付娜[1]2016年在《长链非编码RNA-ATB在HCV相关肝纤维化中的作用及机制研究》文中认为丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染为世界性健康问题,据WHO报道,全球HCV感染流行率约3%(约1.85亿感染者),每年约3.5万例新发丙型肝炎病例,约50万例患者死于HCV相关疾病。近年来,据国家疾病防治控制中心统计数据,我国上报HCV感染人数逐年上升,2013年的病例数超过22万人。肝硬化及肝细胞癌(hepatocellular cancer,HCC)是慢性丙型肝炎患者致死的主要原因,由此造成的疾病负担成倍增长。肝纤维化是慢性HCV感染进展为肝硬化及终末期肝病的重要病程阶段,Butt等最新研究提出HCV感染早期即出现肝纤维化,且经FIB-4(fibrosis index based on the 4 factor)指数监测11年证实,随着感染时间的延长,肝纤维化呈进行性加重趋势,因此,早期诊断及有效抗肝纤维化治疗是防止该病进展、改善患者生活质量及生存率的主要策略。目前,尚乏准确判断病情及其进展的特异性标志及有效治疗手段,因此,深入研究HCV相关肝纤维化发病机制、主要靶基因,提出新型基因诊断标志及治疗新靶点,对该病的及时诊断及有效防治至关重要。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的不具备编码蛋白功能的RNA分子,可在表观遗传学调控、转录调控、转录后调控等多个层面调控蛋白编码基因的表达。近年研究表明,lncRNAs差异表达或功能失调参与多种疾病的发生及进展,其与肝细胞再生、炎症反应、免疫反应以及肝癌的发生等密切相关;此外,lncRNAs还可以参与调节肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)功能,影响肝纤维化的发病与进展。转化生长因子(transforming growth factor,TGF)β激活的lncRNA(lncRNA-activated by TGFβ,lncRNA-ATB)被证实参与多种恶性肿瘤的发生、进展及转移,并与肝硬化呈正相关,但是lncRNA-ATB在HCV相关肝纤维化中的作用及分子机制尚不清楚。本研究采用临床HCV感染病例及建立HCV相关肝纤维化体外细胞模型,旨在明确lncRNA-ATB在HCV相关肝纤维化中的表达情况,预测其靶标基因及相关信号转导通路,探明其调控靶标基因的机制,以阐明lncRNAs在hcv相关肝纤维化发病中的作用及主要作用机制,为临床从基因水平诊断及防治该病提供新的途径及科学依据。第一部分长链非编码rna-atb在hcv相关肝纤维化患者血浆及肝组织的表达变化目的:明确lncrna-atb在hcv相关肝纤维化患者血浆及肝组织的表达变化,分析血浆lncrna-atb作为生物学标记对hcv相关肝纤维化的诊断价值。方法:采用随机对照研究,选择2014年9月至2015年6月在河北医科大学第叁医院门诊及住院的慢性hcv感染者36例,并选择15例健康体检者作为健康对照。留取外周静脉血,分别分离血浆、血清,储存于-80℃冰箱备用。hcv感染患者均进行肝穿刺活检术及肝组织病理检查,根据metavir评分系统将hcv患者分为轻度纤维化组(f<2;n=14)和中至重度纤维化组(2≤f<4;n=22)。另选5例肝移植供体作为健康对照组。血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,alt)及天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,ast)水平采用酶法检测;肝组织切片行苏木素-伊红(haematoxylinandeosin,he)染色及masson叁色染色,观察肝组织脂肪变性、炎症及纤维化程度;免疫组织化学染色方法评估肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-sma)、?型胶原α1(alpha-1typeicollagen,col1a1)表达;原位杂交方法检测肝组织lncrna-atb表达;采用trizolls提取血浆总rna,以实时荧光定量pcr方法检测血浆lncrna-atb表达。结果:1患者一般情况:健康对照组(n=15),其中男性8例(53.3%),女性7例(46.7%),平均年龄(51.2±11.4)岁;hcv感染患者f<2组(n=14),其中男性6例(42.9%),女性8例(57.1%),平均年龄(48.8±11.6)岁;hcv感染患者2≤f<4组(n=22),其中男性12例(54.5%),女性10例(45.5%),平均年龄(52.5±7.2)岁。叁组年龄之间差异无统计学意义(f=0.596,p=0.555)。2血清alt、ast水平:健康对照组、hcv感染患者f<2组及hcv感染患者2≤f<4组血清alt中位数分别为17.0、33.0、50.0u/l,叁组之间差异具有统计学意义(χ2=23.79,p=0.000);血清ast中位数分别为15.0、32.0、43.5u/l,叁组之间差异具有统计学意义(χ2=23.33,p=0.000)。两两比较结果显示,hcv感染患者血清alt、ast均显着高于健康对照组(p值均为0.000);hcv感染患者两组间alt水平无显着性差异(p=0.107),hcv感染患者2≤f<4组血清ast显着高于f<2组(p=0.000)。3肝组织病理学特征:健康对照组肝小叶结构正常;hcv感染患者f<2组肝组织可见肝细胞轻度水样变、部分肝细胞脂肪变性,小叶内可见少许点状肝细胞坏死,肝窦内可见成串淋巴细胞浸润,窦周轻度纤维化;汇管区轻度扩大,可见淋巴滤泡,少量纤维化组织增生;hcv感染患者2≤f<4组肝组织可见肝细胞中至重度水样变、部分肝细胞脂肪变性,小叶内散在点状肝细胞坏死,肝窦内可见成串淋巴细胞浸润,可见窦周纤维化;汇管区扩大,可见淋巴滤泡,纤维组织增生明显,形成纤维间隔。4肝组织α-sma、col1a1及lncrna-atb表达:α-sma主要表达于血管壁及肝窦内活化的hsc细胞浆;col1a1主要表达于纤维化间隔;lncrna-atb表达于肝细胞胞浆。与健康对照组相比,肝组织α-sma、col1a1及lncrna-atb表达随着纤维化程度加重而增加。5血浆lncrna-atb表达变化及与肝纤维化分期相关性分析:hcv感染患者血浆lncrna-atb表达水平显着高于健康对照组(z=-5.562,p=0.000),且与肝脏纤维化程度呈正相关(r=0.785,p=0.000);其中,hcv感染患者2≤f<4组血浆lncrna-atb显着高于f<2组(z=-3.960,p=0.011)。6血浆lncrna-atb诊断肝纤维化的效果分析:应用受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve,roc)分析显示血浆lncrna-atb水平可用于区分hcv感染患者纤维化程度,曲线下面积为0.877(p=0.000),其诊断特异性为0.880,敏感性为0.787。结论:1.肝组织病理学显示hcv感染患者肝脏炎症及纤维化增加,伴随lncrna-atb表达上调。2.血浆lncrna-atb表达在hcv感染患者中显着升高,并在中至重度肝纤维化患者中进一步升高。并且血浆lncrna-atb水平与hcv相关肝纤维化分期呈正相关。3.血浆lncrna-atb对hcv相关肝纤维化程度具有重要的诊断价值,有望成为诊断hcv相关肝纤维化的新型生物学标记。第二部分长链非编码rna-atb在体外活化的肝星状细胞中的表达变化目的:建立稳定表达hcv核心蛋白的hepg2-core细胞系,探明lncrna-atb在hsc活化中的作用。方法:转染pcdna3.1-hcv核心蛋白质粒至hepg2细胞,筛选稳定表达hcv核心蛋白的hepg2-core细胞系并进行验证;进一步应用小干扰rna(smallinterferencerna,sirna)转染hepg2-core细胞以敲除转化生长因子(transforminggrowthfactor,tgfβ)1。实时荧光定量pcr和westernblot方法检测hcvcore表达;酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,elisa)检测细胞培养上清液中tgfβ1水平。将细胞培养上清作为条件培养基处理人肝星状细胞系lx-2,同时应用重组人tgfβ1按剂量梯度及时间梯度处理lx-2细胞。实时荧光定量pcr、westernblot及免疫细胞荧光染色方法检测α-sma、col1a1表达;细胞增殖-毒性检测试剂盒(cellcountingkit-8,cck-8)检测细胞增殖情况;实时荧光定量pcr检测lncrna-atb表达变化。结果:1稳定表达hcv核心蛋白的hepg2-core细胞系建立成功:hepg2-core细胞与对照hepg2-nc细胞相比,能够稳定表达hcvcoremrna和蛋白;培养上清液中tgfβ1水平显着升高。si-tgfβ1-1能明显减少hepg2-core细胞tgfβ1mrna表达,并降低细胞培养上清中tgfβ1水平。2hepg2-core细胞培养上清作为条件培养基促进hsc活化:hepg2-core细胞培养上清液促进lx-2细胞α-sma、col1a1mrna及蛋白表达显着增加,与之相比,si-tgfβ1-1转染后的hepg2-core细胞培养上清液引起lx-2细胞α-sma、col1a1mrna及蛋白表达程度下降。3重组人tgfβ1促进hsc活化及增殖:重组人tgfβ1显着增加lx-2细胞α-sma、col1a1mrna及蛋白表达,且呈剂量及时间依赖性。同时选择10ng/ml重组人tgfβ1作用48h促进lx-2细胞α-sma、col1a1蛋白表达增加及细胞增殖。4lncrna-atb在活化的hsc表达显着增加:lncrna-atb表达在hepg2-core细胞培养上清液诱导活化的hsc中显着上调;lncrna-atb表达在重组人tgfβ1诱导活化的hsc中呈剂量及时间依赖性上调。结论:1.稳定表达hcv核心蛋白的hepg2-core细胞上清液可作为条件培养基促进lx-2细胞活化;2.敲除hepg2-core细胞中tgfβ1表达,减少细胞培养上清液中tgfβ1水平,并减少lx-2细胞活化;3.重组人tgfβ1以剂量及时间依赖方式促进细胞活化及增殖;4.lncrna-atb可能为hsc活化的重要分子标志。第叁部分长链非编码rna-atb的竞争性内源rna分子调控机制预测及验证目的:预测并验证lncrna-atb作为竞争性内源rna调控相关mirna靶基因的分子机制。方法:采用分子生物信息学分析预测lncrna-atb相关mirna及其靶基因,构建lncrna-atb及靶基因3’-非翻译区(untranslatedregions,utr)野生型及突变型双荧光素酶报告载体质粒,与mirna模拟物(mimics)共转染,定量检测双荧光素酶催化产生的荧光数值,验证mirna的作用靶点。应用mirnamimics、抑制剂(inhibitor)以及相应对照转染lx-2细胞,48h后收集细胞,采用实时荧光定量pcr检测lncrna-atb、mirna及α-sma、col1a1mrna表达变化;westernblot方法检测α-sma、col1a1蛋白表达变化。结果:1分子生物信息学预测lncrna-atb相关的mirna及其靶基因:lncrna-atb与ii型tgf-β受体(tgf-βtypeiireceptor,tgf-βrii)和smad2具有相同的mirna-425-5p结合位点(cacagua)。2双荧光素酶报告基因验证mirna-425-5p与lncrna-atb及靶基因结合:结果显示mirna-425-5pmimics可显着下调psi-atb-wt、psi-tgf-βrii-wt、psi-smad2-wt依赖的荧光素酶活性,而对共转染相关的突变型质粒的荧光素酶活性无影响。3mir-425-5p具有抑制肝星状细胞活化的作用:mir-425-5pmimics引起lx-2细胞α-sma、col1a1mrna及蛋白表达显着下调。相反地,mir-425-5pinhibitor引起lx-2细胞α-sma、col1a1mrna及蛋白表达显着升高。4mir-425-5p转录后调控作用:mir-425-5pmimics引起lx-2细胞表达mir-425-5p显着升高,其靶基因tgf-βrii和smad2mrna及lncrna-atb表达无明显变化,而其靶基因tgf-βrii和smad2蛋白表达下降;mir-425-5pinhibitor引起lx-2细胞表达mir-425-5p显着下降,其靶基因tgf-βrii和smad2mrna及lncrna-atb表达无明显变化,而其靶基因tgf-βrii和smad2蛋白表达上调。结论:1生物信息学预测及双荧光素酶报告基因检测证实lncrna-atb与tgf-βrii和smad2具有相同的mir-425-5p结合位点。2靶向调控mir-425-5p表达引起lx-2细胞内源性mir-425-5p表达变化,并能通过转录抑制tgf-βrii、smad2蛋白表达及调节α-sma、col1a1mrna及蛋白表达变化。第四部分靶向调控长链非编码rna-atb对肝星状细胞活化的作用及分子机制目的:明确过表达及敲除lncrna-atb对hsc活化的影响及潜在的分子生物学机制。方法:构建lncrna-atb过表达质粒转染lx-2细胞,通过实时荧光定量pcr、westernblot方法检测α-sma、col1a1、tgf-βrii和smad2表达;lx-2细胞增殖通过cck-8试剂盒检测;免疫荧光细胞化学染色检测tgf-βrii和smad2表达;实时荧光定量pcr检测lncrna-atb、mir-425-5p表达变化。合成si-atb并转染lx-2细胞,通过实时荧光定量pcr、westernblot方法检测α-sma、col1a1、tgf-βrii和smad2表达;lx-2细胞增殖通过cck-8试剂盒检测;免疫荧光细胞化学染色检测tgf-βrii和smad2表达;实时荧光定量pcr检测lncrna-atb、mir-425-5p表达变化。结果:1 LncRNA-ATB促进LX-2细胞活化:过表达lncRNA-ATB可增加LX-2细胞α-SMA、Col1A1 mRNA和蛋白表达,并促进LX-2细胞增殖。2 LncRNA-ATB通过miR-425-5p调控TGF-βRII和SMAD2表达:过表达lncRNA-ATB可增加TGF-βRII和SMAD2蛋白表达而下调内源性mi R-425-5p表达,miR-425-5p mimics共转染可部分恢复上述变化。3敲除lncRNA-ATB抑制HSC活化:si-ATB-1/si-ATB-2/si-ATB-3分别转染LX-2细胞后,结果显示si-ATB-3具有最高的抑制效率。si-ATB-3可抑制LX-2细胞α-SMA、Col1A1 mRNA和蛋白表达,抑制LX-2细胞增殖。4敲除lncRNA-ATB通过上调miR-425-5p抑制TGF-βRII和SMAD2表达:si-ATB-3可减少LX-2细胞TGF-βRII和SMAD2蛋白表达而上调内源性mi R-425-5p表达,miR-425-5p inhibitor共转染可部分恢复上述变化。结论:1过表达lncRNA-ATB可通过降低内源性miR-425-5p上调TGF-βRII和SMAD2表达,促进肝星状细胞活化及增殖。
张莹[2]2016年在《TGFβR3介导强直性脊柱炎成纤维细胞成骨分化作用及机制研究》文中认为目的:强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种与免疫因素相关的脊柱关节病变,主要发生于脊柱、骶髂关节和髋关节,导致伴随炎性疼痛的脊柱骨性强直乃至脊椎关节融合、骶髂关节和髋关节的退行性病变等。另外,AS常常伴随活动性关节炎、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、银屑病关节炎和急性葡萄膜炎。AS发展到中晚期,可引起脊椎骨性融合从而形成“竹节样”脊柱,使脊柱活动功能受限,具有较高的致残率。因此,研究AS的发病机制和有效的防治药物具有重要意义。AS病因复杂,涉及中轴关节、软骨、肌腱和韧带的改变。其中,脊柱韧带骨化引起的异位骨形成是AS关键病理进程,但韧带骨化的机制尚不清楚。前期研究发现AS患者棘上韧带中转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1,TGF-β1)、骨形成蛋白2(bone morphogenetic proteins,BMP2)和TGF-β受体3(transforming growth factor-βreceptor 3,TGFβR3)表达较对照韧带明显升高。在预实验中,我们也发现从AS脊柱棘上韧带成纤维细胞可诱导成骨分化,提示其参与AS韧带骨化。与韧带结果一致的是,AS成纤维细胞的TGF-β1、BMP2和TGFβR3表达也显着高于对照成纤维细胞。TGF-β1和BMP2同属TGF超家族成员,均可被TGFβR3受体识别而活化下游Smad通路,而后者是诱导成骨分化的关键通路之一。由于TGF-β1和BMP2均具有成骨诱导作用,二者可能通过作用于TGFβR3-Smad通路参与AS成纤维细胞成骨分化,但该设想尚需验证。基于上述研究基础,我们提出“TGFβR3过表达介导AS原代成纤维细胞成骨分化”的假设。本研究拟围绕TGFβR3开展工作,首先明确TGF-β1和BMP2通过过表达的TGFβR3诱导AS原代成纤维细胞成骨分化,然后确认TGFβR3-Smad通路中介导AS成纤维细胞成骨分化的关键分子,以初步阐明AS成纤维细胞成骨分化的分子机制,为研究治疗AS的靶向药物或其它治疗措施提供候选靶点。方法:一、TGFβR3在AS临床标本中的表达(一)采用苏木素-伊红(HE)染色法对AS棘上韧带和普通棘上韧带的石蜡组织切片进行染色,观察AS患者棘上韧带的病理改变;(二)采用免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)对AS棘上韧带和普通棘上韧带(对照)的石蜡组织切片中的TGFβR3、TGF-β1和BMP2进行特异性染色,观察AS患者棘上韧带中的相关蛋白表达较对照是否发生改变;(叁)采用实时荧光-聚合酶链式反应(real-time PCR)对AS棘上韧带和普通棘上韧带中TGFβR3、TGF-β1和BMP2表达进行检测,观察其在AS患者棘上韧带中的基因表达较对照是否发生改变;(四)采用免疫印迹法(western blot,WB)对AS棘上韧带和普通棘上韧带中TGFβR3、转化生长因子β1和BMP2的蛋白表达进行检测,观察其在AS患者棘上韧带中的蛋白表达较对照是否发生改变;(五)采用组织块培养法从AS棘上韧带和普通棘上韧带中分离培养人原代棘上韧带成纤维细胞(human supraspinous ligament fibroblasts,HSLFs),用于观察细胞中蛋白表达或后续成骨诱导实验;(六)采用免疫荧光法(immunofluorescence,IF)检测AS来源HSLFs细胞和普通HSLFs细胞(对照)中TGFβR3、TGF-β1和BMP2的蛋白表达,观察其在AS来源HSLFs细胞中的蛋白表达较对照是否发生改变;二、确认TGFβR3介导AS成纤维细胞成骨分化作用(一)AS原代成纤维细胞的成骨分化检测采用矿化诱导-茜素红染色法对HSLFs细胞进行钙化诱导和钙化结节染色,观察AS来源HSLFs细胞较对照细胞是否产生更多细胞外钙化结节;(二)TGF-β1联合BMP2对TGFβR3过表达HSLFs细胞成骨分化的影响1.构建TGFβR3过表达载体pc DNA-TGFβR3,并进行酶切检测和测序验证;2.采用脂质体法转染过表达载体到普通HSLFs细胞中,构建特异性过表达TGFβR3的HSLFs细胞;3.采用western blot检测TGFβR3过表达情况;4.观察TGF-β1联合BMP2对TGFβR3过表达的HSLFs细胞成骨分化的影响:(1)采用鬼笔环肽染色法标记TGFβR3过表达的HSLFs细胞细胞骨架,以观察TGF-β1联合BMP2对细胞面积的影响;(2)采用细胞计数法观察TGF-β1联合BMP2对TGFβR3过表达的HSLFs细胞增殖的影响;(3)采用矿化诱导-茜素红染色法对TGFβR3过表达HSLFs细胞进行钙化诱导和钙化结节染色,以观察TGF-β1联合BMP2是否诱导其成骨分化;(4)采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)显色法检测TGFβR3过表达HSLFs细胞总蛋白中ALP活性,以观察TGF-β1联合BMP2是否诱导其成骨分化;(叁)TGF-β1联合BMP2对TGFβR3低表达的HSLFs细胞成骨分化的影响1.采用脂质体法转染TGFβR3的si RNA到TGFβR3过表达HSLFs细胞中,构建TGFβR3低表达HSLFs细胞;2.采用半定量PCR检测si RNA封闭TGFβR3表达的效率;3.TGF-β1联合BMP2对TGFβR3低表达的HSLFs细胞成骨分化的影响:(1)采用鬼笔环肽染色法标记TGFβR3低表达的HSLFs细胞骨架,以观察TGF-β1联合BMP2对细胞面积的影响;(2)采用矿化诱导-茜素红染色法对TGFβR3低表达HSLFs细胞进行钙化诱导和钙化结节染色,以观察TGF-β1联合BMP2是否诱导其成骨分化;(3)采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)显色法检测TGFβR3低表达HSLFs细胞总蛋白中ALP活性,以观察TGF-β1联合BMP2是否诱导其成骨分化;叁、确认AS成纤维细胞成骨分化中TGFβR3/Smad通路关键分子(一)TGF-β1联合BMP2对TGFβR3过表达HSLFs细胞Smad通路的影响:Western blot检测TGF-β1联合BMP2对TGFβR3过表达HSLFs细胞TGFβR1、TGFβR2、TGFβR3、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad1、p-Smad1、Smad4和RUNX2表达的影响;(二)TGF-β1联合BMP2对TGFβR3低表达HSLFs细胞Smad通路的影响:Western blot检测TGF-β1联合BMP2对TGFβR3低表达HSLFs细胞TGFβR1、TGFβR2、TGFβR3、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad1、p-Smad1、Smad4和RUNX2表达的影响;四、确认TGFβR3/Smad通路关键分子在AS临床标本中的表达(一)AS棘上韧带中p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2的表达采用IHC检测p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2在AS棘上韧带中的表达较骨折来源棘上韧带是否上调;(二)AS来源HSLFs细胞中p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2的表达采用免疫荧光检测p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2在AS来源HSLFs细胞中的表达较普通HSLFs细胞是否上调。结果:一、TGFβR3在AS临床标本中的表达(一)AS临床标本的组织病理学鉴定AS患者脊柱和骶髂关节融合;而AS棘上韧带组织与正常棘上韧带相比,纤维束断裂、排列紊乱、玻璃样变性,脂肪浸润和血管增生较多。(二)TGFβR3在AS临床标本中的表达1.AS棘上韧带组织TGFβR3、TGF-β1和BMP2蛋白表达均显着高于正常棘上韧带组织,其表达多分布于血管周围、纤维化部位及韧带外包膜;2.TGFβR3在AS标本中m RNA表达量约为对照组的5~6倍,TGF-β1在AS标本中的m RNA表达量约为对照组的2倍,BMP2在AS标本中的m RNA表达量比对照组高100~150倍;3.Western blot检测也表明在AS棘上韧带中TGFβR3、TGF-β1和BMP2蛋白表达均高于对照棘上韧带。(叁)TGFβR3在AS原代成纤维细胞中的表达1.成功从AS棘上韧带和骨折棘上韧带分离培养获得原代成纤维细胞(h SLFs);2.AS来源h SLFs细胞中TGF-β1、BMP2及TGFβR3的蛋白表达较普通h SLFs细胞明显增高,与在棘上韧带的RNA水平和蛋白水平检测结果一致。二、确认TGFβR3介导AS成纤维细胞成骨分化作用(一)AS原代成纤维细胞的成骨分化检测成骨诱导AS来源HSLFs细胞后细胞外钙化结节较普通HSLFs细胞明显增多。(二)TGF-β1联合BMP2对TGFβR3过表达的HSLFs细胞成骨分化的影响1.pc DNA-TGFβR3质粒构建成功;2.构建的TGFβR3过表达HSLFs细胞的TGFβR3表达显着高于普通HSLFs细胞;3.TGF-β1联合BMP2诱导TGFβR3过表达HSLFs细胞的细胞面积明显增大;4.TGF-β1联合BMP2对TGFβR3过表达HSLFs细胞增殖无明显影响;5.TGF-β1联合BMP2可诱导TGFβR3过表达HSLFs细胞的钙化结节较单用TGF-β1或BMP2明显增多;6.TGF-β1联合BMP2可诱导TGFβR3过表达HSLFs细胞ALP活性较单用TGF-β1或BMP2明显增强。(叁)TGF-β1联合BMP2对TGFβR3低表达的HSLFs细胞成骨分化的影响1.转染TGFβR3 si RNA的HSLFs细胞中TGFβR3表达仅为转染无关si RNA的细胞的30%;2.TGF-β1联合BMP2较单用组不能进一步诱导TGFβR3低表达HSLFs细胞肥大;3.TGF-β1联合BMP2较单用组不能进一步诱导TGFβR3低表达HSLFs细胞的钙化结节;4.TGF-β1联合BMP2较单用组不能进一步诱导TGFβR3低表达HSLFs细胞的ALP活性升高。叁、确认AS成纤维细胞成骨分化中TGFβR3/Smad通路关键分子(一)TGF-β1联合BMP2对TGFβR3过表达HSLFs细胞Smad通路的影响1.TGF-β1联合BMP2较单用组显着上调TGFβR3表达,但不能进一步上调TGFβR1和TGFβR2表达;2.TGF-β1联合BMP2较单用组显着上调Smad2/3和Smad1磷酸化、Smad4和RUNX2表达。(二)TGF-β1联合BMP2对TGFβR3低表达HSLFs细胞Smad通路的影响1.TGF-β1联合BMP2较单用组不能进一步上调TGFβR3低表达HSLFs细胞的TGFβR3表达,表明在TGFβR3低表达情况下TGF-β1联合BMP2的协同效应消失;2.TGF-β1联合BMP2较单用组不能进一步上调TGFβR3低表达HSLFs细胞的Smad2/3和Smad1磷酸化水平,协同效应丧失;TGF-β1联合BMP2进一步下调TGFβR3低表达HSLFs细胞的Smad4和RUNX2表达,其在TGFβR3高表达HSLFs细胞中的协同效应翻转为拮抗效应。四、确认TGFβR3/Smad通路关键分子在AS临床标本中的表达(一)AS棘上韧带中p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2的表达AS棘上韧带组织的p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2蛋白表达较正常棘上韧带组织显着上调,其表达多分布于血管周围、纤维化部位及韧带外包膜。(二)AS来源HSLFs细胞中p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2的表达AS来源HSLFs细胞的p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2蛋白表达较普通HSLFs细胞均明显增高,与在完整棘上韧带组织的IHC检测结果一致。结论:1.AS棘上韧带较正常棘上韧带发生显着组织病理改变;2.TGFβR3、TGF-β1和BMP2在AS棘上韧带组织中的表达较对照组织显着升高,在AS原代成纤维细胞中的表达较对照细胞也显着升高;3.AS原代成纤维细胞可自动成骨分化;4.TGF-β1联合BMP2可诱导TGFβR3过表达HSLFs细胞成骨分化,二者具有协同效应;5.封闭TGFβR3表达后,TGF-β1联合BMP2诱导HSLFs细胞成骨分化作用丧失,提示TGF-β1协同BMP2诱导成骨分化作用依赖于TGFβR3的过表达;6.TGF-β1联合BMP2较单用组显着上调TGFβR3表达、下游效应分子Smad2/3和Smad1磷酸化、Smad4和RUNX2的表达;7.封闭TGFβR3表达后,TGF-β1联合BMP2上调TGFβR3表达、下游效应分子Smad2/3和Smad1磷酸化、Smad4和RUNX2表达的作用丧失,提示TGF-β1协同BMP2诱导TGFβR3-Smad通路活化作用依赖于TGFβR3的过表达;8.TGFβR3-Smad通路效应分子p-Smad2/3、p-Smad1、Smad4和RUNX2的表达在AS棘上韧带组织和AS原代成纤维细胞中均显着升高;9.本研究明确TGF-β1和BMP2经由过表达的TGFβR3诱导AS棘上韧带来源的成纤维细胞成骨分化,其分子机制为通过激活p-Smad2/3和p-Smad1磷酸化、Smad4表达,同时活化TGF-β/Smad和BMP/Smad通路,上调成骨诱导因子RUNX2表达而发挥作用。
王晓军[3]2016年在《白血病细胞COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF基因表达与白血病患者血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF测定及其意义》文中指出白血病(leukemia)是造血干/祖细胞出现分化受阻、凋亡障碍和恶性克隆性增生而引起的一组异质性的造血系统恶性肿瘤。目前我国白血病的发病率为3-4/10万,在各种恶性肿瘤凋亡率中,白血病在男性患者位居第六位,女性患者位列第八位,在儿童及35岁以下成人中则居首位。研究发现,与实体肿瘤一样,血液肿瘤的发生、发展与血管新生和信号传导密切相关。目前这一研究已逐渐成为众多学者关注的焦点。在肿瘤形成过程中,异常的血管生成发挥着关键作用。肿瘤生长依赖于血管生成。肿瘤细胞具有诱导血管生成的潜能,这种潜能必需在生长因子的刺激下才能转化为发挥作用的表型。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是最强的血管生长因子之一,是一种十分重要的正性调控因子。近年来,研究表明,白血病患者体液中bFGF水平亦较正常对照明显升高,骨髓中有明显的血管新生现象。体内体外的各种实验均证实了bFGF对于血管内皮细胞的促增殖活性。人们发现白血病细胞有bFGF和或bFGFR的异常表达,bFGF可以通过自分泌或旁分泌直接刺激白血病细胞,通过加强酪氨酸激酶信号传导水平促进肿瘤细胞增殖。新生血管持续不断的为肿瘤提供营养和排除代谢产物,在肿瘤的发生、转移及预后方面起着重要作用。在很多恶性血液病中,血管增生是一个重要的病理生理过程,骨髓血管增生与AML、ALL和CML的预后不良有关。近年来,对AML和CML患者骨髓血管增生和血管内皮生长因子(VEGF)水平之间关系的研究中发现,与对照组相比,各类型白血病患者骨髓微血管密度都有显着增高,而且与VEGF有明显的相关性,其中CML患者骨髓微血管密度及VEGF水平增高最为显着。环氧合酶-2(cyclooxygenase2, COX-2)在实体瘤中可以促进肿瘤发生、发展,其在白血病中表达也有所提高,COX-2与白血病中VEGF表达及血管新生有关,需要进一步研究证明。COX-2诱导花生四烯酸合成的主要代谢产物PGE2：同样在肿瘤的血管生成中起作用,诱导血管生长因子如VEGF、bFGF合成。血细胞的增殖、分化、成熟及凋亡受多种具有刺激活性或抑制活性的两大类所谓正性或负性的细胞因子组成的网络的调控。转化生长因子β1 (transforming growth factor β1, TGFβ1)是目前已知的作用最强的血细胞增殖的负调控因子,多种正常血细胞如单核细胞、淋巴细胞、血小板等均能产生TGFβ1,它不仅能刺激成纤维细胞的生长,修复创伤,还能调节造血,抑制肿瘤细胞的增殖。目前大多研究开展的是对COX-2、bFGF、TGF β1及VEGF这四种因子单个或两叁个因子进行检测,并探讨其临床意义,但理论创新不足,应用范围有限,而本研究通过检测白血病细胞COX-2、bFGF、TGF β1及VEGF基因表达与白血病患者血清COX-2、bFGF、TGF β1及VEGF水平的变化情况,同时对四种因子之间的相关性予以研究,分析各检测指标在白血病的临床治疗中的指导意义,探讨白血病的发生发展与血管生成的关系。第一部分：COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF在急性白血病的表达及其意义目的检测不同类型急性白血病(AL)患者在不同时间段的COX-2、FGF、TGF β1、VEGF等指标的变化情况,分析各检测指标在AL的诊断、治疗及预后判断中的临床意义。方法以在安康市中心医院就诊的90例AL患者为研究对象,以该院体检中心健康体检者40例为正常对照,采用ELISA方法检测血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF的含量,并对AL患者进行治疗前、后两个不同阶段的动态检测；对于AL患者,采用骨髓涂片在显微镜下按常规分类计数200个有核细胞,计算原始加幼稚细胞比例的方法进行诊断。结果1.初诊时,AL组的血清COX-2含量出现显着升高的趋势,与正常对照组相较,差异显着,具有统计学意义(P<0.001, t/χ2=6.082).2.初诊时,AL组的血清bFGF含量出现显着升高的趋势,与正常对照组相较,差异显着,具有统计学意义(P<0.001,t/χ2=820.000)。3.AL组初诊时血清TGFβ1含量明显减低,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.001,t/χ2=860.000)。4.初诊时,AL组的血清VEGF含量出现显着升高的趋势,与正常对照组相较,差异显着,具有统计学意义(P<0.001, t/χ2=4133.000).5.治疗前AML组血清bFGF、COX2、VEGF及TGFβ1水平与ALL组患者比较,差异没有统计学意义(分别为P=0.586,χ2=1077.000;P=0.646, χ2= 2906.500; P=0.986,χ2=1135.500; P= 0.729 χ2=2919.000)。6.患者接受2至3个疗程的治疗后,达到完全缓解(CR)时,患者血清TGFβ1含量逐渐恢复到正常数值,与正常对照组相较,差异无统计学意义(P=0.895,χ2=3774.000)。7.患者接受2至3个疗程的治疗后,达到完全缓解(CR)时,血清bFGF、COX2及VEGF含量出现显着降低的趋势,与正常对照组相较,差异无统计学意义(分别为P=0.806,χ2=3756.000；；P=0.868,χ2= 2173.500;P=0.905,χ2= 2181.000).8.患者接受2至3个疗程的治疗后,达到完全缓解(CR)时,bFGF、COX2、 VEGF及TGFβ1水平与治疗前相较,差异有统计学意义(分别为P<0.001,F=61.802;P<0.001,F=1342.108;P<0.001,F=458.935;P<0.001, F=1349.146)。9.AL初诊患者治疗前血清bFGF、COX2及VEGF水平与骨髓始加幼稚细胞数呈正相关(分别为R=0.0.303,P=0.005；R=0.435,P<0.001；R=0.293,P=0.006),而TGFβ1水平与骨髓始加幼稚细胞数呈负相关(R=-0.379, P<0.001)。10.AL初诊患者治疗前血清bFGF、COX2及VEGF水平与TGFβ1水平比较均呈负相关(分别为R=-0.401,P<0.001；R=-0.578,P=0.001；R=-0.388,P<0.001)。以上数据均采用SPSS20.0统计分析软件进行统计学分析。结论研究表明,促血管生成因子COX-2、VEGF及bFGF在急性白血病患者血清中含量显着增加,化疗后完全缓解组患者血清COX-2、VEGF及bFGF含量显着下降,而血清TGF β1水平在急性白血病患者血清中含量明显减低,而化疗后完全缓解组患者血清TGFβ1含量显着升高,提示血管生成可能在急性白血病的发生、发展中具有一定作用。因此,动态监测AL患者血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF水平,可作为急性白血病病情进展的重要参考指标。第二部分：COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF在慢性粒细胞白血病的表达及其意义目的检测不同分期慢性粒细胞白血病(CML)患者不同发展阶段血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF的变化,对它们在CML的诊治和术后干预中的临床意义进行探讨。方法以在安康市中心医院就诊的50例初诊CML患者为研究对象,以该院体检中心健康体检者40例为正常对照,采用ELISA方法检测血清COX-2、bFGF、 TGFβ1及VEGF的含量,并对CML患者进行治疗前、后两个不同阶段的动态检测；对于AL患者,采用骨髓涂片在显微镜下按常规分类计数200个有核细胞,计算原始加幼稚细胞比例的方法进行诊断。结果1.初诊时,CML组各期患者的血清COX-2含量显着升高,与正常对照组比较,差异显着,具有统计学意义(P<0.001,t/χ2=34.862)。2.初诊时,CML组各期患者的血清bFGF含量显着升高,与正常对照组比较,差异显着,具有统计学意义差异(P<0.001,t/χ2=820.000)。3.CML组各期初诊时血清TGFβ1含量明显减低,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.001,t/χ2=1289.000);4.初诊时,CML组各期患者的血清VEGF含量显着升高,与正常对照组比较,差异显着,具有统计学意义(P<0.001,t/χ2=1402.000)。5.治疗前CML组急变期患者血清bFGF、COX2及VEGF水平较慢性期患者增高,而TGF β 1水平减低,差异均有统计学意义(分别为P<0.001,t/χ2=-6.974; P<0.001,t/χ2=485.000;P<0.001,t/χ=465.000; P<0.001,t/χ2=55.000));26.治疗前CML组加速期患者血清bFGF、COX2及VEGF水平较慢性期患者增高,差异有统计学意义(P<0.05),而TGFβ1水平减低,差异有统计学意义(分别为P<0.001,t/χ2=6.117；P<0.001,t/χ2=575.000；P<0.001,t/χ2= 445.000;P<0.001,t/χ2=65.000)。7.经过甲磺酸伊马替尼治疗后,达到完全缓解(包括完全血液学缓解、完全遗传学缓解及完全分子学缓解)(CR)时,血清bFGF、COX2及VEGF含量明显下降,而TGFβ1含量基本恢复到正常水平,与正常对照组相较,差异均无统计学意义(分别为P=0.950,t/χ2=-0.063;P=0.983,t/χ2=1518.000; P=0.584, t/χ2=1468.500;P=0.742,t/χ2=1299.000)。8.患者接受甲磺酸伊马替尼治疗后,未达到缓解(包括部分缓解、血液学复发和耐药)时,血清bFGF、COX2、VEGF及TGFβ1水平与CR组比较差异显着,有统计学意义(分别为P<0.001,t/χ2=-28.355;P<0.001,t/χ2=630.000;P <0.001,t/χ2=137.000;P<0.001,t/χ2=123.000)9.CML初诊患者治疗前血清bFGF、COX2及VEGF水平与TGFβ1水平呈负相关(分别为R=-0.315,P=0.026；R=-0.330,P=0.020；R=-0.632,P<0.001)以上数据均采用SPSS20.0统计分析软件进行统计学分析。结论CML患者初诊时存在COX-2、VEGF及bFGF的高表达,TGFβ1在CML初诊时存在低表达,经过甲磺酸伊马替尼治疗后,达到完全缓解时,血清COX-2、VEGF、bFGF及TGFβ1含量基本恢复正常,提示与CML的发生、发展有密切关系。根据以上研究,说明动态监测CML患者血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF水平,可作为CML病情进展的重要参考指标。第叁部分：白藜芦醇对K562细胞COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF基因表达的影响摘要目的：探讨COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF对人白血病细胞增殖的影响机制。方法：采用不同浓度白藜芦醇(Res)及伊马替尼(IM)对K562细胞进行干预,通过MTT法、台盼蓝染色、Hoechst 33258染色及流式细胞术观察细胞凋亡情况,同时将K562细胞株分为空白对照组、IM单药组(0.1μmol/L、0.2μmol/L)、Res单药组(50μmol/L)；100μmol/L)、200μmol/L)、IM联合Res组(IM0.1μmol/L+Res 50μmol/L、IM 0.1μmol/L+Res 100μmol/L、IM 0.1μmol/L+Res 200μmol/L、IM 0.2μmol/L+Res 50μmol/L、IM 0.2μmol/L+Res 100μmol/L、IM 0.2μmol/L+Res 200μmol/L)。采用荧光定量PCR及Western blot检测其给药后COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF的变化。结果：1、细胞抑制率随白藜芦醇及伊马替尼药物浓度的增高而呈上升趋势,各组间相比差异具有统计学意义(P<0.05),与单独使用白藜芦醇或者伊马替尼相比,细胞增殖的抑制率明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05),其中200μmol/mL白藜芦醇+200μmol/L伊马替尼组细胞的抑制率最高；随着时间的延长,白藜芦醇与伊马替尼联合作用组细胞的增殖抑制作用明显增高,且当作用72 h时细胞的增殖抑制作用最高。2、台盼蓝拒染实验检测两种药物联合运用后对K562细胞的细胞毒作用。结果表明,各联合用药浓度组对K562细胞的细胞毒作用均高于单用白藜芦醇组和伊马替尼组,且当用200μmol/ml白藜芦醇+0.2μmol/L伊马替尼作用K562细胞时细胞的凋亡率最高；随着时间的延长,白藜芦醇与伊马替尼联合作用后使细胞的凋亡率明显增高,且当作用72 h时细胞凋亡率为最高。3、采用伊马替尼及白藜芦醇对CML细胞株caspase-3进行检测发现,随着白藜芦醇或伊马替尼浓度升高,其caspase-3活性逐渐增强。4、流式细胞术检测显示单用白藜芦醇及单用伊马替尼对人白血病细胞K562均具有凋亡作用,而随着白藜芦醇浓度的增加,K562细胞的凋亡率逐渐增高；随着伊马替尼浓度的增加,K562细胞的凋亡率逐渐上升。5、Hoechst 33258染色实验检测显示单用白藜芦醇及单用伊马替尼对人白血病细胞K562均具有凋亡作用,而随着白藜芦醇浓度的增加,K562细胞的凋亡率逐渐增高；随着伊马替尼浓度的增加,K562细胞的凋亡率逐渐上升。6.PCR及Western blot结果显示,相较于对照组,0.2μmol/L伊马替尼组的COX-2、bFGF及VEGF的表达量明显降低,而TGFβ1 mRNA的表达均显着增高,差异具有统计学意义(P<0.05)；而用200μmol/mL白藜芦醇±0.2μmol/L伊马替尼联合作用于K562细胞后,细胞中TGFβ1 mRNA的表达明显增高,而COX-2、bFGF及VEGF mRNA的表达均显着降低,与对照组和0.2μmol/L伊马替尼组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。以上数据均采用SPSS20.0统计分析软件进行统计学分析。结论 白藜芦醇及伊马替尼对白血病K562细胞株均具有促进凋亡作用,其联用可明显增
王军[4]2017年在《MIF,TGFβ,IFNγ基因多态性与脊柱结核易感性及在椎间盘中的表达与其临床资料的关联研究》文中认为1、背景与目的结核病存在了几千年依然是全球主要的健康问题,痰涂片阳性的肺结核患者死亡率达到了70%,结核病是由结核分支杆菌感染并引起以青年人为主要感染人群的一种慢性传染性疾病,它严重影响着人类的健康。然而这一情况并没有随着时间的进展而得到控制。总的来说,占全球总人数大约5%-15%的人口(估计20-30亿)一生中感染了结核分枝杆菌最终将导致结核病。然而,在发展中国家结核病的发病概率已结高于艾滋病毒感染的概率,并且其致死率也高于艾滋病毒的致死的传染性疾病死亡人数,是传染性疾病致死的主要原因。结核病的发病受多种因素的影响,其中宿主遗传基因在其中起着重要的角色。在发展中国家,脊柱结核是最常见的肺外结核,脊柱结核破坏患者的椎体与椎间盘并形成流注脓肿,常并发脊柱畸形、截瘫,严重者甚至导致死亡。在脊柱结核的病理过程中,椎间盘破坏是脊柱结核疾病的一个特征性改变,但是其发生机制并不明确。近年来研究发现多种细胞因子在结核病的病理过程中起到的作用越来越重要,已有研究表明MIF、TGF-β1、IFN-γ等细胞因子在结核免疫中起重要作用,但是上述叁种细胞因子在脊柱结核患者的椎间盘破坏中是否起作用需要更深入的研究。MIF可以在体外杀灭结核分支杆菌,在机体的结核免疫中可以抑制巨噬细胞随机游走聚集到结核分支杆菌侵入部位并释放各种细胞因子并加剧炎症反应,促进基质金属蛋白酶、NO、及IFN-γ的释放,而基质金属蛋白酶又促进并加剧了椎间盘破坏的发生,因此MIF同时具有抗结核免疫及促炎作用。TGF-β1可以抑制IFN-γ与TNF-α的活性,同时上调MMP-2与MMP-9的表达,抑制T淋巴细胞的功能最终降低对人体对结核分支杆菌的抵抗力并加重椎间盘的破坏。IFN-γ可以通过活化的T淋巴细胞及效应细胞杀灭结核分支杆菌并发挥抗结核免疫功能。目前关于MIF、TGF-β1与IFN-γ在脊柱结核病理机制中的研究较少见,其基因多态性与宿主遗传易感性的研究也少见,尤其是关于上述细胞因子在脊柱结合患者椎间盘破坏中的病理机制更少见,基于上述细胞因子在结核免疫中的作用,因此我们选择了上述叁种细胞因子进行研究,该研究将有助于加深我们对脊柱结核患者的遗传易感性及椎间盘的破坏机制的了解。2、方法2.1正常对照组:2014年9月至2015年9月广西医科大学附属医院体检中心血液检查确诊的正常广西汉族人110例。正常入组者纳入标准包括:1.纳入者不能具有免疫学疾病:如风湿、类风湿、干燥综合征、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎等。2.除外肿瘤患者。3.除外HIV阳性患者。4.除外结核病患者。脊柱骨折组:2014年9月至2016年6月广西医科大学附属医院脊柱外科诊断为脊柱骨折,需行椎间盘切除手术者,共10例(患者均为为正常广西汉族人)。正常入组患者还需要满足以下几点要求:1.患者不能具有免疫学疾病:如风湿、类风湿、干燥综合征、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎等。2.除外肿瘤患者。3.除外HIV阳性患者。4.组织病理学检查与影像学诊断均符合正常的椎间盘组织。脊柱结核组:选取2014年9月至2016年6月在广西医科大学附属医院脊柱骨病外科因确诊为脊柱结核并有手术指征行病灶清除、减压、植骨等手术者,共110例(患者均为广西汉族人)。脊柱结核患者入组标准为同时具有以下几点:1.具有典型结核症状,午后低热、盗汗、乏力、消瘦等症状者。2.具有神经压迫症状者。3.患者血液检查诊断符合结核诊断者。4.术后组织病理学检查确诊为脊柱结核者。5.影像学检查与结核菌素试验符合结核诊断者。6.排除其他免疫性疾病、肿瘤及HIV感染者等。7.排除肺结核患者。2.2采用血液基因组DNA提取技术及椎间盘组织RNA提取技术及蛋白提取技术、普通PCR技术、逆转录技术、基因测序技术和荧光定量PCR技术及蛋白质印迹法技术,研究分析MIF、TGF-β1、IFN-γ的基因型与脊柱结核遗传易感性的关系,MIF、TGF-β1、IFN-γ在正常的椎间盘与结核性椎间盘中的表达水平及MIF、TGF-β1、IFN-γ的m RNA转录水平在正常的椎间盘组织与结核性椎间盘组织中的表达情况及差异性。3、结果3.1研究结果显示在广西汉族人群中MIF rs755622多态位点(CC+GC)基因型与C等位基因、TGF-β1rs4803455位点CC基因型与C等位基因明显高于健康对照组(P<0.05)。研究结果显示MIF、TGF-β1和IFN-γ在脊柱结核患者椎间盘中的含量明显高于脊柱骨折组(P<0.05)。研究结果显示脊柱结核组中TGF-β1和IFN-γ在椎间盘中的m RNA表达明显高于脊柱骨折组椎间盘的表达(P<0.05),而脊柱结核组中MIF的m RNA表达水平明显低于脊柱骨折组(P<0.05)。3.2研究结果显示在脊柱结核患者椎间盘中TGF-β1与IFN-γ的m RNA表达水平呈负相关。脊柱结核患者的MIF的m RNA表达与临床资料无关,脊柱结核患者TGF-β1和IFN-γ的m RNA转录水平表达与患者的病灶的节段、性别等无关。吸烟习惯与TGF-β1的m RNA表达水平呈正相关(p=0.026)。VAS评分能够影响TGF-β1和IFN-γ的m RNA的表达水平(P=0.026、P=0.019),TGF-β1的m RNA表达水平在VAS评分为8-10分时的重度疼痛时明显高于在VAS评分在0-4分的轻度疼痛,IFN-γ的m RNA表达水平在VAS评分为0-4分时的轻度疼痛时明显高于在VAS评分在8-10分的重度疼痛。病程长短能够影响TGF-β1和IFN-γ的m RNA的表达水平(P=0.009,P=0.022),TGF-β1的m RNA表达水平在病程在3-12月时明显高于病程小于3个月的患者,IFN-γ的m RNA的表达水平在病程小于3月的患者明显高于病程在3-12月的患者。血清CRP与ESR的水平能够影响TGF-β1和IFN-γ的m RNA的表达水平(CRP:P=0.004,P=0.011,ESR:P=0.007,P=0.026),CRP>30 mg/L时,TGF-β1的m RNA表达水平高,CRP<10 mg/L时,IFN-γ的m RNA的表达水平高,ESRs>40 mm/h时,TGF-β1的m RNA表达水平高,ESRs<20 mm/h时,IFN-γ的m RNA的表达水平高。脊柱结核组中患者的炎症反应指标越高TGF-β1的m RNA表达越高,IFN-γ的m RNA表达越低(P<0.05)。4、结论4.1在本实验中发现广西地区汉族人群中MIF rs755622与TGF-β1rs4803455位点与脊柱结核病的易感性相关,推测等位基因C可能是增加脊柱结核病易感性的因素之一。4.2在本实验中发现脊柱结核患者椎间盘组织中均有MIF、TGF-β1和IFN-γ的蛋白质水平与m RNA水平均有表达。MIF、TGF-β1和IFN-γ脊柱结核患者椎间盘中蛋白含量高于对照组,因此我们推测在脊柱结核的炎症免疫反应过程是多种不同的细胞因子共同作用结果,MIF、TGF-β1可能参与了脊柱结核的免疫过程并介导了椎间盘破坏的病理过程,IFN-γ可能参与了脊柱结核的免疫过程并起到重要的保护作用。4.3在本实验中证实了脊柱结核患者椎间盘组织中TGF-β1的m RNA表达水平与脊柱结核患者的吸烟的量有关,推测吸烟可能是影响脊柱结核预后的不良因素。在本研究中证实了脊柱结核患者椎间盘组织中IFN-γ的m RNA表达水平与VAS评分负相关,TGF-β1的m RNA表达水平与VAS评分呈正相关。推测TGF-β1可能通过调节炎症反应程度引起疼痛加重。在本实验中证实了脊柱结核患者椎间盘组织中TGF-β1的m RNA表达水平与病程长短呈正相关,IFN-γ的m RNA表达水平与病程长短负相关。推测病程长短与脊柱结核患者的预后密切相关。在本研究中证实了脊柱结核患者椎间盘组织中TGF-β1的m RNA表达水平与血沉及C反应蛋白水平呈正相关,IFN-γ的m RNA表达水平与血沉及C反应蛋白水平负相关。推测其在脊柱结核炎症反应中发挥不同作用,并且不同炎症阶段的TGF-β1与IFN-γ的作用及表达量也各不相同。
蒋洪强, 张金国[5]2016年在《黄芪甲苷抑制慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化和转化生长因子β1的表达》文中研究说明目的研究黄芪甲苷对慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌纤维化和转化生长因子β1(TGFβ1)表达的影响。方法采用腹主动脉缩窄法制作CHF模型,并分为空白组、黄芪甲苷低、中、高剂量(20、40、60 mg/kg)组、缬沙坦(10 mg/kg)组,同时设立假手术组做对照,每日给药(灌胃)1次,持续4周。4周后行血流动力学指标的检测,处死大鼠后计算心脏重量/体质量比(HW/BW)、左心室重量/体质量比(LVW/BW),常规行苏木素-伊红染色观察心肌组织形态学变化,Masson染色观察心肌纤维化,测量胶原容积分数(CVF),RT-PCR、免疫组织化学和蛋白免疫印迹法检测TGFβ1 mRNA以及TGFβ1分子表达水平。结果同空白组相比,黄芪甲苷低、中、高剂量组HW/BW、LVW/BW、CVF、TGFβ1 mRNA、TGFβ1等表达明显减弱(P<0.05),黄芪甲苷中、高剂量组左心室舒张末压、左心室收缩压显着下降,±dp/dtmax显着上升(P<0.05),细胞形态明显改善。结论黄芪甲苷能够抑制CHF大鼠的心肌纤维化,具体作用机制可能是通过抑制心肌组织中TGFβ1的过度表达来实现的。
王今越, 王小虹, 冯维斗[6]2014年在《运动训练抑制了TGFβ通路并缓解了D-半乳糖诱导衰老大鼠的肌肉流失》文中提出目的:研究TGFβ(经典和非经典)通路在运动缓解衰老性肌肉流失(少肌症)中的作用。方法:24只雄性Wistar大鼠分为3组,C组(青年安静组)、S组(40dD-半乳糖注射致衰老组)、E组(40dD-半乳糖注射+6wk跑台运动的衰老运动组)。检测各组大鼠体重、腓肠肌重量、TGFβ(经典与非经典)通路因子——TGFβ1、MSTN、Phospho-smad2/3、PhosphoMAPKs(p38、JNK1/2、ERK1/2)及通路效应因子——p21、Pax7(WB法)、MyoD mRNA、MyoG mRNA(RT-PCR法)。结果:与C组相比,S组腓肠肌比重(腓肠肌重量/体重)降低,TGFβ1、MSTN、Phospho-smad2/3、Phospho-MAPKs(Phospho-p38、Phospho-JNK1/2、PhosphoERK1/2)、p21、MyoD mRNA、MyoG mRNA升高,Pax7降低;与S组相比,E组腓肠肌比重升高,TGFβ1、MSTN、Phospho-smad2/3、Phospho-MAPKs(Phospho-JNK1/2、Phospho-ERK1/2)降低,p21、Pax7、MyoD mRNA、MyoG mRNA升高。结论:运动训练抑制了TGFβ经典及非经典通路并缓解了衰老肌肉的流失,Pax7、p21、MyoD、MyoG可能作为TGFβ通路的效应器介导了该过程。
窦献蕊, 余学清, 李晓艳, 陈文芳, 郝文科[7]2005年在《TGF-β1及其信号蛋白在大鼠腹膜纤维化模型腹膜组织中的表达及可能作用》文中认为目的了解TGFβ1/Smads信号蛋白在高浓度葡萄糖透析液及炎症所致大鼠腹膜纤维化模型腹膜组织中的表达及在腹膜纤维化发生中的可能作用。方法24只SD雄性大鼠(180～200g)随机分为4组,每组6只。正常对照组,大鼠不做任何处理;LPS组,LPS用生理盐水稀释为0.6mg/100ml,在第1、3、5、7日按0.6mg/kg体重腹腔注射;4.25%透析液组,大鼠给予每日腹腔注射100ml/kg体重高糖透析液;LPS+4.25%透析液组,除每日腹腔注射100ml/kg体重高糖透析液外,LPS用4.25%透析液稀释为0.6mg/100ml,在第1、3、5、7日按0.6mg/kg体重腹腔注射;于实验第28天杀检动物,取壁层和脏层腹膜组织行光镜及电镜检查。用RTPCR及间接免疫荧光、Western杂交的方法检测αSMA、TGFβ1、Smad3、Smad7、pSmad2/3、ColⅠmRNA和蛋白的表达水平。结果Masson染色显示,与正常对照组比较,4W时各组壁层腹膜组织明显增厚,有大量胶原沉积,其中LPS+4.25%透析液组厚度最为显着(vsLPS组:42μm±3μmvs35μm±4μm,P=0.007,vs4.25%透析液组,42μm±3μmvs20μm±4μm,P=0.000);与正常对照组比较,叁组αSMA、ColⅠ和TGFβ1、Smad3、pSmad2/3在脏层腹膜组织中的表达水平显着上调,上述变化以LPS+4.25%透析液组改变最为显着,TGFβ1mRNA为正常对照组的2倍,Smad3mRNA为正常对照组的1.8倍;与正常对照组比较,抑制性信号蛋白Smad7mRNA和蛋白表达水平在其他叁组也有不同程度的上调,但Western杂交结果显示,pSmad/Smad7蛋白比值仍明显升高;电镜结果显示,除正常对照组外,各组间皮细胞均有损伤,LPS+4.25%透析液组的间皮细胞损伤最为明显,而且胞浆中出现明显的肌丝和密体。结论TGFβ1/Smads信号蛋白的活化是高浓度葡萄糖透析液和LPS导致大鼠腹膜发生纤维化的共同作用途径。高浓度葡萄糖透析液和LPS可能协同作用通过TGFβ1/Smads通路刺激腹膜间皮细胞转分化,介导腹膜纤维化的发生。
张晨静[8]2016年在《TGFβ1对叁阴性乳腺癌肝转移及干细胞特性的作用研究》文中研究说明第一部分TGFβ1对叁阴性乳腺癌肝脏转移的作用研究研究背景:我们课题组前期的研究发现TGFβ1在叁阴性乳腺癌中特异性的高表达,但是这种高表达是否参与对叁阴性乳腺癌的调控研究仍较少。本实验,我们主要在体探讨了 TGFβ1对叁阴性乳腺癌体内成瘤、局部侵袭及肝脏转移能力的影响。研究方法:将对照组及经TGFβ1反复处理的叁阴性乳腺癌MDA细胞注入3-4周大的雌性裸鼠乳腺脂肪垫中建立乳腺癌原位模型。观察原位肿瘤的生长情况及肝脏转移情况。4-5周左右处死小鼠,HE染色观察对照组及TGFβ1组乳腺癌原位肿瘤及肝脏转移灶。利用免疫组化染色对照组及TGFβ1组原位及肝脏肿瘤灶Ki67、α-MSA及KRT8等相关乳腺癌免疫组化指标,以判断转移灶来源。研究结果:与对照组相比,TGFβ1处理组叁阴性乳腺癌细胞裸鼠原位成瘤能力增加,HE染色显示TGFβ1预处理增加了叁阴性乳腺癌局部侵袭能力。同时,肝脏大体观及HE染色结果显示TGFβ1预处理增加了叁阴性乳腺癌肝转移的能力。免疫组化结果显示肝脏转移灶来源于原位肿瘤灶。研究结论:我们的结果提示TGFβ1预处理能够增加叁阴性乳腺癌体内成瘤、局部侵袭及肝脏转移能力。第二部分TGFβ1对叁阴性乳腺癌干细胞特性的作用研究研究背景:研究普遍认为干细胞是肿瘤转移的根源。近年来研究发现,TGFβ配体和它的信号元件在人乳腺癌干细胞的调控中起到了极其重要的作用。我们的前期研究也发现TGFβ1在叁阴性乳腺癌细胞中特异性表达升高,高度提示TGFβ1可能参与叁阴性乳腺癌干细胞的调控。因此,本实验中,我们主要探讨TGFβ1对叁阴性乳腺癌干细胞及其特性的影响。研究方法:首先,利用流式细胞术分析TGFβ1对乳腺癌干细胞样CD44+/CD24-表型的作用;其次,通过RT-PCR检测乳腺癌细胞腺上皮标志物(KRT8、KRT18)和间质/肌上皮标志物(KRT14、ACTA2)的表达,从而研究TGFβ1对乳腺癌干细胞样间质细胞表型的作用影响;然后,RT-PCR检测TGFβ1对乳腺癌干细胞球的干性相关转录因子OCT4、SOX2、NANOG表达的作用;之后,成球实验及成球效率评估TGFβ1对乳腺癌干细胞自我更新能力的影响;随后,利用TGFβ1受体阻断剂研究TGFβ1对乳腺癌干细胞自我更新能力的影响是否通过其受体发挥作用的;最后,3D培养检测TGFβ1对乳腺癌干细胞球侵袭能力的作用。研究结果:我们的结果显示:TGFβ1增加叁阴性乳腺癌中CD44high/CD24-/low干细胞群比例;TGFβ1增加叁阴性乳腺癌干细胞样间质细胞表型;TGFβ1促进干细胞成球并增加干性标志物的表达;TGFβ1增强叁阴性乳腺癌干细胞的自我更新能力;TGFβ1增强叁阴性乳腺癌干细胞的自我更新能力能够被其受体抑制剂阻断;TGFβ1增强叁阴性乳腺癌干细胞的侵袭能力。研究结论:我们的结果提示TGFβ1能够增强叁阴性乳腺癌的自我更新能力等干细胞特性。第叁部分CDK4参与TGFβ1对叁阴性乳腺癌干细胞的调控研究研究背景:细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)为细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的配体,通常与cyclinD1结合并被激活来发挥细胞周期调节的作用。研究发现CDK4促进胚胎干细胞、造血干细胞、神经干细胞及乳腺前提细胞增殖并抑制其分化。提示CDK4可能也在乳腺癌干细胞的增殖及转移中发挥了重要的作用。前期我们的研究也发现TGFβ1可以提高叁阴性乳腺癌中CyclinD1/CDK4的表达,猜测CDK4可能在TGFβ1参与的叁阴性乳腺癌干细胞调控中发挥重要作用。因此,本部分实验主要探讨CDK4是否作为TGFβ1的下游底物,介导了其对叁阴性乳腺癌干细胞的调控。研究方法:流式细胞术检测对照组、CDK4蛋白沉默组及CDK4激酶抑制剂组SUM159中CD44+/CD24-干细胞比例;成球实验及成球效率检测不同组(对照组、CDK4蛋白沉默组、CDK4激酶抑制剂组、TGFβ1组、CDK4激酶抑制剂+TGFβ1组)SUM159干细胞自我更新能力,RT-PCR检测不同组导管上皮细胞标志物(KRT8,KRT18)及间质细胞标志物(ACTA2,KRT14)的表达。免疫共沉淀(Co-IP)及Western blot技术检测对照组及TGFβ1组CyclinD1、CDK4、p-RB等蛋白的表达。研究结果:沉默CDK4蛋白或使用CDK4激酶抑制剂能够降低叁阴性乳腺癌中CD44+/CD24-干细胞比例及自我更新能力,抑制叁阴性乳腺癌干细胞样间质细胞表型。TGFβ1上调CDK4蛋白表达及激酶活性,CDK4激酶抑制剂可以阻断TGFβ1增强叁阴性乳腺癌干细胞自我更新能力及维持其间质样表型的作用。研究结论:这些结果提示CDK4蛋白本身在维持叁阴性乳腺癌干细胞自我更新及间质样表型中发挥重要的作用,TGFβ1可能是通过上调CDK4蛋白及其激酶活性来维持叁阴性乳腺癌干细胞自我更新能力及干细胞样间质细胞表型的。第四部分肿瘤干细胞与叁阴性乳腺癌肝转移及预后相关分析研究背景:近年来,很多临床数据库的开发与建立为多种不同来源的肿瘤研究提供了有效的生物信息学分析。因此,本部分研究主要利用Kaplan Meier Plotter、TCGA Cancer Browser以及GOBO geneset数据库对叁阴性乳腺癌中肿瘤标志物,TGFβ1和CDK4做相关生物信息学分析。研究方法:首先利用Kaplan Meier Plotter对CD44及CD24的基因表达与249例叁阴性乳腺癌患者的预后进行生物信息学分析。然后利用UCSC Cancer Browser对TCGA数据库1215例乳腺癌患者中叁阴性乳腺癌肝转移患者进行CD44及CD24的基因表达的生物信息学分析。之后,利用GOBO基因分析工具对51株已报道的叁阴性乳腺癌细胞系中CD44及CD24的基因表达进行分析。最后,利用GOBO基因数据库分析TGFβ1及CDK4在叁阴性乳腺癌中的表达。研究结果:生物信息学分析提示CD44高表达/CD24低表达患者无复发生存率(RFS)较低,且叁阴性乳腺癌伴肝转移患者肿瘤干细胞表面标志物CD44高表达,而CD24低表达。TGFβ1、CDK4在叁阴性乳腺癌细胞系中的表达较高。研究结论:TCGA及GOBO geneset等数据库生物信息学分析提示叁阴性乳腺癌中CD44high/CD24low/-干细胞含量较高,且TGFβ1及CDK4可能与叁阴性乳腺癌干细胞调控相关,与我们的研究结果TGFβ1/CDK4参与叁阴性乳腺癌干细胞调控一致。
郑宗基[9]2016年在《miR-26a和miR-30c协同调控TGF β1诱导肾小管上皮细胞转分化在糖尿病肾脏病中的作用机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病患者常见的慢性微血管并发症,其发病率随着糖尿病的快速增长而逐年上升,已成为终末期肾病的主要原因,DKD的防治也成为内分泌科和肾脏科医师面临的难题之一。然而该病的发病机制迄今尚未完全阐明,既往认为DKD的早期病变部位主要在肾小球,近年来的研究发现肾小管病变无论从发病时间或发病机制看均有其独立性,并且肾小管病变及肾间质纤维化的程度与肾功能的相关性比肾小球硬化与肾功能的相关性更为密切,故肾小管间质纤维化的发生机制越来越受到人们重视。肾间质纤维化是DKD的重要的病理特征,表现为细胞外基质(ECM)的沉积,主要包括胶原和纤连蛋白沉积。肌成纤维细胞是产生ECM的重要来源。肾小管上皮细胞在病理条件下失去上皮细胞的特性而获得肌成纤维细胞的特性,转化为间质肌成纤维细胞的过程称为上皮间质转化(EMT)。研究表明肾小管上皮细胞转分化是肌成纤维细胞的重要来源,且在糖尿病肾脏病的发生和发展中起重要的作用。阻止EMT可能是延缓小管间质损伤进展的主要措施。因此进一步寻求阻断肾小管上皮细胞损伤及肾间质纤维化作用的手段,将是今后研究防止DKD持续进展和保护肾功能的重要目标。微小RNA(miRNA)是长约22个碱基的短链非编码RNA,它通过与靶基因的3’非翻译区(3'UTR)结合,使靶基因沉默或者降解,起到转录后调节靶基因的表达的作用。目前已经发现了超过2000种人类的miRNA,以及超过60%的人类蛋白编码基因接受miRNA的调控。因此miRNA靶向调控大量的基因,从而参与了众多疾病发生和发展的过程。近年来的研究表明,miR-26和miR-30家族在多器官组织的纤维化、凋亡等病理生理进程中发挥重要的作用。在特发性肺纤维化细胞模型中,miR-26a通过抑制靶基因Lin28B进而调控let-7d的表达,从而抑制肺纤维化。NF-κB调控miR-26a的表达,而miR-26a进一步靶向调控Col-Ⅰ和CTGF,从而缓解心肌纤维化。在猪肾血管疾病模型中,通过原位杂交技术发现miR-26a主要表达在肾小管细胞中,且在肾血管疾病模型中表达显着降低,同时抑制miR-26a则可诱导肾小管上皮细胞凋亡和调节促凋亡蛋白表达。miR-133和miR-30c均通过抑制靶基因CTGF从而缓解了心肌纤维化。miR-30通过靶作用于Notch1和p53从而抑制足细胞损伤。但是在糖尿病肾脏病肾纤维化,尤其是在肾小管上皮细胞EMT进程中,miR-26a和miR-30c的研究较少,因此本研究旨在探索miR-26a和miR-30c在糖尿病肾脏病肾小管上皮细胞EMT中的作用以及具体机制。最近研究表明miRNA不但可以调控多个基因,多个miRNA也可以同时调控一个基因的表达,形成一张复杂的调控网络,从而更加精确地对机体进行调控。然而,目前在miRNA领域,大多数研究探索单一miRNA对单一靶点的影响,近年来,多个miRNA协同靶作用于一个基因和单一niRNA同时调控多个靶点正在成为热点,比如在乳腺癌中,miR-143和miR-145协同调控靶基因ERBB3从而抑制细胞增殖和侵袭。此外,miR-455同时靶作用于Necdin、 Runxltl和HIF1an叁个转录因子,从而调控棕色脂肪细胞的分化。目前在DKD领域,探索多个miRNA协同参与糖尿病肾脏病的研究较少。本研究致力于探索miR-26a和miR-30c是否能分别调控糖尿病肾脏病的进展,同时探索miR-26a和miR-30c是否具有协同作用。首先,我们使用TGFβ1 (10ng/ml)刺激肾小管上皮细胞(NRK-52E),比较miR-26a与miR-30c以及纤维化相关基因的表达,同时我们检测了40周龄OLETF大鼠皮质中niR-26a与miR-30c的表达,进一步在体内验证miR-26a、miR-30c与DKD的关系；通过生物信息学方法,我们预测miR-26a和miR-30c均靶作用于CTGF,同时预测Snail1为miR-30c的靶基因,并且进行荧光素酶报告基因实验证明假设；接下来我们在NRK-52E细胞中分别和同时过表达或敲除miR-26a与miR-30c,探索miR-26a与miR-3Oc是否协同作用于肾小管上皮细胞EMT。机制部分,我们进一步探索miR-26a与miR-30c是否同时调控ERK1/2和p38 MAPK信号通路,并同时敲除miR-26a与niR-30c的靶基因CTGF和Snail1,观察是否这两个转录因子存在协同调控EMT的作用。方法1.细胞培养将冻存的大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E)置于37℃中水浴锅中复苏,培养于DMEM高糖培养基中(含10% FBS),并在37℃、5%C02培养箱中孵育。每2-3天更换新的培养基。2.细胞转染(1)miRNA的mimic和inhibitor转染转染前一天,细胞接种于12孔板中,每孔铺约3*104个细胞。第二天采用lipo3000进行瞬时转染(操作按lipo3000转染试剂说明书进行)。miRNA的mimic转染浓度为50nM, miRNA的inhibitor转染浓度为150nM,共转染2种miRNA的]mimic/inhibitor时,则每种mimic/inhibitor用量减半,保证每组miRNA的mimic/inhibitor用量相等。(2) siRNA瞬时转染转染前一天,细胞接种于12孔板中,转染时每孔铺约3*104个细胞。第二天采用lipo3000进行瞬时转染(操作按lipo3000转染试剂说明书进行)。siRNA转染浓度为50nM。共转染2种siRNA时,则每种siRNA用量减半,保证每组siRNA用量相等。(3)质粒和mimic共转转染前一天,细胞接种于24孔板中,转染时每孔铺约1.5*104。第二天采用lipo3000进行瞬时转染(操作按lipo3000转染试剂说明书进行)。24孔板中mimic的转染量为50nM,荧光素酶报告基因质粒转染量为1μg,内参β-gal质粒转染量均为0.2μg。共转染2种miRNA的mimic时,则每种mimic用量减半,保证每组niRNA的mimic用量相等。3.RNA提取、逆转录和实时荧光定量PCR (qRT-PCR)Trizol法提取细胞组织总RNA,使用分光光度计定量核酸。使用M-MLV逆转录酶试剂将RNA逆转录为cDNA。使用SYBR法进行实时荧光定量PCR反应。基因表达量按2-△△Ct方法计算得出。β-actin作为内参基因。4. Western blot使用RIPA法提取组织或细胞总蛋白,BCA法测定样品蛋白浓度,100-C水变性蛋白。配制8%-15%的SDS-PAGE胶,电泳分离样品蛋白,湿转目的蛋白到PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉或者5%BSA的TBST封闭PVDF膜,将目的蛋白的一抗稀释后与PVDF膜在4-C摇床上孵育过夜。第二天,PVDF膜置于TBST洗涤,再与荧光二抗(1：15000)避光孵育1h,再次置于TBST洗涤后,在Odyssey近红外成像系统进行发光显影,并用凝胶图像分析系统(Quantity One)分析结果。5.动物实验实验使用40周龄自发性2型糖尿病大鼠(OLETF鼠,n=3)和同系野生型非糖尿病大鼠(LETO鼠,n=3)肾组织。大鼠由日本大冢制药株式会社德岛研究所提供,在无特定病原体(SPF)条件下单笼标准饲料喂养。肾脏冻存于液氮中保存。6.肾组织病理学收集液氮中冻存的肾组织,用4%多聚甲醛固定24h,石蜡包埋、切片。Masson染色法用于观察肾组织的形态结构；免疫组织化学法用于分析CTGF和Snail 1的表达情况。肾组织切片被兔抗CTGF多克隆抗体以1：100或兔抗Snail 1多克隆抗体以1：100孵育,再用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的二抗孵育,最后苏木素复染。正置显微镜观察所有染色切片。7.荧光素酶报告基因实验构建野生型CTGF和Snail 1的3'UTR区载体,使用快速点突变试剂盒突变与3'UTR区位点结合的miRNA的种子序列区。按照碧云天荧光素酶试剂盒说明书在多功能酶标仪上测定RLU值以及检测p-半乳糖苷酶的吸光度。8.统计分析采用SPSS21.0统计软件进行处理,各指标数据采用均数±标准误(X±SEM)表示。多组均数比较采用单向方差分析(One-way ANOVA),多重比较采用LSD法(Least-significant difference test);方差不齐时,用Welch法校正,多重比较采用Dunnett's T3法。正态分布两两比较采用两独立样本t检验。非正态分布采用Mann-Whitney U检验。P<0.05时被认为差异具有统计学意义。结果1. miR-26a和niR-30c在TGFβ1诱导的NRK-52E细胞和OLETF大鼠肾皮质中的变化10ng/mLTGFβ1刺激NRK-52E细胞72h, Western Blot和qRT-PCR检测均发现：与Control组相比,TGFβ1组中FN、Col-Ⅰ、α-SMA、CTGF和Snail 1表达均显着升高,E-cadherin表达显着下降。同时,qRT-PCR法检测发现：与Control组相比,TGFβ1组中miR-26a和miR-30c表达均显着下降。这表明miR-26a和miR-30c均可能参与到DKD的进程。取我们实验室既往保存于液氮中的40周龄的LETO和OLETF大鼠肾脏皮质,通过masson染色证实40周龄的OLETF大鼠肾脏出现明显的肾间质纤维化。免疫组化和western blot结果均显示,与LETO非糖尿病大鼠相比,OLETF大鼠肾皮质CTGF和Snail 1蛋白表达明显升高。通过qRT-PCR检测发现,与LETO非糖尿病大鼠相比,OLETF大鼠肾皮质的miR-26a和miR-30c的表达均显着下调。这进一步表明,miR-26a和]miR-30c可能参与DKD的发病进程。2. miR-26a和miR-30c通过靶基因CTGF和Snail 1协同调控TGFβ1诱导的EMT1)靶基因鉴定a) Targetscan生物信息学软件预测CTGF基因3'UTR区中含有miR-26a和miR-30c的结合位点,而Snail 1基因3'UTR区中也含有miR-30c的结合位点。荧光素酶报告基因实验证实了miR-26a和miR-30c均靶作用于CTGF且具有协同作用,而miR-30c靶作用于Snail1。b) Western blot和qRT-PCR检测均证明转染miR-26a或miR-30c的mimic下调CTGF的表达,共转染miR-26a和miR-30c的mmic具有协同下调CTGF的作用；而转染miR-30c的mimic下调Snail 1的表达。2) miR-26a和miR-30c协同调控NRK-52E细胞EMTa) Western Blot和qRT-PCR检测均证明：在存在TGFβ1的情况下,转染miR-26a或niR-30c的mimic均下调FN、Col-Ⅰ和α-SMA,上调E-cadherin;共转染miR-26a和miR-30c的mimic则协同下调FN、Col-Ⅰ和α-SMA,并且协同上调E-cadherin。b)在存在TGFβ1的情况下,转染miR-26a或miR-30c的inhibitor上调FN、 Col-Ⅰ、α-SMA,同时下调E-cadherin。共转染niR-26a和miR-30c的inhibitor协同上调FN、Col-Ⅰ、α-SMA,同时协同下调E-cadherin。3. miR-26a和miR-30c协同调控TGFβ1诱导的EMT的机制探讨1)我们进一步探讨miR-26a和niR-30c协同调控NRK-52E细胞EMT的具体机制,既往的研究表明,CTGF调控下游的ERK1/2和p38 MAPK信号通路,因此我们进一步探索miR-26a和miR-30c是否协同调控ERK1/2和p38MAPK信号通路。结果表明：miR-26a和miR-30c协同抑制ERK1/2和p38 MAPK蛋白的磷酸化。这说明miR-26a和miR-30c可能通过协同抑制CTGF进而调控ERK1/2和p38 MAPK信号通路。2) miR-26a和miR-30c也可能通过CTGF和Snail1这两个转录因子进而起到协同作用。我们进一步探索CTGF和Snail 1这两个转录因子是否具有相互作用。在TGFβ1存在和不存在的情况,转染siCTGF对Snail1无明显的影响,转染siSnail1对CTGF也无明显的影响,这说明CTGF与Snail1为互相独立的转录因子。同时我们探索CTGF和Snail1转录因子是否协同调控NRK-52E细胞EMT。与对照组相比,分别转染CTGF或者Snail1的siRNA于NRK-52E细胞显着缓解TGFβ1诱导EMT。但是共转染CTGF和Snail1的siRNA于NRK-52E细胞并没有观察到明显的协同抑制EMT的效应。结论1、miR-26a和miR-30c在TGFβ1诱导的NRK-52E细胞以及在40周龄的OLETF大鼠肾脏皮质中表达明显下调；2、荧光素酶报告基因实验证实miR-26a和miR-30c协同靶作用于与CTGF, miR-30c靶作用于Snail1;过表达miR-26a或niR-30c分别下调CTGF表达,同时过表达niR-26a和miR-30c则协同下调CTGF表达。过表达miR-30c下调Snail1表达；3、与单独转染miR-26a和miR-30c的mimic (inhibitor)相比,共转染miR-26a和miR-30c的nimic (inhibitor)协同抑制(增强)TGFβ1诱导的EMT；4、共转染miR-26a和miR-30c的mimic协同抑制TGFβ1诱导的ERK1/2和p38 MAPK信号通路的激活；5、CTGF和Snail1为相互独立的转录因子；分别抑制CTGF或S
吕洛, 陈玉林, 章庆国[10]2004年在《增生性瘢痕转化生长因子β及其受体的分布及表达》文中进行了进一步梳理目的 探讨转化生长因子 β(TGF β)及其受体在增生性瘢痕形成中的作用机制。 方法 收集临床手术切除后的正常皮肤组织 7例和增生性瘢痕组织标本 11例 ,用免疫组织化学和原位杂交的方法检测TGF β及其TGF β受体 (TGFR)Ⅰ、TGFRⅡ在组织中的定位分布、蛋白和mRNA表达。 结果 在正常皮肤组织中 ,与TGF β1 、TGF β2 、TGFRⅠ比较 ,TGF β3和TGFRⅡ呈较高表达 ;在增生性瘢痕组织中则呈现与正常皮肤组织中的表达相反的结果。与正常皮肤组织相比 ,增生性瘢痕组织中TGF β1 、TGF β2 和TGFRⅠ的蛋白和mRNA表达均明显增加 ,而TGF β3和TGFRⅡ的蛋白以及mRNA表达相对减少。 结论 创面愈合过程中TGF β及其受体不同水平的表达与增生性瘢痕的形成直接相关。
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