陈芳芳[1]2016年在《Id3基因表达在逆转肺腺癌细胞顺铂耐药中的作用及机制研究》文中提出背景：肺癌是目前世界上发病率最高的恶性肿瘤之一。在中国,肺癌的发病率呈逐年升高趋势,并已成为恶性肿瘤死亡的最主要原因之一。大部分肺癌,尤其是占肺癌80%的非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)患者确诊时已处于晚期,已失去了外科手术治疗的机会。因此,化疗药物成为治疗肺癌的主要手段之一,尽管治疗取得了一定的进展,但过去25年其5年生存率仍未见明显提高,仅为15%。在肺癌化疗中,以顺铂(DDP)为基础的联合化疗成为NSCLC的一线化疗药物,但由于耐药性问题使其化疗效果明显降低,这已成为目前困扰肺癌治疗的一大难题。因此,寻找更为特异的针对铂类药物耐药相关的分子靶点,如何改变肺癌铂类药物耐药性及耐药逆转机制研究成为当前国内外临床研究的热点之一。导致肺癌化疗失败的主要原因之一是多药耐药(MDR)现象的产生。MDR是指肿瘤细胞对多种化疗药物同时拥有固有或获得性交叉耐药,从而妨碍癌症有效治疗的现象。研究表明,肿瘤具有多种化疗药物耐药机制,涉及细胞生物学的各个方面,是多基因、多步骤联合作用的结果,蛋白质-酶或细胞的部分结构对MDR的产生起到关键性作用,另外,一些癌基因、抑癌基因以及细胞因子等也都可能参与了多药耐药形成的过程,其确切的耐药形成机制尚未完全清楚,但其中研究最广泛且具有多效性的MDR机制之一是转运蛋白使细胞药物流出。膜转运蛋白,包括ABC蛋白家族主要成员：P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP1)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)以及肺耐药蛋白(LRP)蛋白,通过降低细胞内药物浓度或者改变药物的分布来确定MDR的表型。目前,通过使用不同种类的MDR抑制剂来干扰这些转运蛋白将细胞内药物泵出胞外,这种方法的应用正在不同的研究阶段。人类多药耐药MDR基因主要有两种亚型,即MDR1和MDR2,其中,MDR1编码的基因产物是介导多药耐药产生的主要方式。近年来,研究最广泛的就是P-gp。 P-gp是一种的跨膜糖蛋白,分子量为170kD,由7号染色体上的MDR1基因编码。P-gp蛋白的表达量与细胞耐药性呈正相关性。在非小细胞肺癌(NSCLC)中P-gp蛋白的表达量要高于小细胞肺癌(SCLC),在肺腺癌中P-gp蛋白的表达量要高于其在肺鳞癌中的表达,P-gp蛋白在中一高分化腺癌中表达最高,这与它们对化疗药物不敏感性程度相一致。P-gp表达高低与肺癌分期无关,但与癌细胞多药耐药性、化疗药物的选择以及肺癌患者的预后有着密切联系。导致肿瘤细胞MDR现象产生的另一主要原因是肿瘤细胞对化疗药物诱导的凋亡耐受。细胞凋亡抑制基因如Bcl-2、Survivn、突变型p53等的过表达可以引起肿瘤细胞发生凋亡耐受,抑制了肿瘤细胞的凋亡,最终导致肿瘤细胞产生耐药。目前,Bcl-2蛋白已成为研究最深入、同样也是最重要的细胞凋亡抑制基因。Bcl-2基因定位于染色体18q21,在大部分癌症患者中容易导致染色体t(14；18)的易位,以致Bcl-2基因定位在14q32上,与Ig重链的转录蛋白增强子接近,从而导致Bcl-2的表达增高。Bcl-2基因的表达的升高可以促进细胞的异常增殖,同时使得化疗药物诱导的细胞凋亡受到抑制。即使化疗药物能进入细胞内,但细胞中Bcl-2基因的过表达可诱导细胞损伤,但这种损伤不能转换成凋亡的信号,以致细胞凋亡受到阻碍,因此在化疗期间高表达Bcl-2的癌细胞又能以比较快的速度再次重新生长增殖,导致多药耐药的发生。在大多数SCLC中瘤标本和细胞系中,Bcl-2表达的升高,这是与肿瘤细胞对化疗药物产生药物耐受有关。近期研究表明,与肿瘤发生发展、侵袭转移及预后密切相关的RhoE基因也影响着肿瘤的耐药性。RhoE基因属于非典型的RhoGTPase家族成员之一,其一直处于活化的GTP结合状态,最近研究发现,它在一些主要的肺癌细胞系和癌组织中的表达下调,可促进肿瘤细胞的侵袭和转移。RhoE具有许多重要的功能,它可以调节细胞骨架重组和细胞形态,影响细胞增殖、凋亡、分化等。分化抑制因子(Id),属于螺旋-环-螺旋(HLH)转录因子家族成员,因缺乏与DNA结合区域而对碱性HLH (bHLH)转录因子起负调节作用。到目前为止,在哺乳动物中共发现4种Id蛋白,即Id1、Id2、Id3和Id4。近几年的研究表明,Id蛋白家族具有比较广泛的生物学功能,包括：调控细胞命运和细胞定向分化、维持细胞存活、促进血管、胚胎和器官的形成、诱导细胞发生凋亡及肿瘤侵润等癌蛋白功能,同时还具备抑制细胞分化和促进细胞增殖的功能。Id蛋白特别是Id1蛋白,不仅参与正常细胞的生长发育,在许多肿瘤细胞中也呈现高表达,已有研究发现,Id1在肿瘤细胞中的表达水平与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关。Lwatsuki发现,在发生淋巴结转移和腹腔转移的胃癌患者中,Id1蛋白在骨髓和外周血中的表达水平要明显高于没有远处转移的胃癌患者,并提出骨髓和外周血中Id1是监测胃癌发生淋巴结和腹腔转移的“真正的指标”。大量研究已证实Id1在肿瘤细胞中的表达及表达程度与肿瘤细胞的分化及细胞侵袭能力相关,被研究者们认为是一种“准癌基因”,因此得到学者们的广泛研究。目前,Id1在肿瘤中发挥的生物学作用已得到普遍认可,与Id1相比,因为Id3基因表达调控机制的复杂性决定了其功能的多样性,因此,有关Id3基因在细胞周期调控中的作用及其作用机制尚有待进一步深入研究。1991年,有研究学者首次发现了Id3基因,它被称为体外培养小鼠成纤维细胞过程中血清诱导表达的立即早期基因。Id3的表达既广泛,又有细胞类型的特异性,决定了其基因调控机理的复杂性。Id3在细胞中的表达模式和调控机制与Id1不完全相同,在不同种类的肿瘤组织和肿瘤细胞系中,Id3具有截然不同的表达,在人小细胞肺癌和原发性结直肠癌中表达量较高,而在前列腺癌、卵巢癌及甲状腺癌中表达水平低下。小鼠Id3基因敲除(Id3-/-)可导致小鼠发生与人类相似的γδ T细胞淋巴瘤,提示γδ T细胞淋巴瘤患者体内可能存在Id3基因的突变。在我们的前期体外实验研究中发现：①Id3在正常人PBMC中未见表达,而在不同肿瘤细胞中的表达程度则有较大差异,在人前列腺癌细胞PC-3M中Id3表达水平最高,要明显高于肺腺癌细胞(A549)、卵巢癌细胞(COC2)、Burkitt'sB淋巴瘤细胞(Daudi). T淋巴细胞性白血病细胞(Jurkat)等；②用间接免疫荧光试验(IFA)对A54、PC-3M和人乳腺上皮癌细胞(MCF7)中Id3蛋白的表达分布进行检测的结果表明,A549细胞内Id3蛋白表达量要明显低于MCF7和PC-3M细胞。以上结果表明,Id3的表达是根据其所在细胞的种类和生长发育阶段的不同而呈现不同的水平,从而执行各种特殊的细胞生物学功能。据有关文献报道,Id3除了具有促进细胞周期进程,抑制细胞分化的功能外,在细胞凋亡方面也发挥着极其重要的作用。早在2001年,Kee等就发现通过采用逆转录病毒载体将Id3导入人B淋巴细胞前体(B lymphocyte progenitors>BLPs)内,可导致BLPs出现增殖抑制以及凋亡,通过模拟TGF-β的作用,外源性Id3在BLPs中的过度表达可诱导BLPs发生凋亡现象。最近,Lee等研究也发现,经过X射线照射的小鼠表皮组织和HaCaT角质形成细胞可以导致细胞内Id3表达的上调,Id3重组腺病毒在HaCaT细胞中的表达可以诱导细胞发生凋亡,并能显着增加X射线诱导细胞凋亡的敏感性。我们在前期研究中发现：①将表达载体pEGFP/Id3导入A549细胞,使EGFP-Id3融合蛋白在A549细胞中得到表达,MTT实验、Annexin V/7AAD-FCM凋亡检测以及Hoechst 33258核染色法结果均表明,Id3转基因表达可诱导A549细胞发生增殖抑制和凋亡；②用RNA干扰技术成功构建靶向人Id3基因的miPNA干扰载体(pcDNA/miRId3),体外抑制A549细胞中Id3的表达,可逆转外源性Id3表达对细胞增殖的抑制和致凋亡作用：③将Id3基因克隆至腺病毒表达载体pAxCAwtit,转染293细胞后制备出重组腺病毒Ad-Id3,结果表明,腺病毒介导的Id3转基因表达可以抑制A549细胞增殖。以上结果提示,Id3在A549细胞中转基因表达可诱导细胞增殖抑制和凋亡。Id作为抗肿瘤药物所致凋亡的负性调节子,可望成为增强化疗敏感性的新型治疗靶点。在顺铂诱导肉瘤系MG63细胞凋亡的实验中,Id3的过表达可以增强MG63细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性。有研究表明,Id1不仅作为肺腺癌预后判断的标志分子物质,而且通过下调Idl的表达可以增强肺腺癌放化疗的敏感性,但其具体作用机制目前尚不清楚。Li等发现,通过下调Idl的表达可以增强胃癌细胞MGC803和AGS顺铂耐药的敏感性；同时,Lee也发现在转录水平通过下调p53表达可以负调控PTEN蛋白,从而导致PI3K/Akt/Wnt信号通路的激活,引起细胞增殖的发生,故认为PI3K/Akt信号通路可能参与了Idl的生物学作用,如细胞增殖、抗凋亡侵袭和转移等多种生物学效应。最近研究也发现,Id1和Id3可以作为非小细胞肺癌Ⅲ-N2期患者化疗治疗的预后标志物,这两种蛋白可能在肿瘤治疗方法上发挥不同作用,尤其是肿瘤化疗的治疗上。顺铂是一种细胞周期非特异性的细胞毒性化疗药物,其主要作用靶点是DNA,其主要作用机制是作用于DNA链间及链内交链,形成DDP-DNA复合物,干扰DNA复制或与核蛋白及胞浆蛋白结合,引起癌细胞DNA的复制障碍,使增殖迅速的细胞停滞在G2/M期,诱导细胞凋亡,具有较强的广谱抗癌作用。目前认为抗癌细胞凋亡、损伤修复过程中DNA剪切物的增加、与调控信号通路相关的调节蛋白表达的改变、药物摄取减少导致细胞内DDP浓度降低等均可能与顺铂的耐药有关,然而肺癌细胞对其耐药的机制尚未完全阐明。目前认为肺癌顺铂耐药机制的研究主要在以下几个方面：1、由药物摄取障碍或药物外排增加介导的细胞内药物浓度的降低;2、DNA损伤修复功能的异常；3、细胞解毒功能的增强；4、细胞凋亡的抑制等方面。因此,进一步研究顺铂的耐药机制和寻找新的逆转耐药靶点对于改善肺癌化疗效果提高5年生存率具有重要意义。顺铂抗肿瘤作用的主要机制是诱导肿瘤细胞发生细胞凋亡。体内外研究发现,肿瘤细胞凋亡发生改变主要由于细胞凋亡信号转导通路异常,凋亡相关因子表达异常引起。我们前期研究证明：Id3的过表达可导致A549和A549/DDP细胞发生凋亡。最近研究发现,PI3K/Akt通路是最主要的抗凋亡通路之一,同时也发现PI3K/Akt信号通路在肿瘤耐药方面也发挥着重要作用。因此我们推测：Id3可能通过PI3K/Akt信号通路来调控肺腺癌顺铂耐药的。因此,本课题拟以非小细胞肺癌细胞及其顺铂耐药细胞为主要研究对象,在细胞过表达Id3情况下,分别观察在加入顺铂前后细胞生物学行为及对顺铂耐药的变化,了解Id3是否与肺癌顺铂耐药有关,研究Id3的过表达对细胞顺铂敏感性的影响。在此基础上,初步阐明Id3调控肺腺癌细胞顺铂耐药性的分子机制,为进一步分析Id3能否成为逆转肺腺癌顺铂耐药的分子靶点提供一定的理论基础及实验依据。本研究按以下叁部分进行：第一部分：A549/DDP细胞耐药性分析及细胞内Id3基因和蛋白质表达水平的研究目的：分析A549/DDP细胞对顺铂的耐药性,以及细胞内Id3基因和蛋白的表达水平,为后续实验奠定一定的实验基础。方法：1.采用CCK-8法测定不同浓度的DDP对A549/DDP和A549细胞的生长抑制作用,并计算其半数抑制浓度(IC50)和耐药指数；2.采用RT-PCR、Western Blot方法检测Id3在A549/DDP中mRNA及蛋白的表达水平。结果：1.在体外细胞培养条件下,用不同浓度的DDP处理A549/DDP和A549细胞,24h后用CCK-8实验检测细胞活力,结果发现,DDP在5μg/ml浓度时能显着抑制A549的增殖,对A549/DDP耐药细胞的增殖有一定的抑制作用,但存在较明显的耐受现象,在较高浓度(20μg/ml)时才显示出一定的抑制作用。DDP对细胞的抑制呈浓度依赖性,根据直线回归计算出两株细胞对DDP的半数抑制浓度(IC50),DDP对A549细胞的IC5o为5.32μg/ml,对A549/DDP细胞的ICso为19.38μg/ml,可见A549/DDP细胞对DDP的耐药指数为3.64；2. RT-PCR及Western Blot结果显示,Id3 mRNA和蛋白质在A549/DDP和亲代A549细胞中均呈低水平表达,两株细胞无明显差异。结论：1.DDP对亲本细胞株A549和耐药细胞株A549/DDP的抑制作用呈浓度依赖性；A549/DDP细胞对DDP的耐药指数为3.64；2.Id3在A549/DDP细胞中表达水平低下。第二部分：Id3基因在A549/DDP细胞中的过表达及其逆转顺铂耐药性的作用研究目的：初步探讨凋亡诱导因子Id3对A549/DDP(?)铂耐药性的逆转作用。方法：1.用脂质体LipofectamineTM2000转染技术将Id3表达载体pEGFP/Id3分别导入A549和A549/DDP细胞以及人肺腺癌细胞SPC-A-1,荧光倒置显微镜下观察叁组细胞内EGFP-Id3融合蛋白表达情况,倒置显微镜观察Id3基因表达前后细胞的形态学变化；2.用脂质体LipofectamineTM2000将pEGFP/Id3分别导入A549细胞和A549/DDP细胞,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测Id3 mRNA的表达；3.采用CCK-8法检测Id3基因过表达对A549/DDP细胞耐药性的逆转作用；4.将Id3基因导入A549/DDP,加入不同浓度的DDP (0.0μg/ml,1.0μg/ml, 2.0μg/ml),24h后采用Annexin V-FITC和PI双染法和流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果：1.荧光显微镜下观察,未转染质粒的细胞组中无绿色荧光,转染pEGFP/Id3重组质粒的各组细胞中绿色荧光主要表达于细胞核,转染空载体pEGFP质粒的各组细胞中绿色荧光多表达于全细胞,荧光呈弥漫状,分布均匀,无明显细胞浆及细胞核的差异；2. qRT-PCR结果显示,与空白细胞组及转染空载体pEGFP组相比,转染pEGFP/Id3组A549/DDP细胞中Id3 mRNA表达水平显着升高(P<0.05)；3.CCK-8结果显示,Id3基因导入A549/DDP细胞后,DDP对A549/DDP的半数抑制浓度(ICso)由19.38降至11.71,逆转倍数为1.66倍；4. Annexin V-FITC和PI双染结合流式细胞术测定细胞凋亡率结果显示,与空载体pEGFP对照组相比,转染PEGFP/Id3组A549/DDP细胞凋亡率明显增加(P<0.05),且随DDP浓度的增高凋亡率随之增加,提示Id3基因与DDP对细胞生长的抑制效应具有协同作用。结论：Id3基因与DDP对细胞的抑制效应具有协同作用,Id3基因过表达后耐药的A549/DDP细胞对DDP的敏感性明显增加,细胞凋亡增多,耐药得以部分逆转。第叁部分：Id3逆转A549/DDP顺铂耐药性的作用机制分析目的：探讨Id3逆转A549/DDP顶铂耐药性可能作用机制。方法：1. Western blot法和qRT-PCR法检测A549/DDP细胞中多药耐药蛋白MDR、 RhoE和Bcl-2蛋白表达,以及Akt磷酸化的变化；2.流式细胞术检测A549/DDP细胞多药耐药蛋白MDR含量的变化。结果：1. qRT-PCR法检测结果发现,与对照组相比,Id3基因转染A549/DDP细胞中肿瘤耐药相关基因MDR和Bcl-2 mRNA表达水平明显下调(P<0.05)；2. Western blot法检测结果表明,与对照组相比,Id3转染基因A549/DDP细胞中肿瘤耐药相关基因MDR和Bcl-2蛋白表达水平明显下调,而RhoE的表达量明显升高(P<0.05)；3.Western blot法检测也发现,与对照组相比,Id3基因转染A549/DDP细胞中p-Akt的表达量明显下降(P<0.05),提示Id3可能通过抑制PI3K/AKT信号通路的活性,抑制细胞的增殖,促进其凋亡,从而逆转其耐药性,并且Id3在此通路中具有负向调节作用。4.流式细胞术检测A549/DDP细胞多药耐药蛋白MDR含量的变化发现,与空载体pEGFP转染组相比,Id3转染A549/DDP细胞中MDR蛋白含量降低,差异有统计学意义(P<0.05),与Vestern blot检测结果一致。结论：Id3可逆转A549/DDP对顺铂的耐药性,其机制可能与抑制药物外排,负调控肿瘤耐药相关蛋白的表达,促进细胞凋亡有关。
余梓浦[2]2016年在《miR-204-5p抑制非小细胞肺癌生长的作用及分子机制研究》文中提出背景：肺癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一。由于肺癌病人早期症状不典型,同时缺乏敏感的筛查指标及有效的确诊方法,大多数患者就诊时已处于中晚期,因此失去手术治疗的机会；放疗化疗毒副作用较大,不能高度特异性地杀伤肿瘤细胞；此外由于肺癌容易复发和远处转移,即使在肿瘤完全切除的情况下肺癌患者大多也会死于复发和转移。肺癌的预后难以评估,同一分期、同一组织学类型、采用同一治疗方案的肺癌患者,其治疗效果和远期生存情况会有明显不同。当前国际广泛采用的肺癌TNM分期存在诸多不足,尤其是对于开展肺癌患者个体化的治疗及预后评估等发挥的作用极为有限。近年来,有关microRNA (miRNA)与肺癌特别是非小细胞肺癌(NSCLC)发生发展、诊断治疗的关系备受关注。微小RNA是由约22个核苷酸组成的非编码、小分子单链RNA；具有较高的保守性,几乎存在于所有的真核细胞。深入研究miRNAs在肿瘤发生发展中的作用,将为肺癌的诊治提供新的方案和新的靶点。目的：在非小细胞肺癌患者手术切除的肿瘤标本和癌旁标本组织中用Real Time PCR方法检测miR-204-5p的表达情况。体外实验中根据一系列实验方法鉴定miR-204-5p在肺癌A549和HCC827细胞株中的生物学功能。通过信息学预测软件对miR-204-5p作用靶点进行预测,并用生物学功能实验加以验证。方法：1.在30对配对的肺癌和癌旁组织标本中检测miR-204-5p的相对表达量,对肺癌组织及对照的癌旁组织中miR-204-5p的表达差异进行统计,并分析不同病理分期的肺癌中miR-204-5p的表达情况；2.在BEAS-2B和肺癌细胞A549. HCC827细胞检测miR-204-5p的相对表达量。对肺癌A549和HCC827细胞株进行转染miR-204-5p mimic使细胞过表达miR-204-5p,然后进行相关功能学的实验检测。通过CCK-8、平板克隆形成、流式细胞周期检测和流式细胞凋亡检测、划痕愈合实验和Transwell小室法等方法分析上调miR-204-5p表达后对细胞增殖、细胞凋亡及细胞迁移侵袭等能力的影响；3. miR-204-5p的靶基因通过在线软件进行预测,然后通过Real Time PCR, Western Blot等方法验证靶基因mRNA及蛋白表达量是否发生变化。并用荧光素酶双报告系统对miR-204-5p的靶序列进行鉴定；应用拯救实验(Rescue实验)进一步验证miR-204-5p作用的靶基因。结果：1.收集的30对肺癌和癌旁组织标本中,有27例miR-204-5p相对低表达,比例占90%。癌组织中miR-204-5p表达量平均约癌旁组织的1/2。高分期肺癌与低分期肺癌在miR-204-5p的相对表达量的平均值有差异,但未能有统计学上的显着性意义。2与正常肺组织上皮细胞株BEAS-2B相比,肺癌A549和HCC827细胞株中miR-204-5p呈现为低表达的状态。体外转染miR-204-5p至肺癌A549和HCC827细胞株使miR-204-5p过表达：50nM浓度可以抑制细胞增殖活力；体外平板克隆形成实验表现为抑制细胞克隆形成；细胞周期实验出现G1期阻滞。划痕愈合实验和Transwell小室等实验显示miR-204-5p过表达未能显着减弱A549和HCC827细胞的迁移和细胞侵袭能力,对细胞凋亡无明显影响。3.通过在线软件的预测,分析CCND1可能是miR-204-5p靶基因,通过Real Time PCR和Western Blot实验检测发现在过表达miR-204-5p后靶基因CCND1的mRNA水平和蛋白质水平都显着下调。荧光素酶双报告系统结果证实CCND1是miR-204-5p的直接作用靶点,miR-204-5p调控的作用序列存在于其3'-UTR中。结论：肺癌组织中miR-204-5p是一个抑癌基因,miR-204-5p可以通过靶基因CCND1抑制A549细胞和HCC827细胞的增殖能力。
江中勇, 谢珏, 陈清勇, 周建英[3]2005年在《非小细胞肺癌DNA含量与转移相关基因表达的相关性研究》文中研究表明目的 探讨转移相关基因CD82、CD44和Fas在肺癌中的表达与DNA含量的关系。方法 应用流式细胞仪对45例肺癌患者手术切除的新鲜癌标本中CD82、CD44、Fas蛋白及DNA含量进行检测,并与癌旁对照组(30例)和肺部良性病变组(20例)对照。结果 肺癌组CD82和Fas表达低于癌旁对照组和良性病变组,CD44表达和DI值高于癌旁组和良性病变组。CD82、CD44、Fas表达和DNA含量与肺癌的分期和分级相关。CD82和Fas表达与DI值均呈负相关(r=-0. 674,r=-0. 881,P<0. 01),CD44表达与DI值呈正相关(r=0. 542,P<0. 01),CD82和Fas表达水平与CD44蛋白的表达水平均呈负相关(r=-0. 926,r=-0. 653,P<0. 01)。结论 CD82、CD44、Fas表达及DNA含量在肺癌发生、发展和转移过程中起着不同但又相互调控的作用,联合检测这些指标对预测肿瘤的生长和转移潜能具有一定的指导意义。
王文[4]2012年在《Med19在非小细胞肺癌表达的临床意义及与Ki-67的关系》文中研究表明背景及目的：肺癌是全世界发病率最高的癌症，每年新增患者120万，在我国的大中城市中，肺癌死亡率也高居榜首，非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%以上，尽管临床治疗已取得显着进展，但治愈率仍在15%左右，肺癌的发病机理未明、缺乏有效的早期诊断方法，困扰临床医生。中介体亚单位Med19在人类中的同源基因为肺癌转移相关基因（LCMR1），Med19基因位于11q12.1，是RNA聚合酶Ⅱ通用转录装置的重要组成部分，其主要细胞外作用包括促进转录的激活、增强基础转录、促进CTD（聚合酶大亚基的羟基端结构域Carboxy terminal domain）磷酸化，直接和间接参与调节细胞生长、分化和凋亡的各个过程。今年的研究发现Med19基因在乳腺癌、肝癌、胃癌等多种人类肿瘤中表达增高，大量的研究显示Med19涉及多种肿瘤的发生、发展过程，但目前的研究主要集中在体外研究阶段，临床研究较少，尤其肺癌的临床研究尚属空白。通过检测Med19在非小细胞肺癌组织和癌旁组织中的不同表达和与Ki-67的关系，探讨Med19在肺癌发生、发展中的作用，以及其在肺癌诊断、治疗中的应用前景。方法：本研究随机选择山东省肿瘤防治研究院2010年9月1日至2011年6月31日行根治性或姑息性切除且临床病理资料完整的原发肺腺癌和肺鳞癌患者，共56例，取其肺癌组织标本，同时取癌旁组织标本做对照组，应用real-time PCR测定其中的Med19mRNA情况，免疫组织化学法检测其中Med19和Ki-67蛋白的表达情况，用统计学方法分析Med19和Ki-67蛋白的表达和各种临床病理特征，包括年龄、性别、病理类型、组织学分级、淋巴结转移、临床分期（根据国际抗癌联盟2003TNM分期）的关系，探讨Med19蛋白在非小细胞肺癌表达的临床意义及与Ki-67的关系，为Med19成为肺癌治疗的潜在靶点提供依据。结果：NSCLC肺癌组织中的Med19mRNA表达明显高于配对的癌旁正常组织，癌旁组织Med19蛋白的阳性表达率仅1.8%，与癌旁组织相比，癌组织中Med19蛋白表达强度明显增加，且以细胞浆着色为主，阳性表达率80.4%。癌组织Med19阳性率显着高于癌旁组织(P<0.05），提示Med19蛋白表达与肺癌发生有关。Med19蛋白表达与NSCLC患者临床分期和淋巴结转移有关(P<0.05），但与其他临床病理参数如年龄、性别、病理类型和组织学分级无关(P>0.05），癌组织中Med19蛋白和与Ki-67蛋白表达呈正相关的关系。结论：Med19与肺癌细胞的异常核分裂密切相关，Med19蛋白表达增强提示肺癌恶性程度增高及转移活性增强，Med19参与了肺癌发生、发展的不同时期，有望成为肺癌临床诊断、分期的重要依据，并可作为新的肿瘤治疗靶点。
徐恩五[5]2016年在《LncRNA DB327252在非小细胞肺癌中的表达及促进肺癌细胞增殖的机制研究》文中提出研究背景与目的：肺癌是世界上发病率和死亡率最高,增长最快的恶性肿瘤之一,严重威胁着人类的健康和生命。2016年1月25日,全球癌症领域顶级杂志--《CA：临床医师癌症杂志》(CA Cancer J Clin)在线发表了国家癌症中心公布的2015年癌症统计数据显示：2015年中国癌症总发病429.16万例,总死亡281.42万例,其中肺癌的发病率最高,并且肺癌的死亡率也排在各种不同类型肿瘤之首。据统计,2015年全国肺癌发病73.33万,死亡61.02万。虽然在肺癌的诊断和治疗上取得了长足的进步,然而肺癌的5年生存率仍然低于15%。究其原因,一方面限于目前对肺癌的发生、发展及转移等机制还不是非常明确,同时缺乏有效、敏感的早期诊断、监测等指标,患者就诊时往往已经是肿瘤晚期,这是导致患者预后不良的主要因素；另一方面,目前肺癌的治疗手段除了手术以外,常规的放／化疗有效率不高,虽然靶向药物的临床应用使得肺癌的治疗取的比较瞩目的进展,但是如何提高药物治疗的有效率,解决化疗及靶向药物治疗过程中出现的耐药问题,仍然是当前肺癌治疗过程中亟需解决的一个问题。已有的研究表明,基因表达和基因调控异常可能是恶性肿瘤发生、发展的内因和基础,通过对肺癌发生机制进行深入探讨,寻找可能存在的与肺癌生物学活性相关的生物学标记物,探讨其作用于肺癌发生、发展的机制,从而做到对肺癌治疗的有的放矢。在早期的肿瘤研究中,人们的注意力主要集中在蛋白编码基因在肺癌发病机制上的研究。上世纪末进行的人类全基因组研究发现,在人类基因组的转录本当中,大约只有2%的基因具有编码蛋白能力,与此同时,90%以上的基因并不具备编码蛋白的能力,他们往往被转录成非编码RNA (non-coding RNA, ncRNA),这些ncRNAs发挥的基因调控作用在肺癌的发生、发展过程中发挥着重要的作用。依据核苷酸的长度,我们把ncRNA又分为两大类：分别为核苷酸长度少于200nt的短链非编码RNA和核苷酸长度大于200nt的长链非编码RNA (lncRNA)。在相当长的一段时间里,人们一度对短链ncRNA的研究比较多,研究结果也提示了短链非编码RNA与宿主基因之间的相互调控作用在肿瘤演变的过程中扮演着重要的角色。随着近几年对lncRNA的研究不断深入,越来越多的研究提示lncRNA与短链RNA在肿瘤的演变过程中,发挥着类似的调控基因功能的作用。lncRNA一度曾被认为仅仅是RNA聚合酶Ⅱ转录时的副产物,是基因转录时的“噪音”和“垃圾”,并不具有特定的生物学功能,是一个“暗物质”。然而,随着这些年的研究发现,lncRNA在多种类型肿瘤细胞(包括乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤等)的增殖、克隆、凋亡、侵袭、转移以及药物耐药等方面均发挥着重要的过程,至此,lncRNA的面纱才逐步揭开。随着研究的逐步深入,越来越多的lncRNA在基因调节等方面的功能被揭示出来。在已完成的一些关于1ncRNA与肺癌关系的研究中,提示lncRNA通过干扰蛋白编码基因表达、介导染色质重构和蛋白修饰、干扰nRNA的剪切、调控基因表达水平、调节响应单白活性、改变蛋白的胞质定位等机制参与肺癌细胞的增殖、侵袭转移、凋亡以及细胞耐药等一系列过程。但总体来说,lncRNA的调控作用概括起来主要在叁个层面实现,分别为：转录调控、转录后调控和表观遗传学调控。为了更好的了解lncRNA在非小细胞肺癌转化过程中的作用,我们收集了广州军区广州总医院胸外科2014年1月到2014年6月临床上符合本研究的83例原发性非小细胞肺癌的标本及其癌旁组织(>5cm),通过基因芯片进行筛选,发现一些在肺癌组织与癌旁组织中表达有差异的LncRNA,并在其中挑选出表达差异比较大的lncRNA DB327252作为本课题的研究对象,通过与所收集的标本的临床病理资料进行比较,探讨lncRNA DB327252的表达与临床特征之间的关系。进一步的研究是通过选择lncRNA DB327252表达水平比较高的肺癌A549&16HBE-T细胞作为研究对象,构建干扰序列siRNA,通过转染沉默A549及16HBE-T细胞株中的DB327252的表达,观察目的基因沉默后在细胞周期、凋亡、侵袭能力、迁移能力等方面发生的变化,进一步构建shRNA质粒稳定表达载体,通过体外软琼脂集落实验及裸鼠体内成瘤实验,观察lnc DB327252表达与肿瘤生长之间的关系。方法1.肺癌组织样本采集收集2014年1月至2014年6月期间,中国人民解放军广州军区广州总医院胸外科进行的肺癌根治手术或肺癌姑息性切除手术患者的肺癌原发病灶的肿瘤组织及癌旁组织标本(要求癌旁组织距癌中心组织距离>5cm),选取符合本研究要求的83例原发性肺非小细胞肺癌标本进行研究,标本要求在术前未进行过放化疗及免疫、靶向治疗,同时收集肿瘤样本患者的一般临床信息和详细的病理资料,建立随访数据库。生物标本的收集符合无菌的原则,并征得患者本人同意及广州军区广州总医院伦理委员会的批准。2.细胞系及培养方法通过购买或受赠获得正常人类支气管上皮细胞株BEAS-2B、16HBE-N;肺癌细胞株A549、H1299、H446、H460以及通过恶性诱导转化成的16HBE-T细胞株,使用含有10%的胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)和1%青链霉素混合液(100IU/ml青霉素,100ug/ ml链霉素)的MEM培养基(Modified Eagle's Medium,美国HyClone公司)或RPMI-1640培养基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)进行培养,置于37℃,5 %(v/v) CO2,饱和湿度的恒温培养箱中。3.总RNA提取及qRT-PCR分析应用Trizol法提取组织细胞总RNA,应用荧光染料法(SYBR Green II)进行基因芯片实验,检测1ncRNA的表达含量,并通过实时定量(qRT-PCR)检测各细胞株中的lncRNA DB327252的表达水平,并筛选出表达比较高的细胞株作为进一步实验研究的对象。4. SiRNA干扰序列的瞬时转染 制备lncRNA DB327252 siRNA/ Lipofectamine-2000复合物,依照转染说明书中的步骤对A549、16HBE-T细胞进行转染,用qRT-PCR对干扰的效果进行定量分析,分别在4Onmol/L浓度下和转染48h后进行观察,筛选出干扰效率最高的siRNA (>70%)进行下一步研究。5.细胞增殖能力检测将适量细胞接种于96孔板上,分别于转染后6 h、12h、24h、48h和72h进行检测,用CCK-8 (Cell Counting Kit-8)试剂盒检测A549/siRNA、16HBE-T/siRNA细胞增殖能力。全自动酶标仪检测各组样品吸光值,根据细胞增殖率计算公式,计算出细胞活力。6.平板克隆情况检测取对数生长期细胞,接种于6孔板,接种14天后观察,当肉眼可见细胞克隆时终止实验,用0.1%结晶紫染色,计算克隆形成率。7.细胞周期情况检测6孔板接种细胞后无菌抗菌素培养基37℃, 5％CO2培养24h后转染siRNA,48h后收集细胞并用70%乙醇固定,-20℃过夜,再用PI染色,通过流式细胞仪检测各细胞周期细胞的分布情况。8.细胞凋亡检测将适量细胞接种于6孔板,培养基37℃,5%C02培养24h后转染siRNA,48h后收集细胞,洗涤、固定、透化,按照Annexin V-FTIC/PI试剂盒说明书步骤对细胞进行染色,应用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。9.体外侵袭实验转染24h后,用胰酶消化并制成单个细胞悬液,于每孔5×104个细胞的密度接种于Tanswell用的24孔板的上室,将500ul含20%FBS的DMEM培养基加入小室下层,培养24h后计算细胞侵袭率。10.细胞划痕实验细胞转染24h后,待细胞生长至100%汇合时,用枪头垂直在平板上划线。把脱落的细胞冲洗干净,37℃培养基培养24h,每6h显微镜下检测一次,并拍照记录,计算细胞生长覆盖区面积比。11.软琼脂实验6孔板每孔先铺好含2ml 0.6%底层琼脂,再于每孔加2 ml含细胞混合液(细胞浓度1×104个/ml)的0.3%低熔点琼脂糖,配置成上层琼脂,培养箱培养21天后,计算细胞克隆数(>50个细胞)。12.建立稳转细胞株用500ug/ml的G418筛选培养浓度,Lipofectamine-2000转染shRNA,24h后细胞传代,继续培养,10-14天左右挑选单克隆细胞,制备成悬液并进行计数。继续培养,等待细胞大量扩增以后,提取细胞总RNA,采用荧光定量检测的办法检测目的基因的表达是否下降。13.裸鼠成瘤实验用PBS把已用胰酶消化的细胞洗涤两遍后重悬,于4周龄的BALB/c裸鼠腹股沟皮下注射分别注射约150μ1含5×106个细胞的细胞悬液,两侧腹股沟分别注射siRNA-nc和shRNA细胞作为对比。注射后每人观察裸鼠的精神状态、反应、饮食、活动力、毛色、毛顺滑度及腹股沟皮下肿瘤的生长的情况,记录成瘤的潜伏时间。成瘤后隔天应用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)、短径(b),28天后将裸鼠处死,解剖取出肿瘤,电子称称重。14.统计分析采用SPSS 20.0软件对测量的数据进行统计分析。所有的试验数据均至少重复3次测量,数据以x±s表示。计数资料两组间的比较用双侧t检验,3组资料的比较采用单因素的方差分析,取p<0.05为差异有统计学意义。结果1.基因芯片检测结果提取83例非小细胞肺癌组织及其癌旁组织细胞的总RNA,应用基因芯片进行筛选,发现lncRNA DB327252的表达水平明显高于癌旁组织,统计学有明显差异(p<0.05)。2.LncRNA DB327152表达与肺癌临床特征的关系以中位数的LncRNADB327152表达水平(M=4.39)为界点,将临床资料分为高表达组(>4.39)和低表达组(<4.39),通过比较发现,DB327252的高表达与患者的性别、年龄、淋巴结转移不相关(P>0.05),与吸烟(p=0.045)、组织学类型(p=0.023)、肿瘤大小(p=0.037夕以及TNM分期(p=0.002)相关,其中吸烟组人群中DB327152表达高于非吸烟组人群,腺癌组的表达水平明显高于非腺癌组,≥3cm肿瘤组的表达水平高于<3cm肿瘤组,TNM/Ⅱ-Ⅳ期中的表达明显高于TNM/I期中的表达水平。3.LncRNA DB327152在不同细胞株的表达水平与正常人类的支气管上皮细胞株BEAS.2B细胞相比较,16HBE-N是BEAS-2B的(1.184±0.137)倍,差异无统计学意义(P>0.05)；16HBE-T、A549、H1299、H446、H460分别是BEAS-2B的(16.259±1.209)倍、(20.596±1.81)倍、(17.009±0.890)倍、(16.088±2.002)倍、(12.496±0.907)倍,差异均有统计学意义(p<0.05),提示在恶性肿瘤细胞中,ncRNA DB327152普遍高表达。4.筛选siRNA分别用1个阴性对照序列(siRNA-nc)和4个siRNA序列 (siRNA-1.siRNA-2.siRNA-3.siRNA-4)转染,来下调目的基因的表达,并检测转染后的干扰效果。结果发现在A549细胞株中,siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4的干扰效率分别达到66%、77%、58%,差异有统计学意义(p<0.05)；在16HBE-T细胞株中,siRNA-2、siRNA-3的干扰效率分别达到65%、67%,同样差异有统计学意义(p<0.05)。5. lncRNA DB327252对细胞增殖的影响A549细胞株中,与空白组相比,转染阴性对照组siRNA-nc的细胞存活比例为(99.15±2.87)%,差异无统计学意义(P>0.05),可将siRNA-nc作为标准。将siRNA-2组、siRNA-3组细胞与siRNA-nc进行比较,发现siRNA-2组、siRNA-3组细胞的存活比例分别降至(36.20±1.88)%、(34.17±2.27)%,差异均有统计学意义(p<0.05);在16HBE-T细胞株中,与空白组相比,siRNA-nc组细胞存活比例为(96.21±1.2)%,差异无统计学意义(P>0.05),与siRNA-nc组相比,siRNA-2组、siRNA-3组细胞的存活比例分别降为(37.32±5.41)%、(39.00±1.72)%,差异均有统计学意义(p<0.05),提示lnc RNA DB327252的表达下调,A549/siRNA-2、A549/siRNA-3、 16HBE-T/siRNA-2、16HBE-T/siRNA-3细胞的增殖受到明显抑制。6.平板克隆检测 观察染色后>50个细胞的克隆数,经过计算,得出A549/siRNA-1、siRNA-2克隆形成率与A549/siRNA-nc相比,差异有统计学意义(p<0.05)；同样,16HBE-T/siRNA-1、siRNA-2的克隆形成率与16HBE-T/ siRNA-nc相比,差异有统计学意义(p<0.05),提示lncRNA DB327252的表达下调,A549/siRNA-2、A549/siRNA-3、6HBE-T/siRNA-2、16HBE-T/siRNA-3细胞的克隆能力下降。7. lncRNA DB327252对细胞周期的影响应用流式细胞仪对PI染色后的细胞进行检测发现,在A549/siRNA细胞株中,与siRNA-nc组相比,siRNA-2组中G0/G1细胞的比例上升至80.7%,差异有统计学意义(p <0.05)；siRNA-3组G0/G1细胞的比例上升至81.3%,差异有统计学意义(p<0.05)。在G2/M期中,siRNA-2组和siRNA-3组的比例分别降至5.61%、7.87%,但差异无统计学意义(P>0.05);在S组中, siRNA-2组和siRNA-3组的比例分别降至13.72%和10.88%,差异均无统计学意义(P>0.05);16HBE-T/siRNA细胞株中,与siRNA-nc组相比,siRNA-2组中G0/G1细胞的比例上升至84.22%,差异有统计学意义(p<0.05);siRNA-3组G0/G1细胞的比例上升至83%,差异有统计学意义(p<0.05)。在G2/M期中,siRNA-2组和siRNA-3组的比例分别降至6.85%、7.20%,但差异无统计学意义(p>0.05);在S组中,siRNA-2组和siRNA-3组的比例分别降至8.93%和9.80%,差异均无统计学意义(p>0.05)。说明lncRNA DB327252表达下调,位于细胞周期中G0/G1期的比例增高,肿瘤生长受到抑制。8.lncRNA DB327252对细胞凋亡的影响A549/siRNA-1、siRNA-2凋亡率与A549/siRNA-nc相比,差异无统计学意义(p>0.05);16HBE-T/siRNA-1、 siRNA-2凋亡率与16HBE-T/siRNA-nc相比,差异无统计学意义(p>0.05),提示lncRNA DB327252基因在调节NSCLC细胞演变过程可能与细胞的凋亡无关。9. IncRNA DB327252对细胞侵袭能力的影响 转染处理24h后,A549/siRNA-1、siRNA-2组细胞的侵袭能力降低,但与A549/siRNA-nc相比,差异无统计学意义(p>0.05); 16HBE-T/siRNA-1、siRNA-2组细胞的侵袭能力也降低,与16HBE-T/siRNA-nc相比,差异无统计学意义(p>0.05)。10. IncRNA DB327252对细胞迁移能力的影响A549/siRNA-1、siRNA-2组划痕间距与原间距之间的比值与A549/siRNA-nc相比,差异无统计学意义(p>0.05);16HBE-T/siRNA-1、siRNA-2组划痕间距与原间距之间的比值与16HBE-T/siRNA-nc相比,差异无统计学意义(p>0.05)。11.软琼脂集落实验在A549细胞株中,与shRNA-nc组集落的形成率(64.93±5.10)%相比,shRNA转染沉默组的软琼脂集落形成率显着降低至(23.60±5.05)%,差异有显着的统计学意义(P<0.01);16HBE-T细胞株中,与shRNA-nc组集落的形成率(67.73±6.56)%相比,shRNA转染沉默组的软琼脂集落形成率显着降低至(34.80±6.06)%,差异有显着的统计学意义(P<0.01)。12.裸鼠成瘤实验将shRNA和shRNA-NC转染的A549和16HBE-T细胞分别注射到裸鼠腹股沟两侧的皮下,通过观察,A549/shRNA稳转组的肿瘤生长速度要慢于shRNA-NC组,P<0.05；同样,16HBE-T/shRNA稳转组的肿瘤生长速度慢于shRNA-NC组,P<0.05差异均有统计学意义。A549/shRN A组的肿瘤体积明显低于A549/shRNA-nc组(667.32±41.35 mm3 vs 1691.45±44.70 mm3),差异有明显的统计学意义(P<0.05)。重量A549/shRNA对比A549/shRNA-nc组(233.2±86.37mg vs 448.2±120.8mg),差异有统计学意义(P<0.05); 16HBE-T/shRNA组肿瘤体积也低于16HBE-T/shRNA-nc组(633.18±46.75 mm3 vs 1448.20±85.69 mm3),差异有统计学意义(P<0.05),重量16HBE-T/shRNA 对比 16HBE-T/shRNA-nc组(267.3±74.86mg vs 391.4±86.61mg),差异具有统计学意义(P<0.05)。提示：DB327252基因表达下调后,体内试验中肿瘤的成瘤速度及成瘤体积及重量均出现了下降,说明了肿瘤的生长减慢。结论1. LncRNA DB327252在非小细胞肺癌组织中呈高表达状态,具有类癌基因的功能,与非小细胞肺癌恶性程度增加相关。2. LncRNA DB327252的表达水平在性别、年龄、淋巴结转移上无统计学差异(P>0.05),在吸烟、病理组织学类型、肿瘤大小、TNM分期上的差异具有统计学意义(P<0.05),在吸烟组、腺癌组、肿瘤≥3cm组、TNM分期Ⅱ-Ⅳ期组中呈现高表达。3. LncRNA DB327252 ± A549、H1299、H446、H460及16HBE-T细胞株中均呈现高表达状态,具有恶性的生物学活性；4. LncRNA DB327252主要通过调控A54、16HBE-T细胞增殖和影响肿瘤细胞周期来促进肿瘤的转化过程;5.体外细胞软琼脂实验及裸鼠体内成瘤实验证实LncRNADB327252在促进肿瘤生长方面发挥着重要的作用。
梁祥森[6]2012年在《实时荧光定量PCR联合检测非小细胞肺癌中MTA1和E-cad基因的表达及意义》文中研究表明目的探讨肿瘤转移相关蛋白1(MTA1)和E-钙黏蛋白(E-cadherin, E-cad)在人非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其意义。方法采用实时荧光定量PCR (Q-PCR)联合检测40例(?)NSCLC组织、12例癌旁组织、12例良性病变肺组织中MTA1和E-cad mRNA表达的相对水平,分析他们的表达与临床组织病理学特征的关系。结果①MTA1mRNA在NSCLC中平均表达水平高于癌旁和良性疾病组织(P<0.05)。②E-cad mRNA在NSCLC中平均表达水平低于癌旁和良性疾病组织(P<0.05)。③在NSCLC中MTA1mRNA和(?)E-cad mRNA的表达呈负相关(r=-0.561,P<0.05)。④在癌旁组织和良性疾病组织中MTA1mRNA和E-cad mRNA的表达无统计学差异(P>0.05)。⑤MTA1mRNA和E-cad mRNA表达水平与淋巴结转移及临床分期均有关(P<0.05),与患者年龄、性别、吸烟史、病理类型、分化程度等均无关(P>0.05)。结论MTA1高表达与NSCLC浸润转移呈正相关,E-cad表达的下调或缺失与NSCLC侵润转移呈负相关,MTA1和E-cad的表达在NSCLC中呈负相关,他们的表达与肺癌关系密切,联合检测NSCLC中MTA1和E-cad的表达情况,可用于非小细胞肺癌预后评估。
佚名[7]2004年在《肿瘤生物标志物与肿瘤转移》文中研究指明14—3—3zeta蛋白对肿瘤转移抑制作用的探讨陈惠华’王妍徐元基杜芝燕陆应麟军事医学科学院基础医学研究所,北京,100850 摘要目的:探讨14—3—3zeta蛋白与肿瘤转移的关系。, 方法:通过联合抑制消减杂交和基因芯片技术筛选在肺巨细胞癌高、低转移株中表达水平存在显着差异的序列,其中一条与14—3—3zeta高度同源。在RNA和蛋白水平对其表达水平进行验证;构建14—3—3zeta的正反义真核表达载体并分别转染肺巨细胞癌高、低转移株;并对转染后细胞的增殖能力、黏附能力以及迁移能力等生物学行为进行研究。
窦恒利[8]2016年在《Let-7c和APRIL在非小细胞肺癌（NSCLC）发生发展中的作用及其初步分子机制研究》文中指出目前在中国,肺癌导致的死亡率已高居肿瘤病死率的首位。肺癌在组织学上分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)两大类,其中NSCLC导致的死亡率远高于小细胞肺癌,约占80%。近年来,虽然NSCLC的诊断及治疗技术取得了巨大进展,但其5年生存率仍较低(约15%左右)。Micro RNAs是一类广泛存在于动植物体内高度保守的非编码单链RNA,只有18-25个核苷酸长度。Micro RNAs主要通过影响信使RNA(m RNA)的转录,调节基因的翻译和表达,发挥其调控作用。Micro RNAs调节m RNA的转录作用主要表现为:1.通过转录后基因沉默;2.通过抑制靶向m RNA翻译或分裂过程。近10余年来许多研究表明micro RNA在肿瘤生长、增殖和转移中发挥着重要作用;同时micro RNA在组织、血浆、粪便及其它体液中表达稳定,即使是小样本量标本也能进行定量检测,这说明micro RNA可以作为肿瘤诊断和判断预后的潜在生物学标记物。Let-7是在秀丽隐杆线虫研究中被发现的,是继lin-4之后被确立的第二个micro RNA。目前Let-7有13种家族成员已明确基因序列。有研究证实在多种肿瘤(前列腺癌、卵巢癌、肺癌等)的发生、发展和预后中,Let-7呈现低表达,而且恢复其表达后可靶向作用于多种癌基因(Ras、C-myc和HMGA2等),起到抑制肿瘤生长的作用。Let-7c是Let-7家族成员之一,位于21q11.21。多项研究认为Let-7c是一类肿瘤抑制因子,在多种人类肿瘤中表达水平下调或缺失,但关于Let-7c在NSCLC中的作用机制探讨还缺乏大样本高通量的研究。APRIL,即增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand),属肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族配体成员,编码基因位于染色体的17p13.1,发现于上世纪90年代末。APRIL在健康人组织中表达相对很弱,但在多种肿瘤组织(结肠癌、胰腺癌和胃癌)和正常免疫细胞(B细胞、单核细胞、巨噬细胞、DC细胞等)中都有高丰度表达。目前已研究确认的两个主要的APRIL特异性受体为TACI(transmembrane activator and CAML interactor,人跨膜蛋白活化物及钙调亲环素配体相互作用分子)、BCMA(B-cell maturation antigen,B-细胞成熟抗原),APRIL与之结合后发挥促进肿瘤细胞的增殖、分化、转移扩散,调节体液免疫,参与B、T淋巴细胞增殖和活化等功能。有研究发现,APRIL及其受体BCMA、TACI在非小细胞肺癌中均具有较高的表达水平,同时在A549细胞中APRIL能够激活MAP激酶。这些研究结果提示,APRIL及其受体BCMA、TACI可能参与到肺癌形成及增殖的调控机制中。本研究的主要目的是通过研究mi R-Let-7c、APRIL在NSCLC肿瘤、癌旁组织及外周血中的表达情况,同时比较mi R-Let-7c、APRIL及其相应受体BCMA和TACI表达情况与NSCLC患者临床病例特征之间的关系,通过体外实验检测APRIL及其相应受体BCMA和TACI对肺癌细胞系增殖、迁移及信号转导途径的影响,以期探寻mi R-Let-7c、APRIL在NSCLC中的作用机制,并为这两者是否可作为NSCLC诊断或预后判断生物学标志物提供理论基础。第一部分Let-7c降低在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的临床意义及其诊断价值研究方法(1)采用病例对照研究,收集76名手术切除的NSCLC患者癌及癌旁组织,手术前后血浆样本和180名健康对照血浆样本。(2)采用q RT-PCR方法,检测Let-7c m RNA在NSCLC组织、癌旁组织及外周血的表达水平。(3)采用q RT-PCR方法,检测Let-7c m RNA在NSCLC患者手术前后及健康对照血浆中的表达水平。(4)检测A549和H1650细胞中let-7c表达水平,转染let-7c mimics以恢复A549和H1650细胞let-7c的表达。MTS、细胞划痕和CCK8实验评价let-7c对NSCLC细胞增殖和细胞周期的影响。(5)统计学处理:所有实验数据采用SPSS19.0进行统计处理,每组实验重复叁次,取(?)±SD进行计算处理。P<0.05被认为具有统计学意义。结果(1)76例NSCLC患者癌组织较癌旁组织mi R-Let-7c的表达显着下降(P<0.05)。(2)组织标本中mi R-Let-7c的表达,与NSCLC患者的病理分期、分化程度及淋巴结转移相关,且有统计学意义(P<0.05)。(3)与健康对照组相比,NSCLC组血浆mi R-Let-7c表达明显下调(P<0.05)。(4)NSCLC患者血浆中mi R-Let-7c表达与患者淋巴结转移及分化程度有显着相关性。(5)mi R-Let-7c的诊断敏感度和特异性分别为72%和78%,血浆中mi R-Let-7c在NSCLC的诊断准确率ROC曲线分析显示,AUC面积为0.714。(6)NSCLC患者手术前血浆mi R-Let-7c表达水平较术后显着下降。(7)A549和H1650细胞中let-7c呈低表达,转染恢复A549和H1650细胞中let-7c的表达后,细胞的增殖受到抑制。第二部分非小细胞肺癌(NSCLC)患者中APRIL、BCMA和TACI临床意义及其可能分子机制探讨方法(1)采用免疫组织化学方法检测76例NSCLC患者癌组织及癌旁组织中APRIL及其相关受体TACI和BCMA蛋白的表达。(2)将BCMA-TACI-sh RNA质粒瞬时转染H1299和A549细胞株,空质粒作为阴性对照,用细胞划痕法检测可溶型APRIL对H1299、A549肺癌细胞生长迁移影响。(3)采用sh RNA干扰技术敲除H1299和A549肺癌细胞系BCMA和TACI基因表达,用CCK-8方法检测sh RNA干扰后H1299和A549肺癌细胞体外培养增殖情况。(4)采用q RT-PCR方法检测NSCLC患者及正常对照组外周血中APRIL、BCMA及TACI m RNA的表达水平。(5)采用sh RNA干扰技术敲除H1299和A549肺癌细胞系BCMA和TACI基因表达,用Western blot方法检测APRIL作用于干扰后的A549和对照组细胞后,对MAP激酶ERK1/2信号磷酸化作用的影响。结果(1)免疫组化结果显示,APRIL反应活性主要定位于细胞胞浆中。76例肺癌组织中APRIL的阳性表达率为71.7%(54/76)高于癌旁正常组织的阳性表达率10.5%(8/76),且两者具有显着性差异(P<0.05)。(2)免疫组化APRIL蛋白表达阳性率与NSCLC临床病理参数之间的相关性分析结果显示:APRIL蛋白的表达水平与NSCLC患者临床病理特征中的性别、年龄、组织学分类没有相关性(P>0.05),但与淋巴结转移、肿瘤大小、肿瘤分化程度存在密切相关性(P<0.05)。(3)免疫组化BCMA蛋白表达阳性率在NSCLC患者中显着升高(P<0.05),与临床病理参数之间的相关性显示:BCMA蛋白的表达与NSCLC患者的年龄、性别、肿瘤组织学分类、肿瘤大小、肿瘤分化程度无关(P>0.05),但与淋巴结转移存在密切相关性(P<0.05)。(4)免疫组化TACI蛋白表达阳性率在NSCLC患者中显着升高(P<0.05),与临床病理参数之间的相关性显示:TACI蛋白的表达与NSCLC患者的年龄、性别、淋巴结转移、肿瘤大小、肿瘤分化程度无关(P>0.05),但与肿瘤组织学分类存在密切相关性(P<0.05)。(5)可溶型APRIL蛋白能促进H1299和A549细胞的迁移,但对于BCMA和TACI基因干扰的H1299和A549细胞,APRIL蛋白并不能提高其细胞迁移能力。(6)BCMA和TACI基因表达干扰后的肺癌细胞系H1299和A549,与对照组相比,A549细胞生长24h后细胞增殖能力显着下降(P<0.05);而H1299细胞则在生长48h后细胞增殖能力显着下降(P<0.05)。(7)q RT-PCR结果显示:NSCLC患者外周血中APRIL m RNA的表达水平高于正常对照组,具有显着性差异(P<0.05)。与临床病理特征分析结果显示:APRILm RNA表达水平与NSCLC患者年龄、性别、病理类型、癌症分期无关(P>0.05),与淋巴结转移、分化程度有关(P<0.05)。而APRIL相关受体TACIm RNA表达水平与淋巴结转移、分化程度有关(P<0.05),BCMA m RNA表达水平则未见与NSCLC患者临床病理特征有显着相关性。(8)可溶型APRIL蛋白可使A549细胞ERK1/2的磷酸化水平升高,且显着高于正常对照组(P<0.05),而对于BCMA和TACI基因表达干扰的A549细胞系,APRIL不能提高其ERK1/2的磷酸化水平。(9)外周血中mi R-Let-7c、APRIL m RNA实时定量RT-PCR联合检测,对于诊断NSCLC的敏感度为59.21%(45/76),特异性为82.22%(148/180)。结论(1)NSCLC患者肿瘤组织及外周血中mi R-Let-7c的低表达与NSCLC的发展和侵袭有密切关系。(2)外周血中mi R-Let-7c可能成为NSCLC诊断、转移及预后的生物学标记物。(3)NSCLC患者组织中APRIL及其相关受体TACI、BCMA的高表达与肿瘤的发展、浸润和转移有关。(4)APRILm RNA在NSCLC患者外周血中高表达,且与肿瘤发展、浸润相关,提示可以作为NSCLC诊断及判断预后的生物学标记物。(5)体外实验结果提示,可溶型APRIL蛋白可促进肺癌细胞增殖,可能参与NSCLC肿瘤的发生和发展,并以激活MAP激酶ERK1/2磷酸化信号转导途径来促进肿瘤细胞增殖。(6)外周血mi R-Let-7c、APRILm RNA实时定量RT-PCR联合检测将有助于提高NSCLC诊断的敏感性。
刘桂芝[9]2007年在《血浆RASSF1A和p16基因高甲基化对非小细胞肺癌的诊断价值》文中研究说明前言肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，且发病率和死亡率居高不下。肺癌患者生存率的提高在于早期诊断和及时适当的治疗，而早期诊断是关键。由于患者出现临床症状和检查发现肿块形成多已进入中晚期，故寻找与肺癌发生相关的肿瘤标志物被认为是早期诊断的有效方法。近年来的研究发现，正常人血浆中存在少量游离DNA。肿瘤患者不仅血浆中游离DNA含量增多，而且能在一定程度上反应肿瘤细胞的某些生物学特点，如甲基化、畸变等。血浆取材方便，相对无创，患者易于接受，故血浆肿瘤标志物检测，可能有利于肺癌的早期诊断。RASSF1A是新近发现的候选肺癌抑癌基因，定位于3p21.3。研究表明，90％以上的小细胞肺癌及50％～80％的非小细胞肺癌该区域纯合性或杂合性丢失，据此推测，该基因可能是对肺癌特异的一种抑癌基因。国外已有的研究表明，RASSF1A在肺癌等肿瘤中存在较高的缺失率，其表达失活的主要原因是启动子区CpG岛的高甲基化，国内此类研究甚少。p16又称多肿瘤抑制基因，定位于9p21，在肺癌组织中频繁失活，与肺癌的发生、发展关系密切。该基因在肺癌中失活的主要原因也是启动子区高甲基化，且这种甲基化改变能在癌症患者的血浆游离DNA中探知。肺癌的发生、发展和转归是一个极其复杂的多阶段、多因素调控异常的过程，而抑癌基因甲基化改变是肿瘤发生的早期分子事件。假如中国人肺癌中两基因也存在一定的缺失率，其表达失活的主要原因也为启动子CpG岛甲基化，而这种改变又能在肺癌患者的血浆游离DNA中检测到，且血浆游离DNA能够较好的反应肺癌组织中两基因甲基化状态，那么，联合检测血浆游离DNA中两基因CpG岛甲基化将有利于肺癌的早期诊断。RASSF1A的抑癌机制尚不清楚。借助比较蛋白质组学研究方法，可以观察RASSF1A失活后引起的效应和调节蛋白的变化，更加深入了解RASSF1A的作用和探讨抑癌机制。目的1．检测中国人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)组织中RASSF1A和p16基因失活和启动子CpG岛高甲基化情况，探明两基因在NSCLC中失活的主要机制；分析NSCLC患者血浆游离DNA中RASSF1A和p16基因启动子CpG岛高甲基化与癌组织中两基因甲基化的相关性，探索联合检测血浆中两基因异常甲基化用于NSCLC诊断的价值。2．建立RASSF1A表达或表达缺失的两类不同肺腺癌组织中蛋白质双向电泳凝胶图谱，并从中筛选差异显示蛋白质点，质谱鉴定出差异显示蛋白，通过差显蛋白功能分析，为进一步研究RASSF1A的抑癌途径奠定初步基础。材料与方法1．研究对象与分组以96例NSCLC患者的癌组织和血浆为研究对象，以相匹配的远癌正常肺组织、12例肺良性病变患者和20例健康志愿者的血浆为对照。2．研究方法2．1 NSCLC组织中RASSF1A和p16基因表达失活情况研究2．1．1 RASSF1A和p16基因转录观察从NSCLC组织和相配的远癌正常肺组织中提取总RNA逆转录合成cDNA，以此cDNA为模板PCR扩增RASSF1A和p16基因片断，观察两基因的转录情况。结合病人的临床资料和肿瘤病理特征分析，卡方检验比较两基因转录失活与NSCLC患者临床资料和肿瘤病理特征的关系。2．1．2 RASSF1A表达观察从NSCLC组织和相配的远癌正常肺组织中提取总蛋白，BradFord法测定样品的蛋白质浓度，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。转膜后，抗原抗体反应，DAB试剂盒显色，观察RASSF1A的表达情况。2．2 NSCLC患者血浆与组织中RASSF1A和p16基因启动子甲基化研究2．2．1组织和血浆DNA的提取和修饰按照组织和血浆DNA提取试剂盒说明，分别提取患者肿瘤组织、远癌正常肺组织和血浆DNA，以及良性肺部疾病和健康自愿者的血浆DNA，紫外分光光度计下定量。用CpG岛甲基化酶(M．SssⅠ)修饰50μg胎盘DNA。将1.2μg组织DNA或600μl血浆提取的45μl血浆游离DNA进行亚硫酸氢盐修饰。2．2．2扩增引物特异性的检测PCR和甲基化特异性PCR分别扩增M．SssⅠ修饰、未经修饰的胎盘组织DNA中野生型(W)，甲基化(M)和未甲基化(U)的RASSF1A和p16基因，检测引物的特异性。2．2．3组织RASSF1A和p16基因甲基化检测PCR和甲基化特异性PCR分别扩增组织DNA中野生型，甲基化和未甲基化的RASSF1A和p16基因，探测RASSF1A和p16基因在癌组织和相配的远癌正常肺组织DNA中甲基化情况；结合病人的临床资料和肿瘤病理特征分析，卡方检验比较两基因甲基化与非小细胞肺癌患者临床资料和肿瘤病理特征的关系；Spearman相关分析法分析两基因高甲基化与其转录表达之间的相关性，探明中国人NSCLC组织中两基因失活的主要机制。2．2．4血浆RASSF1A和p16基因甲基化检测半巢式甲基化特异性PCR分别扩增血浆游离DNA中甲基化和未甲基化的RASSF1A和p16基因。Spearman相关分析法分析血浆和肿瘤组织中两基因高甲基化的相关性，决定血浆中两基因甲基化改变能否代替肿瘤组织中两基因的甲基化状态。2．2．5诊断效力指标检验血浆游离DNA中两基因甲基化联合检测诊断非小细胞肺癌的敏感性、特异性、阴性预测值和阳性预测值。2．3．RASSF1A表达或表达缺失的两类不同肺腺癌组织中差显蛋白的鉴定2．3．1组织可溶性总蛋白的提取用双向电泳蛋白裂解液提取RASSF1A表达或缺失的两类肺腺癌组织总蛋白，BradFord法测定样品的蛋白质浓度，作为分析型凝胶和制备型凝胶上样量的依据。2．3．2差显蛋白的筛选以17cm胶条分析型银染凝胶蛋白上样量标准上样后双向电泳，图像扫描软件GS-800扫描，获取两类肺腺癌组织17cm银染的凝胶图像，PDQuest7.1分析软件分析，找出差显蛋白点。2．3．3差异蛋白的质谱鉴定以17cm胶条制备型考染凝胶蛋白上样量标准上样后双向电泳，获取这些差异表达的蛋白质点，胶内酶解后，经基质辅助电离解吸飞行时间质谱，获得肽质量指纹图谱，搜索蛋白质数据库，联合生物信息学，鉴定出蛋白质，分析其生物学功能，探索与RASSF1A之间的联系。3．统计学处理应用SPSS12.0统计分析软件，采用x~2检验，Spearman相关分析，以α=0.05为检验水准。结果1．NSCLC组织中RASSF1A和p16基因表达失活情况1．1转录失活情况在NSCLC组织中，RASSF1AmRNA表达明显下调和缺失率为53.12％(51／96)，p16基因mRNA表达下调和缺失率为36.46％(35／96)，而相应的远癌正常肺组织均表达良好。RASSF1AmRNA表达与患者的性别、年龄、是否吸烟及肿瘤的组织学类型和分化程度无关(P＞0.05)；与肿瘤的TNM分期和有无淋巴结转移有关(P＜0.05)；p16转录本的表达与患者是否吸烟及肿瘤的分化程度无关(P＞0.05)；但与患者的年龄、性别，肿瘤的组织学类型、TNM分期和有无淋巴结转移均有关(P＜0.05)。1．2表达失活情况NSCLC患者肿瘤组织中60.4％(58／96)RASSF1A表达明显下调和缺失，而相应的远癌正常肺组织均表达良好。2．NSCLC患者血浆与组织中RASSF1A和p16基因启动子甲基化情况2．1 DNA的质量和含量提取的组织和血浆DNAA260／A280≈1.76～1.80，质量较好。非小细胞肺癌患者血浆游离DNA含量远高于肺良性病变患者和健康人。2．2引物特异性检测RASSF1A和p16基因W、M和U叁种引物对提取的胎盘DNA进行PCP扩增，仅引物W扩出目的条带；对M. SssⅠ处理和未处理的胎盘组织DNA进行碱基修饰，W、M、U叁种引物甲基化特异性PCR扩增，前者仅能扩出目的条带M，而后者仅能扩出U，表明引物特异性好。2．3组织RASSF1A和p16基因甲基化分析NSCLC患者肿瘤组织RASSF1A甲基化检出率为48.96％(47／96)，p16甲基化检出率为34.38％(33／96)。96例相配的远癌正常肺组织中未检测到两基因有异常甲基化。RASSF1A甲基化率与肿瘤的组织学类型有关，其中鳞癌组大于腺癌组(P＜0.05)，但与患者的年龄、性别、是否吸烟及肿瘤的分化程度、TNM分期和有无淋巴结转移均无关(P＞0.05)。p16基因甲基化率50岁以上组高于50岁以下组，鳞癌高于腺癌，有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组(P＜0.05)，但与患者的性别、是否吸烟，肿瘤的分化程度及TNM分期无关；RASSF1A和p16基因的转录与两基因启动子区CpG岛高甲基化呈显着负相关(RASSF1A：r_s=-0.586，P＜0.0001，p16：r_s=-0.363，P＜0.0001)RASSF1A的表达与该基因启动子区CpG岛高甲基化也呈显着负相关(r_s=-0.793，P＜0.0001)。表明启动子CpG岛高甲基化是中国人NSCLC组织中两基因失活的主要原因。2．4血浆RASSF1A和p16基因甲基化分析经半巢式甲基化特异性PCR二次扩增，NSCLC患者血浆中RASSF1A甲基化检出率为43.75％(42／96)，p16甲基化检出率为31.25％，12例肺良性病变患者、20例健康人血浆中均未检测到两基因有异常甲基化；NSCLC患者血浆和肿瘤组织中RASSF1A与p16基因启动子CpG岛甲基化存在着极好的相关性(r_s=0.932，P＜0.000)。表明血浆中两基因甲基化改变能够很好的反应肿瘤组织中两基因的甲基化状态。2．5血浆游离DNA中RASSF1A或p16基因异常甲基化对NSCLC的诊断意义单独检测血浆游离DNA中RASSF1A或p16基因异常甲基化用于诊断NSCLC的敏感性分别为43.75％(42／96)和31.25％(30／96)，特异性均为100％(38／38)，阴性预测值分别为41.30％(38／92)和36.54％(38／104)，阳性预测值均为100％(42／42，30／30)。此两项指标联合检测诊断NSCLC敏感性提高到59.38％(57／96)，阴性预测值为49.35％(38／77)。3．RASSF1A表达和表达缺失的两类不同肺腺癌组织中差显蛋白鉴定3．1差显蛋白筛选结果成功获取了RASSF1A表达和表达缺失的两类不同肺腺癌组织17cm银染的凝胶图像，PDQuest7.1分析软件分析，找出存在明显表达差异的蛋白点9个。3．2差显蛋白质谱鉴定结果从17cm制备型考染胶上成功获取了这些差异表达的蛋白质点，质谱鉴定出5种尚未见与RASSF1A相关报道的蛋白质，分别是：细胞色素B5(Cytochrome b5)，60S磷酸核糖体蛋白P2(60S acidic ribosomal protein P2)，碳酸酐酶-1(Carbonic anhydrase 1)，5-吡咯啉羧酸还原酶Ⅰ(Pyrroline-5-carboxylate reductase 1)和载脂蛋白A-Ⅰ前体蛋白(Apolipoprotein A-Ⅰprecursor)。另4个蛋白质点，虽获得了满意的肽指纹图谱，但在现有的蛋白质库中没有匹配上合适的蛋白质，有待通过串联质谱或氨基酸序列分析的方法做进一步的鉴定。结论1．RASSF1A和p16基因在本组中国人NSCLC组织中存在着较高的转录缺失率，RASSF1A在该组织中也较高比率的表达失活，而在正常肺组织中均表达良好。2．RASSF1A和p16基因在本组NSCLC组织中较高频率的甲基化，且与其表达失活显着相关，甲基化改变是其失活的主要原因；NSCLC患者的血浆游离DNA中可以检测到两基因的甲基化改变，且与相应的癌组织中两基因的甲基化状态存在极好的相关性。联合检测血浆中两基因高甲基化有助于NSCLC的早期诊断。3．成功建立了RASSF1A表达和RASSF1A表达缺失的两类不同肺腺癌组织的蛋白质双向电泳凝胶图谱，发现9个差显蛋白点。质谱鉴定出5种尚未见其与RASSF1A相关性报道的蛋白质，分别是：细胞色素B5(Cytochrome b5)，60S磷酸核糖体蛋白P2(60S acidic ribosomal protein P2)，碳酸酐酶-1(Carbonic anhydrase 1)，5-吡咯啉羧酸还原酶Ⅰ(Pyrroline-5-carboxylate reductase 1)和载脂蛋白A-Ⅰ前体蛋白(Apolipoprotein A-Ⅰprecursor)。
薛晓霞[10]2007年在《女性非小细胞肺癌CD44、CD82表达、DNA含量和凋亡率的相关性研究》文中研究表明前言肺癌是全球发病率最高、对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤之一。近叁十年来，肺癌发病率不断上升，女性尤为突出。在我国，肺癌的发病率和死亡率居男性恶性肿瘤的首位，女性发病率的第二位，死亡率的第一位。恶性肿瘤的发生和转移是受多种因素调控的复杂过程，既有肿瘤转移基因的参与，又有转移抑制基因的调控，并涉及到肿瘤细胞恶性增殖、肿瘤组织新生血管形成、肿瘤细胞粘附分泌蛋白降解基质及肿瘤细胞迁移运动、逃避免疫监视等一系列过程，肿瘤的恶性程度取决于其本身的DNA含量、倍体构成及染色体畸变等各个方面。近年来发现粘附分子CD44和CD82及其变异体在肿瘤的预测、早期诊断、病情进展、转移潜能及预后的估计等方面具有很大的潜在价值。CD44基因蛋白(Cluster of Differentiation 44)是一种分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，在淋巴细胞、成纤维细胞和上皮细胞表面均有表达，属于未分类的粘附分子。其正常功能是作为受体识别透明质酸(HA)和胶原蛋白Ⅰ、Ⅱ等，主要参与淋巴细胞的激活以及细胞之间、细胞与介质间的特异性粘附过程，CD44基因的变异多样性表达与肿瘤的发生及转移密切相关。CD82基因蛋白(Cluster of Differentiation 82)为转膜4超家族的成员，在结构上属于细胞膜糖蛋白，其作用是促使细胞膜表面的蛋白定位，在信号传导、细胞粘附及决定细胞运动方式上起重要作用，最近研究表明CD82对多种肿瘤的转移具有抑制作用。DNA含量测定是通过反映肿瘤细胞核酸代谢状况了解其生长增殖活动的一项新方法，为临床判断肿瘤的演进状态和恶性程度提供了客观的依据。本研究应用流式细胞术检测了女性非小细胞肺癌(NSCLC)组织中CD44和CD82的表达、DNA含量和凋亡率，同时检测了女性NSCLC患者外周血淋巴细胞中CD44的表达，并分析了不同病理特征与它们之间的关系，确定它们在判断肿瘤的转移潜能和预后中的意义，为分析女性NSCLC的发生、发展、转移及诊断提供依据。材料与方法女性NSCLC患者组织61例，来源于辽宁省肿瘤医院2002～2005年手术切除标本，所有患者均经组织病理学确诊。患者为非吸烟女性，年龄33～71岁。其中鳞癌18例，腺癌43例，按UICC(1997)分期标准进行TNM分期，Ⅰ期14例，Ⅱ期21例，Ⅲ期20例，Ⅳ期6例；低分化27例，高、中分化34例；有淋巴结转移者42例，无淋巴结转移者19例。同时取距肿块5cm以上的肺组织作为癌旁对照组；取45例同期手术的肺部良性病变(如肺结核)组织作为良性对照组。在61例肺癌患者中抽取32例患者的外周血2ml进行CD44的检测，32例患者中鳞癌8例，腺癌24例，按UICC(1997)分期标准进行TNM分期，Ⅰ期10例，Ⅱ期11例，Ⅲ期6例，Ⅳ期5例；低分化14例，高、中分化18例；有淋巴结转移者22例，无淋巴结转移者10例，正常对照组为健康献血者32人，均为女性。肺组织采用人工机械破碎法制成组织单细胞悬液，过300目尼龙网，经ficoll-hypaque密度梯度离心获取细胞悬液，外周血采用常规分离淋巴细胞的方法获取淋巴细胞悬液，并对上述两种细胞进行培养然后进行荧光染色，加入鼠抗人单克隆抗体CD44-FITC、鼠抗人单克隆抗体CD82-PE及阴性对照羊抗鼠IgG-FITC，DNA染液等。用FACSsort型流式细胞仪进行检测，采用SPSS12.0统计软件进行统计学处理，进行t检验，直线相关分析。结果61例女性NSCLC患者中异倍体肿瘤占75.41％(46／61)，二倍体肿瘤占24.59％(15／61)，肺癌组CD44表达和DI(DNA index)值显着高于癌旁对照组和良性对照组(P＜0.01)，而CD82的表达和凋亡率显着低于癌旁对照组和良性对照组(P＜0.01)，癌旁对照组中CD44、CD82的表达、DI值和凋亡率与良性对照组相比差异无显着性(P＞0.05)；32例女性NSCLC患者外周血淋巴细胞中CD44的表达显着高于正常对照组。研究发现Ⅰ+Ⅱ期肺癌组织中CD44的表达和DI值低于Ⅲ+Ⅳ期(P＜0.01)，而CD82表达和细胞凋亡率则是Ⅰ+Ⅱ期高于Ⅲ+Ⅳ期(P＜0.05)；中高分化与低分化之间CD44、CD82的表达和DI值差异有显着性(P＜0.01)；有淋巴结转移者其CD44表达高于无淋巴结转移者(P＜0.05)，而CD82的表达则是有淋巴结转移者低于无淋巴结转移者(P＜0.05)。在Ⅰ+Ⅱ期肺癌外周血淋巴细胞中CD44的表达低于Ⅲ+Ⅳ期(P＜0.05)，中高分化与低分化之间外周血淋巴细胞中CD44的表达差异有显着性(P＜0.01)，有淋巴结转移者其CD44表达高于无淋巴结转移者(P＜0.05)。DI值和凋亡率与肺癌患者的年龄、病理组织类型、原发肿瘤大小及淋巴结转移未见相关性(P＞0.05)，CD44和CD82的表达与女性肺癌患者的年龄、原发肿瘤大小、病理组织类型等病理指标之间未见相关性(P＞0.05)。CD44在肺癌患者组织和外周血淋巴细胞中的表达有相关性(r=0.837，p＜0.01)。随着DI值不断升高，CD44的表达也逐渐升高，与DI值呈正相关(r=0.782，P＜0.01)；CD82的表达与DI值呈负相关(r=-0.652，P＜0.01)，凋亡率也与DI值呈负相关(r=-0.460，P＜0.01)；CD44的表达与CD82的表达水平呈负相关(r=-0.804，P＜0.01)。讨论肺癌是发病率和死亡率增长最快、对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤之一。自19世纪中叶Laennec首次报告以来，其发病率不断上升，女性尤为突出。近年来，国内外学者针对肺癌进行了大量、广泛、深入且有价值的研究，使我们认识到肺癌的发生、发展是多因素共同作用的结果，转移是影响癌症患者预后的关键因素之一，是肺癌死亡的重要原因。在以往的研究中，大多采用免疫组化方法定性检测肺癌组织中的CD44和CD82的表达与肿瘤转移和预后的关系，本实验采用流式细胞仪(flow cytometry，FCM)对61例女性NSCLC患者癌组织和距癌旁5cm以上组织及45例肺部良性病变组织中CD44、CD82的表达、DNA含量和凋亡率进行了定量检测，并联合检测了32例女性NSCLC患者外周血淋巴细胞中CD44的表达。研究结果提示CD44的表达异常可能与肺癌的发生有关，说明CD44与肺癌病情的进展密切相关，在中、晚期肺癌中高表达，CD44高表达对肺癌细胞的淋巴结转移起重要作用，可作为判断肺癌淋巴结转移的一项新指标，提示CD44在抑制T细胞凋亡的免疫调节功能，使癌细胞逃避机体免疫机制，在促进肿瘤的生长和转移中起重要作用。结合CD44在肺癌患者组织和外周血淋巴细胞中表达的相关性，提示外周血中CD44的含量与肺癌细胞中CD44的表达量有关。在CD82与NSCLC发生及转移的研究中，我们的研究结果表明CD82的表达下调可能与肺癌的发生、发展有关，CD82表达水平的降低可提高肺癌的转移潜能，它对于增加癌细胞的恶性度及促进癌细胞的转移等可能有着重要作用。在细胞癌变过程中，肿瘤细胞的生长调控发生差错，染色体畸变，使细胞DNA含量也随之改变，因此通过DNA含量的检测有助于对恶性病变的定性诊断。本研究结果提示DNA含量增加与细胞增殖活性增强在女性NSCLC中是频繁发生的。凋亡率是FCM反映细胞凋亡数量的客观指标，本研究提示肺癌的发生、发展与细胞增殖和凋亡之间平衡失调有关。在女性NSCLC中CD44、CD82、DI值和凋亡率的相关性研究中，结果说明在女性NSCLC的发生发展及转移过程中，不仅存在细胞分裂增加，增殖旺盛，而且存在凋亡细胞数目显着减少，另一方面CD44高表达与CD82低表达使肿瘤细胞间的粘附作用降低，与细胞外基质间的粘附作用增强，从而增强肿瘤细胞的侵袭能力，促进转移。结论1．肺癌患者组织细胞中CD44和CD82的表达水平与女性NSCLC的临床分期、淋巴结转移和分化程度有关，说明CD44和CD82与肺癌的发生、转移有关。2．肺癌患者组织和外周血中CD44的表达有相关性。3．肿瘤细胞增殖活性增强和凋亡抑制在女性NSCLC中是频繁发生的，肺癌的发生、发展与细胞增殖和凋亡之间平衡失调有关。
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