其作品。D网的边根据P网投影得到。

Chelex-100法的结果表现不好，可能的原因一是在提取过程中经过洗涤步骤，造成检材中的游离DNA大量损失；二是使用的5% Chelex-100体系过大（150 μL），降低了DNA的浓度，达不到检材最低浓度要求的DNA量；三是Chelex-100法主要是螯合金属离子，对其它PCR抑制物不能去除，导致扩增效率降低，最终得不到分型结果。故不推荐使用Chelex-100法提取此类检材的DNA。磁珠法中七个部位均得到不完整的STR分型图谱，在掌心处及食指中指指根偏下处分别只检测到1个和4个STR基因座，故此法效果也较差。硅膜法和直接扩增法提取扩增的样本基因座DNA分型检出较为完整，其中硅膜法提取扩增得到的DNA分型图谱更为完整，而直接扩增法所得到的DNA分型图谱则存在PentaE基因座分型丢失，但其他基因座分型较为干净，杂峰少。不过两种提取扩增方法的DNA分型图谱均出现峰值不均匀，前高后低现象，这应与检材保存时间太长，DNA大量降解有关。对比硅膜法，直接扩增法操作简单，检材损耗低，检出时间短，更有利于获得单一来源的DNA分型和重复性检测。依据本文结果，针对重大案件现场发现提取的重要微量物证，可考虑使用直接扩增法先行提取扩增，而这也并不影响后续其他方法的检测应用。通过分析不同提取部位的实验结果，不难发现本实验中食指中指指根偏下处较易检出DNA分型。

1.2.2 GC-MS分析。色谱条件：色谱柱VF-WAX ms毛细管柱(30 m × 0.25 mm，0.25 m)；载气高纯度氦气(>99.999%)，流速1.0 mL/min，进样口温度250 ℃；采用柱温升温程序：60 ℃(保持2 min)，以8 ℃/min 升温至230 ℃(保持2 min)，以20 ℃/min 升温至250 ℃(保持2 min)；进样量0.5 mL，不分流模式进样，进样时间1 min。质谱条件：电离方式为EI源，电离能量70 eV，离子源温度230 ℃，传输线温度280 ℃；其他参数为标准自动调谐参数；质量扫描范围为50～550 m/z。

4 结论

本实验中手套脱落细胞DNA的检测，食指中指指根偏下处较易检出，直接扩增法明显优于其他方法，故若进行手套上陈旧DNA的检测，可参照本实验完成。手套上脱落细胞的多少与手套的使用频率和使用者的个体差异有关，手套上脱落细胞的分布与使用者的平时生活习惯和受力点有关^[6]，要想对手套各部位检验成功率做出更科学的结论还需要更多的实验数据。陈旧性手套的保存方式也是影响DNA分型检测成功与否的重要因素。本检材自提取后，一直用纸质物证袋常温干燥避光完好保存达14年之久，为检测成功提供了条件保障。

淋巴管瘤属于淋巴系统肿瘤样病变之一，以良性为主，发病原因可分为先天性和后天因素造成淋巴阻塞而继发两种。本病以往被临床纳入到罕见良性肿瘤样病变中，随着MRI、CT等影像学诊断技术在临床中的普及应用，淋巴管瘤的确诊率得到了显著性提升。鉴于此，进一步提高淋巴管瘤病的影像学诊断准确率对提高临床治疗效果、改善预后具有重要意义。本文通过收集我院15例经穿刺病理或手术证实的个部位淋巴管瘤病患者的临床资料，对淋巴管瘤病的影像学特征和病理之间的相关性进行回顾性分析，对影像学特点加以探讨，使该病的术前确诊率得到明显提升。

参考文献

［1］李辉，王智，辛应朋，等.不同载体上人体脱落细胞富集方法的比较［J］.昆明医科大学学报，2017(11):118-121.

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Analysis and Extraction of DNA from a Glove Kept for Fourteen Years

SI Fang^1,2, LI Qiannan³, LÜ Dengfei⁴, ZENG Zhaoshu^5,*
(1. School of Basic Medical Science, Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China; 2. Henan Police College,Zhengzhou 450000, China; 3. Kaifeng Public Security Bureau, Kaifeng 475000, Henan, China; 4. Hebi Public Security Bureau, Hebi 458000, Henan, China; 5. Department of Forensic Medicine, School of Basic Medical Science, Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China)

ABSTRACT: Objective To explore an effective DNA extraction-and-detection method by which the STR genotypes were to test out from different parts of a glove kept for 14 years. Methods DNA was tested from the samples extracted at three places:position of the glove-lining between the thumb and indexfinger, site about 1cm below thefive metacarpophalangeal joints,and the palm center. Choices of Chelex-100, magnetic beads (M48), silicon membrane extraction and direct amplification were used to have the DNA extracted and/or detected, with the STR genotyping being carried out by electrophoresis. Results Relatively complete STR profiles were obtained from the disposal of either silicon membrane or direct amplification.Conclusions The approaches of both silicon membrane and direct amplification are better than the other two choices for more complete STR genotypes to obtain, with the direct amplification having prior selectivity because of its simplicity, rapidness and fewer consumption of tested materials. Samples cut from the glove-lining areas below the forefinger and/or the middlefinger provide better STR profiles than those from other places.

KEY WORDS: aged gloves; exfoliated cells; DNA extraction

中图分类号: DF795.2

文献标识码: B

文章编号: 1008-3650(2019)05-0451-03

第一作者简介: 司访，女，河南长垣人，学士，助教，研究方向为法医物证学。E-mail: 541231987@qq.com

* 通讯作者简介: 曾昭书，男，河南光山人，博士，教授，研究方向为法医物证学。E-mail: zzs@zzu.edu.cn

DOI: 10.16467/j.1008-3650.2019.05.016

收稿日期: 2018-04-03修回日期:2018-08-16

引用本文格式:司访，李倩男，吕登飞，等.留存14年手套上DNA的提取和分析[J]. 刑事技术，2019,44(5):451-453.

标签：陈旧性手套论文; 脱落细胞论文; dna提取论文; 郑州大学基础医学院论文; 河南警察学院论文; 开封市公安局论文; 鹤壁市公安局论文; 郑州大学基础医学院法医学系论文;