【摘要】目的：建立超高速液相色谱--串联质谱联用法检测食品中灭蝇胺残留量的方法。方法：样品匀浆后经乙腈水提取酸化后经以C18固相萃取柱净化，应用超高速液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱仪多离子反应监测（MRM）定量法检测。结果：经方法学确认，该方法对灭蝇胺的检出限为1.0ug/kg，定量限为1.0ug/kg。在5.0～200.0的线性范围内，相关系数r>0.9999，回收率78.2%～95.6。结论：方法灵敏度高、定量准确、测定浓度范围广，是食品中灭蝇胺含量检测的理想方法。
【关键词】超高速液相色谱--串联质谱联用法 多离子反应监测（MRM） 固相萃取 灭蝇胺
【中图分类号】R155.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）35-0103-02
灭蝇胺（Cyrov maziane）是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，是强内吸性昆虫生长调节剂。主要用于防治菜豆、叶菜类和瓜类的美洲斑潜蝇和潜叶蝇等农业害虫。是我国农业部推荐的无公害农药。为了保证食用安全，我国已制定了其在农产品中的残留限量是0.2mg/kg,由于灭蝇胺可以添加到动物饲料中用于控制畜禽养殖场苍蝇的生长发育，农业部将灭蝇胺批准为三类新兽药。许多养殖户没有严格按照休药期的规定，会造成鸡蛋和肉等动物产品中的药物残留[1]。
现有的灭蝇胺检测方法多采用气相色谱-质谱法[2]和高效液相色谱法（HPLC）[3-4]由于灭蝇胺属于极性化合物，需衍生才能气化，因此采用GC-MS检测时过程较为繁琐：HPLC法易受杂质干扰且灵敏度较低。本研究建立检测食品中灭蝇胺残留量的超高速液相色谱-串联质谱联用法，其中食品包括谷物、水果、蔬菜及禽肉、内脏、奶、蛋等不同种类样品。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Acuqity-TOQ超高效液相色谱-串联质谱仪（UPLC-MS/MS）,Acquilty UPLC BEH C18色谱柱（Waters公司），灭蝇胺标准品（纯度99.0%，德国 Dr.Ehrenstofer Gmbh公司）。乙腈（色谱纯，Merck公司），氨水、盐酸（分析纯，广州化学试剂厂），AccuBONDⅡ ODS-C18 Cartridges 500 mg 6ml(Agilent 公司)。
1.2 标准物质溶液的配制
准确称取灭蝇胺标准品0.01g(精确到0.0001g)，用色谱纯乙腈溶解并定容至100ml,配成浓度为100mg/L的标准储备液，吸取标准储备液1.0ml，用色谱纯乙腈溶解并定容至100ml,配成浓度为1mg/L的中间储备液。上述标准溶液储存于冰箱（0～4℃）中。使用时用流动相稀释储备液制备标准工作溶液，用于绘制和校准曲线。
1.33 样品的前处理
将样品切碎，充分混匀，放入组织捣碎机中捣碎成匀浆，准确称取20g(精确到0.01g)，置于100ml聚乙烯具塞离心管中，加入30ml水-乙腈（1：9）溶液，超声30分钟，离心并过滤，残渣继续用30ml水-乙腈（1：9）溶液分两次超声提取，每次30分钟，合并所有提取液，用0.2mlo/L的盐酸溶液调节pH=2，并用水-乙腈（1：9）溶液定容至100ml，混匀。准确吸取10ml提取液，待过柱净化。用5ml乙腈和5ml超纯水预淋洗活化AccuBONDⅡ ODS-C18萃取柱，将10ml提取液转移到萃取柱中，然后分别用水和乙腈各5ml洗涤，弃掉流出液，抽干萃取柱后用5ml氨水-乙腈（1：9）溶液洗脱，重复两次，收集洗脱液。于40℃水浴氮气吹干，用流动相溶解残渣，定容至2ml，过0.22um微孔有机滤膜，待测。
1.4 色谱质谱条件
1.4.1 超高效液色谱条件
色谱柱：Waters Acquilty UPLC BEH C18(1.7um，2.1×100mm),进样体积10ul，流速：0.3ml/min,,流动相梯度见表1.
表1 色谱分离梯度条件
1.4.2 MS/MS质谱条件
离子化方式：ESI+，毛细管电压：3.00KV，锥孔电压：22V，二级锥孔电压：3V，RF电压：0.3V;离子源温度：100℃，锥孔反吹气流量：50L/hr，脱溶剂气流量：800L/hr。
质量分析器：低端分辨率 LM Lens1：13.5V，高端分辨率HM Lens1：13.5V，离子能量：1：0.5,入口透镜电压：1V，出口电压：1.0V，低端分辨率 LM Lens2：13.5V，高端分辨率HM Lens2：13.5V，离子能量：2：0.5。
采用MRM多反应离子检测模式，以保留时间、母离子m/z167及两个子离子m/z125、85进行定性分析，以子离子m/z125进行定量分析。在此条件下，灭蝇胺的MRM色谱图见图1。
图1 样品中灭蝇胺的MRM色谱图
2 结果与讨论
2.1 色谱柱选择
UPLC采用的色谱柱填料粒径为1.7umC18与常规5um C18色谱柱相比较，能获得更大的比表面积，使柱效显著提高，大大减少色谱分离时间，灭蝇胺的出峰时间为1。95min，其流速为0.3ml/min，与电喷雾离子化方式相匹配，是UPLC液相系统的必备选择。
2.2流动相的选择
考虑到色谱分离情况、样品杂质的洗脱以及与质谱条件的匹配，选择水和乙腈作为流动相，并且在流动相加入0.2%的甲酸，虽然对其保留时间和峰形影响不大，但可以增加其在进入质谱前离子化效率，提高检测的灵敏度。
2.3质谱条件的优化
根据灭蝇胺的分子结构，选择ESI（+）作为电离化模式，将灭蝇胺标准品配制成1mg/l的乙腈溶液，采用全扫描方式找出其母离子。使用Daughter扫描的方式选择子离子，逐步加大诱导膨胀能量，随着母离子丰度逐渐增加，子离子丰度逐渐增加，选用子离子m/z125作为定量和辅助定性离子，并确定其最佳诱导碰撞能量的范围，最后在MRM方式中进一步调整碰撞能量，以便获得灭蝇胺的最大灵敏度。
2.4 标准曲线线性范围和回归方程
配制浓度为5.0、10.0，50.0，100.0，200.0ug/L的灭蝇胺标准溶液,取10ul进样,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,得标准曲线Y=846.34+50.89,相关系数为0.999985。其线性范围为5.0～200.0ug/L。
2.5 检出限与定量限
用空白样品基质溶液将灭蝇胺配制成浓度为5.0，4.0，3.0，2.0，1.0的标准溶液后进样。以信号噪比为3倍时的溶液浓度为检出限，以信号噪比为10倍时的溶液浓度为定量限。灭蝇胺的检出限为1.0ug/kg，定量限为4.0ug/kg。
2.6精密度和回收率实验
取灭蝇胺检测低于检出限的样品作为实验样品，加入一定量的灭蝇胺标准溶液后，按上述方法进行预处理后重复进样10次，结果见表2。可见，精密度在%～%之间，回收率在%～%之间，高、中、低浓度均获得良好的重现性。
表2 方法精密度和回收率试验
3 结论
本法可适用于谷物、水果、蔬菜及禽肉、内脏、奶、蛋等不同种类样品中灭蝇胺的测定，具有快速、准确、灵敏度高、适用范围广等优点，较以往方法灵敏度更高、选择性更优、重现性更好。
参考文献
[1] 宁章勇，新型兽药-环丙氨嗪[J]，兽药与饲料添加剂，2011，（4）：18-19。
[2] 李峰格，姚伟琴，田延河，等。固相萃取净化-微波辅助衍生-气相色谱-质谱法测定番茄酱中灭蝇胺及其代谢物三聚氰胺[J]。检验检疫学刊，2010，20（2）：1-7。
[3] 郭筠，莫汉宏，等。HPLC法检测灭蝇胺在黄瓜和土壤中的残留[J]。环境化学，2004，23（6）：700-703
[4] 王冉，刘铁铮，刘伟荣。SPE-HPLC法测定鸡蛋中灭蝇胺-环丙氨嗪[J]。浙江农业学报，2005，17（6）：376-379
广州市医药卫生科技项目（项目编号：201102A213056）资助
论文作者:周洪伟
论文发表刊物:《医药前沿》2013年第35期供稿
论文发表时间:2014-3-6
标签：色谱论文; 灭蝇论文; 溶液论文; 离子论文; 样品论文; 标准论文; 定量论文; 《医药前沿》2013年第35期供稿论文;