刘梅[1]2001年在《霍乱毒素B亚单位(CtxB)在痢疾杆菌中表达》文中研究表明霍乱弧菌（V.cholera）是一种曾经严重威胁人类生存，迄今仍对人类健康 构成威胁的烈性病原体，其最主要的致病因子是霍乱毒素（cholera toxin，CT）。 完整的霍乱毒素由一个A亚单位和5个B亚单位组成。其中A亚单位是毒力活性部 分，具有ADP-核糖基转移酶活性；B亚单位毒副作用很小，但能识别所结合细胞表 面的受体──神经节苷脂（G_(M1)），是霍乱弧菌主要的保护性抗原之一。CtxB加灭活 的霍乱弧菌死菌苗的免疫效果远胜于单纯的死菌苗的免疫效果。因此CtxB的高效 表达受到研究者的极大重视。研究发现，无论核酸序列还是氨基酸序列，霍乱弧菌 的CT和大肠杆菌的肠毒素（LT）具有70％－80％的同源性，所以对CtxB基因在大肠 杆菌中的高效表达研究得比较多，但对子其在异源疫苗中的表达，研究相对较少。 痢疾是一种常见和多发性传染病，全球每年有2亿人次患细菌性痢疾，死亡650 万人，痢疾菌是患病的主要原因。痢疾菌分为四群：痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、 鲍氏志贺氏菌和宋内志贺氏菌。痢疾的流行型别有地区特点。我国以福氏志贺氏菌 为主，近年来在城镇郊区宋内志贺氏菌有升高的趋势。发展疫苗是预防痢疾流行的 重要途径。目前有两个双价苗已经通过鉴定。但这两个双价苗中一个由于含转座子 而导致整个表达系统不稳定；另一个存在抗药性基因，药物抗性在菌株之间的传播 会增加治疗的难度，所以有抗药性的疫苗是不能用于临床的。为了克服这一缺点， 军事医学科学院生物工程研究所基因工程室利用载体/宿主平衡致死系统构建了抗 宋内和福氏2a的双价菌苗侯选株 2457TDI1。其基本的思路为野生型福氏2a 2457T 株中的asd基因缺失，（asd基因是细菌的管家基因，编码天冬氨酸半醛脱氢酶， 是细菌赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和二氨基庚二酸──DAP合成途径中的一种关键 酶）形成的突变体在LB培养基中的生长依赖于DAP的存在。然后将asd基因克隆 至含O-抗原基因的宋内I相大质粒中，转化asd~-的突变体后，恢复了突变体在LB 培养基中的生长能力，这样就构建成了以asd基因作为筛选标志的载体/宿主平衡 致死系统。2457TDI1菌株的优点是在没有任何抗性作选择压力的情况下，表达外 源保护性抗原的质粒在宿主菌中能稳定存在。 就目前的发展来看，单独预防霍乱和痢疾的疫苗已经存在，但令人满意的联合 疫苗还没上市，而构建联合疫苗又是当今的发展趋势。所以本实验的目的就是在上 述己经构建好的二价痢疾疫苗2457TDI1 中引入编码霍乱毒素B亚单位的基因CtxB，使CtxB基因在异源疫苗株中稳定表达，最终形成抗霍乱和痢疾的多价疫苗 侯选株。 为达到这一目的，我们完成了以下工作： 1．以 DHS a （pMT999）为模板，成功克隆了他抗性基因片段。 重组质粒在宿主菌中的稳定存在需要有外界的抗性选择压力，随着抗药性菌株 1 陕西师范大学硕士学位论文 的出现和扩散，传统的抗生素作为筛选标志的方法，已经不受欢迎，所以我们选择 了Hg抗性基因作为CtXB表达载体的筛选标志。Hg抗性基因来源子pMT999中的转 座子Tn501，在此转座子中含有完整的Hg抗性基因操纵子，全长2922hp，包括merR， inerT，me凡，meN。其中me叩编码调节蛋白；inerT，me凡编码转。蛋白；med编 码还原酶。实验以 DHS a（pMT999）为模板，通过全菌 PCR扩增出汞抗性基因片段， 电泳图谱鉴定，证明正确。 2．成功构建了CtXB的表达载体pBRC09。 外源性基因高效表达，理论上要求载体中有强启动子和高拷贝复制子存在。但 本实验中CtXB的过高表达对细胞有一定的毒害作用，而且会占用细胞内过多的资 源而导致细胞死亡，所以实验选用了中等强度的启动子和中度拷贝的复制子。 门）用EcoR和Bsl 11双酶消化质粒pMGL102回收的片段中除却ctxB的完整序 列外，还包括fi－lactamase启动子，即内酚胺酶启动子（中等强度的启动子）。而 且在回收的长约 1．SKb的片段中还含有Xba1Clal之间的序列，根据曹诚等人的 研究表明，该序列也具有一定的启动子活性。通过p－lactamase启动子和具有启 动子活性的序列，就使得CtXB有效但又不过量表达。当然在表达载体中，还须有 终止子的存在，有资料表明，在ctXB中就包含了自身的起始和终止信号。 （2）载体中复制子的拷贝数与外源基因的表达效率有一定有关系。一般来讲，复 制子的拷贝数越高，其外源基因的表达也就越高。PBR322的复制子，为中度拷贝 复制子，其拷贝数大约在20－30之间，被本实验所采用。 PCR扩增、酶切回收后，将Hg抗性基因片段、CtXB片段、p8R322复制子片段 连接，转化受体菌 DHS a，挑取阳性克隆并酶切鉴定，证明正确，命名为 pBRC09。 3．ELISA和 Western blot检测了 CtxB在痢疾杆菌中的表达。
李金福[2]2007年在《杜氏利什曼原虫amastin基因DNA疫苗的初步研究》文中指出杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani，L．d)引起的内脏利什曼病(visceral leishmaniasis，VL，又称黑热病)是利什曼病中症状最严重的一种类型，如不经治疗，病死率达90％以上。据WHO／TDR资料，全世界每年新增加50万内脏利什曼病病人，患病人数约250万。目前，对内脏利什曼病采取的主要控制措施仍然是使用葡萄糖酸锑钠(五价锑剂)等药物治疗病人或捕杀病犬以控制传染源，其次是使用驱虫剂或杀虫剂避免被传播媒介白蛉叮咬。然而，抗内脏利什曼病药物普遍存在用药时间长、副作用明显、不能口服以及治疗费用昂贵，绝大多数发展中国家的病人无力承担等问题。近年来，在一些发病地区甚至产生了针对葡萄糖酸锑钠的抗药株，加上艾滋病与内脏利什曼病混合感染情况的出现，使内脏利什曼病的防治形势更加严峻。因此，研制出安全、有效、使用费用低廉的可供临床大规模应用的疫苗，对于控制内脏利什曼病具有十分重要的现实意义。近年来，被称为第叁代疫苗的核酸疫苗的出现，为内脏利什曼病疫苗的研究提供了一个新的发展方向。目前，在此方面已有尝试性的研究报道。本研究在查阅国内外大量文献的基础上，首次选用杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)基因作为疫苗候选基因，并首次设计将霍乱毒素B亚单位(CTB)的编码基因ctxB与amastin基因融合，构建了含amastin基因的两种DNA疫苗，免疫接种实验小鼠，对它们的免疫原性和免疫保护性以及CTB的佐剂作用进行了初步评价。本研究共分为五部分：第一部分，以两株杜氏利什曼原虫基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得了与预期大小一致、约552bp的杜氏利什曼原虫amastin基因。将amastin基因定向克隆入原核表达载体pET-32a(+)，构建原核表达重组质粒pET-amastin和pET-dog-amastin，进行测序和序列对比分析，并诱导pET-amastin在原核系统中表达出约40kD的融合蛋白。第二部分，利用重迭PCR技术将ctxB基因与amastin基因进行融合，得到ctxB／amastin融合基因，并将ctxB／amastin融合基因定向克隆入原核表达载体pET-32a(+)，构建原核表达重组质粒pET-ctxB／amastin，诱导pET-ctxB／amastin在原核系统中表达出约54kD的融合蛋白。第叁部分，将amastin基因和ctxB／amastin融合基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin和pcDNA3.1-ctxB／amastin，将pcDNA3.1-amastin和pcDNA3.1-ctxB／amastin体外转染NIH3T3细胞后，用免疫荧光法检测到有效的瞬时表达，经G418筛选后存活的转染细胞的总RNA经RT-PCR分别扩增出约552bp和921bp的目的条带，证实转入基因得到稳定表达；Western blot检测到转染的阳性细胞克隆稳定表达出20kD和34kD的目的蛋白。第四部分，将构建的真核表达重组质粒用作DNA疫苗免疫BALB／c小鼠，检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4产生水平以及CTL杀伤活性等指标，评价疫苗的免疫原性。结果发现：pcDNA3.1-amastin和pcDNA3.1-ctxB／amastin免疫组的免疫原性均高于空白质粒对照组(P＜0.01)；pcDNA3.1-ctxB／amastin免疫组的体液免疫和细胞免疫水平均高于pcDNA3.1-amastin免疫组，单因素方差分析显示，差异有显着性(P＜0.01)。第五部分，将构建的真核表达重组质粒用作DNA疫苗免疫BALB／c小鼠，加强免疫后，用杜氏利什曼原虫前鞭毛体对免疫小鼠进行攻击，攻击6周后处死小鼠，取肝、脾印片检查无鞭毛体数量情况，并做组织切片观察肝、脾病理形态学变化，评价疫苗对动物的免疫保护性。结果发现：pcDNA3.1-amastin和pcDNA3.1-ctxB／amastin免疫组小鼠肝、脾印片的无鞭毛体数量均低于空白质粒pcDNA3.1(+)免疫组，pcDNA3.1-ctxB／amastin免疫组小鼠肝、脾印片的无鞭毛体数量低于pcDNA3.1-amastin免疫组。pcDNA3.1-amastin和pcDNA3.1-ctxB/amastin免疫组小鼠肝、脾病理变化明显低于空白质粒pcDNA3.1(+)免疫组。结果表明：含amastin基因的两种DNA疫苗均可在小鼠体内产生一定的免疫保护效应，ctxB/amastin融合基因免疫组的免疫保护效果似乎强于单纯的amastin基因免疫组。本研究结果表明：含amastin基因的两种DNA疫苗具有较强的免疫原性，能诱导BALB／c小鼠产生一定程度的抗杜氏利什曼原虫感染保护性免疫力，加入佐剂分子CTB的疫苗免疫原性和免疫保护性优于单纯的amastin基因疫苗免疫组。而且，ctxB／amastin融合基因免疫可诱导产生更强的细胞免疫应答。由于杜氏利什曼原虫为胞内寄生原虫，细胞介导的免疫效应能够抑制虫体的增殖，对于抵御杜氏利什曼原虫起着极其重要的作用，因此，构建疫苗候选基因与佐剂分子的融合基因在内脏利什曼病DNA疫苗研究中的意义更为突出。迄今为止，该研究未见国内外报道。本研究为进一步研制安全、有效的内脏利什曼病疫苗奠定了基础。
王涛[3]2004年在《嗜肺军团菌mip基因DNA疫苗初步研究》文中指出军团病是由军团菌属感染所致的呼吸道传染病,人类若吸入含有嗜肺军团菌的气溶胶而感染,可引起以非典型性肺炎和Pontiac热为主的疾病,若治疗不当,病死率极高,老年人和免疫抑制者最为易感。研究发现:军团菌广泛存在于土壤、天然水以及人类生活用水领域如空调系统冷却塔水、淋浴头水、井水以及自来水等。随着空调、加湿器在现代生活中的普及,军团菌感染会大量增加,危害会更严重。我国已将军团病列为需要重点防治的一种新发传染病,但目前尚无理想的预防措施。本研究选择了嗜肺军团菌DNA疫苗这一研究领域,在查阅国内外大量文献的基础上,选择嗜肺军团菌mip基因作为候选疫苗基因,并首次设计将mip基因与佐剂分子CTB联合使用。希望能为研制安全、有效的军团菌疫苗提供科学依据和研究基础。 本研究共分为四部分进行: 第一部分,以嗜肺军团菌L1株和霍乱弧菌569B株基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得了嗜肺军团菌828bp的mip基因和霍乱弧菌376bp的ctxB基因。将mip基因和ctxB基因定向克隆入原核表达载体pUC18,构建原核表达重组质粒pLpmip和pctxB,诱导pLpmip和pctxB在原核系统中分别表达出24kDa和11kDa的蛋白。 第二部分,将mip基因和ctxB基因定向克隆入真核表达载体
参考文献：
[1]. 霍乱毒素B亚单位(CtxB)在痢疾杆菌中表达[D]. 刘梅. 陕西师范大学. 2001
[2]. 杜氏利什曼原虫amastin基因DNA疫苗的初步研究[D]. 李金福. 四川大学. 2007
[3]. 嗜肺军团菌mip基因DNA疫苗初步研究[D]. 王涛. 四川大学. 2004
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