徐佳楠 何树森 李天舒 杨慧萍 潘明
(四川省疾病预防控制中心微生物检验所 610041)
【摘要】 目的：比较4种试剂盒对流感病毒RNA提取的相对效率、成本和耗时情况，为临床流感病毒RNA提取检测提供参考。方法：将流感病毒参考株悬液作10-1-10-4系列稀释，采用4种试剂盒对实验样本进行核酸提取，采用荧光RT-PCR对其提取效率进行平行检测，比较分析这4种试剂盒对流感病毒RNA提取效率的差异和试剂盒价格及提取时间。结果：各试剂盒提取不同稀释度流感病毒样本的相对效率存在显著差异，其中High Pure Viral RNA Kit提取效率最高。综合相对提取效率、成本等因素，性价比较高的为B试剂盒。结论：不同核酸提取试剂盒可影响RT-PCR对病毒核酸提取的检测效果，临床各实验室应综合实验的目的和自身实验室条件等因素进行合理选择。
【关键词】 流感病毒；RNA病毒；荧光RT-PCR
【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）21-0381-02
病毒RNA提取效率往往直接影响到检测效率。临床样本病毒含量往往较低,病毒核酸提取效率的高低对实验阳性检出率影响较大[1]。以往病毒核酸提取采用的酚以及Trizol等试剂,其提取率相对较低,且步骤繁杂。近几年市场上出现了多种病毒RNA提取试剂盒，极大地简化了提取操作步骤，也给操作人员提供了多种选择。本文针对市售的4种流感病毒RNA提取试剂盒，在提取效率、耗时及成本等方面进行比较，为使用者合理选择试剂提供参考依据。
1.材料与方法
1.1 样本来源 病毒株由本实验室提供，对其作10-1-10-4系列稀释，获得不同浓度的流感病毒；稀释方法是取流感病毒保存株一管，室温解冻后混匀，12000r/min离心15min，取上清液100ul，加入900ul 0.01mol/L PBS液，充分混匀，再取100 ul加入900 ul PBS 液。如此重复，共稀释4个梯度。疑似流感患者含漱液标本4份, 由我省市级疾控中心提供。
1.2 试剂盒
1.2.1 核酸提取试剂盒 试剂盒A(High Pure Viral RNA Kit，德国Roche公司)批号：133199741；试剂盒B批号：2012003；试剂盒C 批号：2013001；试剂盒D批号：H20130801。其中，A为进口试剂盒，其余均为国产试剂盒。所有试剂盒均批检合格并在有效期内使用。
1.2.2 体外转录试剂盒 RibomaxTM Large Scale RNA Production Systems-SP6，Promega公司。
1.3 引物与探针的设计 用于实时荧光定量RT-PCR实验的引物和探针参照文献[2-3]，根据流感病毒基因及复合探针设计原则设计引物、探针。引物和探针均由本室自行合成。
1.4 仪器 荧光RT-PCR检测采用MJ公司Research Option 2荧光检测系统。
1.5 方法
1.5.1 核酸提取方法 RNA提取试剂盒A、B、C、D、E均按说明书进行。每个试剂盒均对每种浓度样本平行做3次核酸提取，最后均获得50ul RNA溶液。
1.5.2 体外转录RNA的制备 实验采用外标定量,将流感病毒特异性PCR产物通过A/T载体,连接到pGEM-T载体上,转化至DH 5a大肠埃希菌中,PCR鉴定挑取阳性克隆,并通过序列测定分别进行验证,然后抽提出质粒DNA, 测定核酸浓度,作为定量的外标准品。
1.5.3 实时荧光定量(RT-PCR)检测方法 实验反应体系采用罗氏公司的Titan One Tube RT-PCR Kit,进行荧光定量RT-PCR扩增流感病毒核酸。扩增条件为45℃30 min逆转录, 94℃2min、93℃ 15s、60℃ 1min，读板,共40个循环。
1.56 统计学分析
采用随机区组方差分析及t检验进行分析，所有分析均采用SPss18.0统计软件进行处理。
2.结果
2.1 不同试剂盒对流感毒株提取效率的比较
以系列稀释的10-1-10-4 流感病毒中所提取的RNA做为模板，分别用4种方法平行提取病毒核酸,然后进行RT-PCR检测。由CT值推算病毒cDNA含量，如表1所示，均以High Pure Viral RNA Kit检测的cT值最低，即模板拷贝数最高。若以CT值37为阈值，High Pure Viral RNA Kit最低可提取至10-4稀释度，B试剂盒最低也可提取至10-4稀释度，C试剂盒可提取稀释度在10-3-l0-4之间的样本，D试剂盒仅能提取稀释度为l0-3 的样本。
表1 4种试剂盒对不同稀释度流感病毒的提取结果比较
试剂盒
名称流感病毒的不同稀释度
10-110-210-310-4
A27.74（3.79）31.97（2.64）34.29（2.26）37.88（1.22）
B28.99（3.58）32.18（2.57）34.58（2.09）37.96（1.19）
C29.98（3.30）33.69（1.68）36.45（1.62）38.60(1.08)
D31.89（2.68）34.89（2.14）35.57（1.82）-
* 表中数字为荧光定量RT-PCR 反应中的CT值, 括号中数字为cDNA 拷贝数指数。
2.2 不同试剂盒提取重复性分析
分别以每种试剂盒3次平行提取病毒RNA为模板进行扩增，对其重复性进行分析。A、B、C、D试剂盒变异系数（CV）分别为：0.67%、1.61%、1.19%、和1.35%，4种试剂盒提取病毒RNA的重复性无明显差异。
2.3不同试剂盒对临床样本检测比较
对4份临床阳性样本进行核酸提取及扩增检测，A、B、C、D试剂盒提取的CT值无明显差异，但A、B试剂盒荧光强度较高。
图2 不同试剂盒对临床样本提取
2.4 不同试剂盒提取时间及价格比较
6种试剂盒中，以试剂盒A(High Pure Viral RNA Kit)价格最贵，需46元/人份，其次是C试剂盒19元/人份，B试剂盒16元/人份，D试剂盒14元/人份。C试剂盒病毒RNA提取操作最为简便，耗时最短，仅需55min，D试剂盒提取所需时间最长，需要65min，A和B试剂盒提取时间均为60min。
3.讨论
据文献报道，不同病毒核酸提取试剂盒的使用，直接影响病毒的提取检测效率[4]。对于使用者来说，选择一种检测效率高、精密度好且费用低廉的试剂盒至关重要[5]。本文采用德国Roche公司的High Pure Viral RNA Kit试剂盒与3种国产试剂盒进行水平检测，比较它们在提取效率、成本和时间等方面的差异结果发现，在提取效率方面，High Pure Viral RNA Kit试剂盒最高，对数换算后进行比较，各试剂盒存在显著差异；在重复性方面，4种试剂盒无明显差异；对4份流感患者咽拭子的提取检测中，A、B、C、D试剂盒均能检出，但A、B试剂盒的荧光强度较高；在提取耗时方面，以D试剂盒操作步骤最简便，耗时最短，C试剂盒提取耗时最长；在提取成本方面，High Pure Viral RNA Kit试剂盒最贵，D试剂盒价格最为低廉，提取每人份仅需14元人民币。
综上所述，High Pure Viral RNA Kit试剂盒在提取效率等方面优势明显，但价格昂贵，一般实验室采用可能性不大。3种国产试剂盒中，综合提取效率、检测耗时及成本等，以B试剂盒的性价比最高，其提取效率高、提取耗时短、操作简便且价格低廉。其次，C试剂盒也较为理想，其价格虽然较其他几种国产试剂盒稍贵，但检测灵敏度高、提取时间相对较短。因此，建议科研和临床实验室应根据目的、标本的病毒含量以及实验室条件等实际情况，合理选择病毒RNA提取试剂，以便利用最小的耗费，获得满意的实验效果。此外，在比较不同研究的结果时，也应注意到其所采用的试剂可能会对结果造成影响。
【参考文献】
[1] 李燕，王恩秀,陈溥言.几种提取RNA的方法[J]．生物技术，2012，12(4)：2O-21．
[2] 陈苏红，王小红，张敏丽等．复合探针荧光定量PCR方法的建立[J]．生物技术通讯，2013，14(2)：127-130．
[3] 李冬民，任吴超，王璇等．利用TRIzol试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总RNA [J]．西安交通大学学报(医学版)，2009，30(5):639-642．
[4] 张丽，杨莲茹，吴绍强．核酸提取方法的研究进展[J]．中国动物检疫，2011,28(12)：75-78.
[5] 赵仪，陈苏红，刘志红等．6种核酸提取试剂盒对甲型H1N1流感病毒核酸提取效果的比较[J]．军事医学科学院院刊，2010,34(20:111-114.
论文作者:徐佳楠,何树森,李天舒,杨慧萍,潘明
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第21期供稿
论文发表时间:2015/10/13
标签：试剂盒论文; 病毒论文; 核酸论文; 流感论文; 效率论文; 荧光论文; 样本论文; 《医药前沿》2015年第21期供稿论文;