高亭1 蒋引娣2 何小鹏1 张红英3（通讯作者） 谢军平4
（1.咸阳市中心医院呼吸与危重症医学科 712000）
（2.咸阳市中心医院血液内科 712000）
（3.陕西中医药大学第二附属医院 712000）
（4.南昌大学第二附属医院呼吸内科 330006）
【摘 要】目的：观察羟基红花黄色素A（hdroxysafflor yellow A,HSYA）对小鼠C57BL/6 Lewis肺癌移植瘤组织中微血管（MVD）表达影响。方法：C57BL/6近交系小鼠30只，造模后随机分为5组，每组6只，分别使用灭菌用水；环磷酰胺；HSYA高、中、低浓度组（1.4、0.7、0.35mg/kg）作用于小鼠模型，于造模第22天后处死所有小鼠，用CD31对肿瘤组织进行免疫组化染色，观察微血管生成情况。结果：HSYA中、低浓度组与CTX组微血管形成分别为22.63±3.82、18.46±2.81、13.56±2.96低于对照组34.82±3.94以及HSYA高浓度组32.32±2.76，差异具有统计学意义。结论：HSYA能够抑制Lewis肺癌移植瘤生长，与降低肿瘤微血管生成有关。
【中图分类号】R284.2 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）8-0707-02
肺癌作为当今世界发病率最高的肿瘤，其死亡率呈逐年上升的趋势。羟基红黄色素A（hydroxysafflor yellow A,HSYA）是红花发挥主要药理作用的成分之一。前期通过动物实验证明[1]低浓度HSYA能够抑制肺癌移植瘤中血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达，从而抑制肺癌移植瘤的生长。在此基础上本研究组通过进一步实验，观察HSYA对肿瘤组织中微血管密度的影响作用，进一步说明HSYA对肿瘤血管的抑制情况。
1 材料与方法
1.1 动物及细胞株 C57/BL雄性小鼠30只，体重（20±2）g，购自陕西农林科技大学动物中心，饲养于咸阳市中心医院动物中心清洁级动物房；Lewis肺癌细胞株购自中国科学院上海实验动物中心。
1.2药物 HSYA标准品购自上海顺勃生物工程技术有限公司，纯度≥98.4%;环磷酰胺（CTX）购自江苏恒瑞股份有限公司，200mg/支；CD31一抗：即用型，购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.3实验方法
1.3.1 Lewis肺癌细胞培养 用含有10%胎牛血清及DMEM的培养基进行Lewis肺癌细胞培养，至于37.0℃、5%CO２ 孵箱中进行培养，每２天更换１次培养基，并用0.25％胰蛋白酶消化后进行传代。
1.3.2 药物配制 CTX用灭菌注射用水配制成2g/L溶液；HSYA标准品，用灭菌用水配制成28mg/L、56mg/L、112mg/L溶液，并用0.22μm微孔滤膜滤过除菌，无菌分装后避光储存于-20℃冰箱中。
1.3.3动物造模 待Lewis肺癌细胞株传代足够数量后，取处于对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后在倒置显微镜下技术，观察活力＞95%，调整浓度至1×107/mL细胞悬液，按0.2ml/只接种于C57/BL小鼠侧肋腹皮下，复制小鼠Lewis肺癌移植瘤模型。
1.3.4 动物分组及给药 在造模24h小时后，将所有所有小鼠采用计算机随机数字编排分为5组，每组6只；分别为灭菌用水组（对照组）；CTX组；HSYA高、中、低浓度组（1.4、0.7、0.35mg/kg）。在造模后第2天开始，对HSYA高、中、低浓度组腹腔注射药物（2d/次）；对照组给予腹腔注射灭菌注射用水（2次/d）；CTX组于造模后第2天按25mg/kg给予腹腔注射（1次/2d）。
1.4观察指标
肿瘤微血管密度(MVD)判断采用Weidner法进行计算[2]，先低倍镜下（×100）下选取微血管最丰富的区域，避开肿瘤坏死区及出血区，然后在高倍镜（×400）计算该区域视野的微血管数目，计数5个视野的微血管术，取平均值作为该肿瘤的MVD。
1.5统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行数据分析，MVD采用ONE-WAY ANOVA检验。p<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1HSYA对小鼠Lewis肺癌移植瘤MVD的影响 观察移植瘤组织切片，可见肿瘤微血管内皮细胞被染成黄棕色。HSYA中、低浓度组与CTX组微血管形成分别为22.63±3.82、18.46±2.81、13.56±2.96低于对照组34.82±3.94以及HSYA高浓度组32.32±2.76，差异具有统计学意义。（详见表一）
3 讨论
肿瘤微血管密度不但能够为肿瘤提供营养支持及供给氧需，而且是反映肿瘤血管生成的一个重要指标，与VEGF共同反映了肿瘤的转移及侵润能力[3-4]。肿瘤在没有血供的情况下直径生长不超过2mm[5],新生血管的生成同肿瘤的生成及预后有密切关系。有研究显示[6]，肺癌患者中VEGF表达显著高于健康人群，而VEGF阳性表达者的MVD计数显著高于阴性者，MVD作为衡量肿瘤血管生成的重要量化指标，与肿瘤大小及侵润程度密切相关。CD31是一种重要的内皮细胞标记物，由于其在恶性肿瘤中的表达反应肿瘤血管生成情况，故常被用于标记MVD。
肺癌是目前主要的恶性肿瘤之一，且逐渐成为恶性肿瘤相关性死亡的首位，但晚期肺癌治疗效果均不佳。近年来许多抑制肿瘤血管生成的药物应用于临床，本研究人员通过既往研究发现低浓度HSYA可有效抑制肺癌移植瘤中VEGF表达，从而达到抑制肿瘤生长的目的，本实验进一步通过检测MVD表达发现，HSYA低浓度、中浓度可有效抑制MVD表达，进一步证明低浓度HSYA能够抑制肿瘤血管生成，发挥抗肿瘤作用。
综上所述，HSYA能够降低Lewis肺癌移植瘤中MVD表达，进而抑制肿瘤新生血管的生成，最终达到抑制肿瘤的生长的目的，但是HSYA是否可同时抑制其他血管生成因子的表达，仍需进一步研究。
参考文献：
[1]谢军平；高亭；李环羽；段凤英.羟基红花黄色素A对小鼠Lewis肺癌移植瘤的抑制作用及VEGF表达的影响.广东医学，2014,35（1）：36-38.
[2]Foote RL，Weidner N， Harris J， et al． Evaluation of tumor angiogen-esis measured with microvessel density ( MVD)as a prognostic in-dicator in nasopharyngeal carcinoma: results of ＲTOG 9505［J］． Int J Ｒadiat Oncol Biol Phys， 2005， 61( 3) : 745-753.
[3]Toi M, Kondo S，Suzuki H et al.Qauntitative analysis of vascular endothelial growth factor in Primary breast cancer［J］．Cancer,1996，77( 6):1101-1106．
[4]Takigawa N， Segawa Y， Fujimoto N et al． Elevated vascular endo-thelial growth factor levels in sera of Patients with lung cancer［J］． Anticancer Ｒes，1998，18(28):1251-1254．
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[6]McDonnellCO， Hill ADK， McNamara DA， et al．Tumor microe- tastases: The influence of angiogenesis［J］．Euro J Surg On col，2000，26(2):105-115．
研究项目：
陕西省教育厅科学研究项目（项目编号：14JK1208）
论文作者:高亭1,蒋引娣2,何小鹏1,张红英3（通讯作者）,谢
论文发表刊物:《河南中医》2015年8月
论文发表时间:2016/6/2
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