摘要：自逆转录病毒感染获得转基因小鼠以来，世界各国科学家对转基因技术在动物生产中的应用表现出极大的兴趣。它们已在兔、羊、猪、牛、鸡、鱼等动物身上进行了基因改造，并在分子生物学上得到了广泛的应用。在生物学、发育生物学、免疫学、药学、畜牧业育种等领域，在提高生长速度、生产性能、产品质量、抗病育种、基因治疗等方面取得了可喜的进展，显示出诱人的应用前景。转基因克隆技术是转基因技术与动物克隆技术的有机结合。其研究意义和实用价值超越了这两种技术本身。
关键词：转基因羊；进展；
前言：转基因动物是指通过实验导入，将外来基因稳定地整合到自身染色体中，并稳定地遗传的动物。将大鼠生长激素基因转化为小鼠受精卵获得转基因超小鼠已成为生命科学发展的一个热点领域。从那时起，世界各国都在竞相在不同的动物身上开发这种技术。采用微注射法制备了世界上第一只转基因绵羊，并将大鼠金属硫蛋白基因和人类生长激素基因转入绵羊体内。随后，关于转基因羊的成功和突破的报道越来越多。同时，转基因绵羊的发展也从最初的转基因育种向乳腺生物反应器发展。
基金项目：资源共享平台建设项目--种羊及毛绒资源创新利用共享平台建设（PT1807）；国家现代农业产业技术体系建设专项-绒毛用羊产业技术体系（CARS-39-21）。
一、转基因技术对肉羊生产的影响
1.传统育种与分子育种相结合成为定向培育肉羊新品种的新途径。传统的羊育种方法是将数量遗传学原理应用于育种实践，通过采用杂交改良、品系选育等技术，实现绵山羊品种的不断改良和杂种优势的利用。自上世纪50 年代以来，我国绵羊遗传改良大致经历了3 个阶段：第一阶段以本品种选育为主，选优和提纯了滩羊、湖羊等一批地方品种；第二阶段引入国外品种杂交改良地方品种和新品种培育并重，制定出不同地区肉羊的选育方向，地方品种的选育已由外形一致转向产品质量提高上；第三阶段生产方向由毛用向肉用方向改变，形成“以肉为主，肉毛兼顾, 综合开发”的生产方向，基本形成了中原、内蒙古中东部、东北、西北及西南5个肉羊优势区域的生产格局，使我国养羊业成为发展最快的畜牧行业。目前，肉羊育种已进入分子育种与传统育种技术有机结合的新阶段。在绵羊高繁殖力性状育种方面，随着分子数量遗传学中绵羊基因图谱和QTL 的研究进展，人们对绵羊繁殖性状遗传机制的认识也更加深入，并不断将之应用于育种实践，从而提高了选种的效率和选种的准确性。分子育种克服了传统育种方法周期长、预见性差、准确率低的局限性，提高了选择效率，显示出越来越强大的生命力，逐渐成为肉羊育种的趋势和主流。通过各种现代生物技术综合运用，结合传统的育种方法，可以大大加快育种进程。
2.地方羊品种优异基因资源的发掘及其功能基因组研究是肉羊育种的基础。如何将我国地方羊基因资源的潜在优势变为现实优势，是目前迫切需要解决的一个科学问题，同时也是世界各国所普遍关注的一个研究领域。在分子和基因组水平开展原有地方绵山羊品种优异基因资源发掘研究，对与育种相关的重要性状的基因或主效基因进行克隆、测序与定位及功能鉴定，不仅可以获得肉羊最基本的生物遗传信息，发掘重要的功能基因，促进对肉羊重要经济性状遗传机理的综合了解，而且可为我国肉羊基因资源研究和遗传改良奠定坚实的理论基础，最终全面推动肉羊分子育种的应用研究，极大地推动我国地方羊品种基因资源研究和肉羊遗传改良进程。
二、转基因羊的研究进展
1.反转录病毒法。病毒药物是基因改造动物的第一种生产方式。在这一过程中，转基因动物可以通过逆转录病毒载体中的转基因基因得到平滑，转基因载体中产生高滴病毒颗粒、孕育前或受孕后人为感染的胚胎以及能够与能够生产抗逆转录病毒药物的单个细胞一起孵化的胚胎。并被整合到宿主细胞的基因组中，在其末端的酶和特定核酸序列下表达和基因改造。但是，由于转换过程不允许精确控制整合的时间，基因改造的动物通常是马赛克的，为了保持病毒的完整，不能插入更长的片段，只能暂时插入，而且还有安全问题没有得到进一步发展。
2.原核法。最初的微观注射是将外来基因直接注射到动物受精卵子的原始细胞核中，将外来基因碎片随机整合到受精卵子染色体中，并将其转化为转基因动物。为实施这项法律而进行的基因改造的羊的基本程序如下，将含有外来基因的受精卵移植到受体母亲的卵子中。选择了结合外来基因并最终产生转基因生物的幼崽。通过将金属硫化蛋白和人类生长激素的基因传递给羊，将外来基因引入原始核心，这些基因可以植入染色体受体基因组的任何部分，完全随机的，不保证表达和基因稳定性。要产生符合条件的转基因绵羊，需要大量的卵子，要得到符合要求的转基因羊，需要大量的原核期受精卵和受体羊，所需成本较高。
3.胚胎。胚胎干细胞是一种多项运动，与胚胎细胞或幼虫不同，在体外可以持续生长。胚胎干细胞内部分裂首先通过钻将转移到ES细胞中，通过将基因转化为外部源基因的外推克隆，然后将细胞克隆到胚胎囊肿中，将细胞移植到供体的子宫中，并继续形成。由于胚胎干细胞参与了胚胎生殖系统的发展，它们形成了一个体，其中一部分包含目标基因，并将其与普通动物结合起来，产生基因改造的动物。缺点是，育种必须经过精心设计的方法，在实验较长时间内，由于ES细胞的繁殖能力和杂交的可能性，基因改造羊在实验中取得了成功。但对于大型哺乳动物，由于Es细胞较难获得，所以此法不易推广。
4.精子载体法。精子载体，在受精过程中将外来基因引入动物胚胎，从而将外来基因引入子孙后代基因组。根据精子结合的方法，外推子载体可分为外推子进口、子宫内进口和等离子体单精子基因转移。其中体外导入又分自然孵育法、脂质体法、电穿孔法、以及限制性酶介导法等；体内导人则包括输精管注射法、曲细精管显微注射法、精原于细胞移植法等。羊的精子就与人类生长激素基因一起繁殖，并与普通羊人工授精，这表明精子可以作为传递外来基因和生产转基因羔羊的载体。通过注射未受精的种子，将精子从公羊的睾丸中提炼出来，在受体卵子中区分它们的发育，自然杂交或人工受体受精与七只蒙古羊进行人工授精，这是羊干细胞移植的第一个例子。
5.体细胞核转移。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆体细胞核转移(SCNT)包括将外源基因导入体细胞，培养细胞，选择具有外源基因的细胞进行扩增，然后将细胞核转移到去核的卵母细胞中。重组胚胎在体外培养或植入受体动物的输卵管。当他们怀孕和分娩时，他们可以获得转基因动物。克隆羊多利已成功克隆，并有许多成功的转基因羊的报道。利用含有人抗凝血酶基因的山羊胚胎体细胞核移植成功克隆了表达抗凝血酶基因的克隆山羊。这是首次将含有外源基因的成年山羊体细胞克隆到个体中。该方法有利于利用位点特异性基因表达技术，可在细胞核内进行。在移植前选择子代性别可以获得具有相同遗传背景和遗传稳定性的转基因子代。没有交配，只有一代人可以建立一个转基因群体，这可以节省时间和成本。问题是建立体细胞系困难，细胞传代数量有限，成功率低。但是从长远来看，这种方法可以被认为是理想的发展方向。
6.一种缓慢传播病毒的方法。慢病毒属于抗逆转录病毒治疗，可能会感染分裂细胞和静态细胞，无法引起宿主免疫反应，病毒逆转录病毒可以整合到宿主细胞的染色体中，并可能长期稳定。近年来，根据慢病毒载体法案，转基因动物被广泛使用。成功地用慢病毒载体技术制造转基因老鼠，通过慢病毒载体，我们能够培育出具有绿色荧光蛋白的转基因。使用缓慢的病毒载体来制作转基因山羊。基于慢病毒载体的转基因技术具有高传动效率、高表达速度以及普遍性和易用性。然而，一方面，由于对环境和人类健康的潜在影响；另一方面，由于它们的偶然和一体化的效率，这对动物自身的安全造成了一定的风险。此外，从外部来源运输的基因的大小受到宿主通过能力的限制，一些复杂的基因控制序列或基因编码序列很难克隆成病毒载体。
7.基因打靶。基因打靶的方法是基于亲缘关系的重组原则，以及将点固定在目标细胞特定基因标记上的方法，并彻底修改动物基因组。首先，在纤维细胞中进行了基因目标定位手术，导致细胞移植。具有特定点和目标的基因打靶技术可以与染色体结合，通过克服失明和随机融合来稳定基因特征，从高水平上讲，这是生物材料修改理想方式。然而，基因打靶的效率太低，导致了多次序列，能够自发地产生次生亲属关系的重组。由于它们独特的识别和切割序列及其构造能力，它们被用来将基因与点突变和外部基因点融合。目前，这种技术能够设计精确的目标和诱导有效的目标基因的能力得到了基因改造研究者的越来越多的关注，并成功地应用于动物细胞的基因改造。这项技术将基因打靶效率从提高到并扩大了范围，直接使用胚胎注射突变会导致特殊基因。然而，这项技术仍处于研究的早期阶段，而且存在缺陷。合成高异质锌在锌核化技术中被理解为一个狭窄的位置，其中许多酶在基因改造过程中偏离目标个细胞依赖于剂量毒性。
三、存在问题
1.像羊的基因功能和控制它们表达方式的机制这样的基础研究不够深入。尽管有关于羊技术的成功报道，但仍有一些问题阻碍了绵羊的开发和应用。问题包括:生产周期的持续时间、低效率、高成本、对目标基因的不满、转基因绵羊的高死亡率以及社会对转基因羊的生物安全的担忧。一方面，这些基础研究的落后影响了基因研究的价值和功能使用，另一方面阻碍了基因改造技术的发展和改进。目前的问题是缺乏具有独立知识产权的遗传和监管因素、外来基因融入受体染色体、无法控制的特定组织和发育表达、基因不稳定以及转基因羊发展中的各种异常由于上述的基础研究。
2.生产成本高。目前，基因改造的羊被广泛用作注射核和克隆人体细胞的原始方法。对于初级微注射，一方面需要昂贵的设备和技术人员，另一方面，因为只有10%的转基因后代能够正确有效地表达他们的目标基因，因此需要准备更多的代孕受体，而大量的代孕受体则花费大。就体细胞克隆技术而言，理论上，它为子孙后代提供了100%的基因治疗，大大降低了生产所需人工饲养牲畜的成本。然而，由于技术上的困难，生产转基因克隆羊的成本很高，在大多数情况下，成功的几率在5%到10%之间。此外，一些影响动物正常发育的技术领域限制了基因改造羊的应用。
3.动物基因组编辑技术落后于发达国家。由于起步晚、较分散，目前在中国动物基因组学研究主要集中在建立基本实验技术、技术特点等研究为研究动物基因组编辑技术，存在下列问题:(1)基础研究体系尚未完全建立。2)技术发展相对较低，主要是基于跟踪研究；发展水平仍处于发展阶段，主要方法尚未实现，应用程序开发仍在一定距离内。(3)原始技术和知识产权严重短缺;技术的系统和综合性质需要不断的改进。因此，当前研究的另一个重要领域是创建一个精确、可靠和有效的基因编辑系统。
四、展望
转基因羊是20年来被研究的高科技生物技术的结果，涵盖农业、畜牧业、生物医学和制药业的许多方面。在欧洲，人们认为转基因绵羊应该在最终解决本世纪环境和人类健康等重要问题方面发挥无价的作用。但我们也必须清楚地认识到，由于仍有一些关键问题有待解决，我们需要时间来实现转基因绵羊的工业化和商业化，需要时间。缺乏具有自主知识产权的基因和监管要素，我们的国家拥有大量的山羊和绵羊资源，它们占世界数量的四分之一，它们具有非凡的繁殖能力，很好的皮毛，很好的壁垒。对我们来说，这些宝贵的遗传资源是绵羊的基因改造。它提供了大量的物质基础。转基因绵羊和方法,主要是外国专利,因此迫切需要通过发展新的转基因生物体,拥有自主知识产权，打造大型特别节目,加强研究和利用动物最好的基因。我们需要建立一个系统来评估转基因羊的安全。由于转基因绵羊数目急剧增加,迫切需要建立转基因生物安全评价制度，以刺激生产的新品种如转基因绵羊和生物反应器，工业化还可以防止转基因羊及其产品污染环境。
结束语：近年来，基因组编辑技术开始用于动物基因组遗传修饰改造，被誉为动物遗传改造的一项革命性技术。随着这些新技术的建立和发展，转基因动物的应用已由基础生物学研究、人类疾病模型建立向异种器官移植、制药和动物遗传育种等领域拓展。
参考文献：
[1]李子龙，廖建民，徐寒梅，等.转基因动物技术与转基因动物制药[J].中国药科大学学报，2018，33（2）：81-86.
[2] 安政权，李宁.动物克隆的机理与研究进展[J].生物技术通讯，2018，12（4）：324-328.
[3] 孙含笑，陆大祥，等.转基因技术理论与应用（第一版）[M].郑州：河南医科大学出版社，2017，444-446.
[4]肖红波，胡亚平.动物克隆的研究新进展[J].动物科技，2018，20（5）：66-67.
论文作者:张敏, 高维明, 采复拉, 段新华,,郑文新
论文发表刊物:《科学与技术》2019年第09期
论文发表时间:2019/9/29
标签：基因论文; 转基因论文; 动物论文; 技术论文; 绵羊论文; 细胞论文; 胚胎论文; 《科学与技术》2019年第09期论文;