（广西钦州市第一人民医院 广西钦州535000）
【摘要】目的 探究对结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB突变以PCR-反向点杂交法检测的效果。方法 设计结核分歧杆菌rpoB基因引物，采用PCR-反向点杂交法对40例结核杆菌临床菌株耐药性进行检测，对照由DNA测序法检测的标准结核分歧杆菌（H37Rv）rpoB基因，确定rpoB基因的变异情况，对PCR-反向点杂交法的灵敏度和准确性作出评价。结果 40株临床菌株中有11株利福平敏感株的基因序列与对照的H37Rv相同，剩下的29株耐药株中检测到变异基因27株，其特异性为100%，阳性率为93.1%。结论 rpoB基因本身高度保守,但由于rpoB 基因突变导致结核分枝杆菌对利福平耐药。本研究使用PCR-反向点杂交法针对rpoB基因高突变区设计引物，此方法快速、简便、准确, 能有效监测临床标本中结核分枝杆菌, 对临床早期诊治结核病有极大帮助。
【关键词】PCR-反向点杂交法；rpoB 基因；利福平；结核分歧杆菌
结核病是一种由分歧杆菌导致的常见可致命传染病，它不仅能感染并破坏人体对淋巴系统，还能对人体神经系统、泌尿系统、循环系统、皮肤、骨骼、关节等其他部位造成伤害，表现为发热、盗汗、呼吸障碍、咳嗽、咯血、胸痛等，因此，必须及时对结核病进行诊治，防止其对机体造成更大伤害。利福平（RFP）是临床上治疗结合病的常用药物，但由于结核杆菌常常对其具有耐药性且各地区耐药情况不同，普通的结核杆菌培养耗时较长、过程繁琐，已经不足以满足及时诊治的需求。PCR-反向点杂交法是一种能直接快速检测结核杆菌基因突变情况的技术，其特异性强，灵敏度高，适合临床快速检测。本研究中，通过用PCR-反向点杂交法对40株结核杆菌耐RFP分离株rpoB基因突变情况，对照结核杆菌标准株，了解rpoB基因突变与结核杆菌耐药性关系，并对PCR-反向点杂交法效果进行分析，现报道如下：
1 资料和方法
1.1来源及特性 选取40株于2013年1月-2015年1月在我院治疗的活动性肺结核患者痰液标本分离的结核杆菌菌株，标准菌株同样来源于我院病原生物实验室，根据国家结核病诊断及细菌学检验标准[1]，对结核杆菌进行培养、鉴定及药敏试验。其中对利福平敏感菌株11株，结核杆菌耐药菌株29株，单耐药菌株18株，含量>50μg/ml,多耐药菌株11株，含量50~250μg/ml。
1.2方法 ①模板制备及PCR：40株实验菌株及标准菌株均从培养平板上挑取菌落5个，用5ml生理盐水混匀沸水浴10min，6000r/min离心5min，上清液为PCR模板。PCR扩增rpoB基因引物，范围包括RFP耐药决定区，上游引物DNA序列:5'-AAGGAGTTCTTCGGCACCAG-3'，下游引物:5'-GGTTTCGA TCGGGCACATCC-3'。引物250mmol/L、dNTP2.5mol/升，模板2μL、10×PCR缓冲液。条件：先94 ℃ 3min预变性，再 94℃ 30s、52 ℃ 30s、72 ℃30s，循环35次，最后72 ℃7min延伸。检测扩增产物：溴乙锭预染的2%琼脂糖凝胶电泳。②反向斑点杂交（RDB）：将膜条与PCR产物加入杂交试剂盒杂交液（2×SSC）中，水浴加热10min，42℃杂交4h，转移膜条至0.5×SSC液中，42℃轻摇并洗涤15min，避光显色20min，观察结果。若单链和H37Rv标准株单链位置不同，称运动变位，判定突变。
1.4 统计学分析 采用SPSS15.0软件进行数据处理和统计分析，计数资料用百分比（%）表示。
2 结果
若扩增成功（40株临床菌株均获得189bp阳性扩增产物）,则此引物对结核杆菌有特异性。对照标准菌株H37Rv,对比临床菌株RFP敏感株标准图谱，与对照相同的有11株,无rpoB 基因突变,其他29株RFP耐药株有27株SSCP带谱与对照不同,则有rpoB 基因的突变，对比药敏试验结果，其阳性检出率为93.1%。见表1
3 讨论
结核病是临床上常见传染病之一，严重的甚至导致死亡，利福平是治疗结核病的关键药物，它可以能结合RNA聚合酶β亚基，从而抑制转录起到杀菌效果,有研究表明，虽然结核杆菌RFP耐药性可能由多种原因导致，但RNA聚合酶β亚基通过rpoB基因编码，rpoB基因的耐药区发生突变是其产生耐药性的主要原因，因此如何快速、有效的检测出rpoB基因的突变是判断结核杆菌RFP耐药性的关键[2]。
传统RFP利福平耐药性检测方法一般通过培养的方法进行药物敏感实验，这个过程大约需要6~12周，极为耗时，容易贻误患者治疗，为满足现代短程化疗需要，通过PCR-反向点杂交法可以快速检测rpoB基因RNA聚合酶β亚基507~533位氨基酸耐药区点突变，这个过程大约只需要1~2d，具有特异性高、快速、简便等优点，并且与DNA测序检测结果的符合率高，能为医师用药提供有效指导作用，使患者得到及时治疗，减轻病人负担，符合临床上对结核杆菌快速检测的需求。本研究中发现，采用PCR-反向点杂交法检测的40例临床菌株，耐药菌株29例，其中又27株检测出阳性反应，阳性检出率高达93.1%,可见对结核分枝杆菌RFP耐药采用PCR-反向点杂交法具有操作简便、时间较短、检出率高等优点，与相关文献报告相一致[3]。
综上所述，采用PCR-反向点杂交法检测结核分枝杆菌利福平耐药性，快速有效，有临床推广价值。
参考文献
[1] 褚美芬,严杰,钟雅文等.快速检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药相关基因mPCR-SSCP建立及应用[J].中华微生物学和免疫学杂志,2012,32(7):655-660.
[2] 刘家云,徐修礼,孙惠平等.耐药结核分枝杆菌基因突变分析[J].中华检验医学杂志,2010,33(7):594-598.
[3] 邱媛,陶峰,孙爱华等.PCR-SSCP检测结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB突变[J].中国微生态学杂志,2013,25(5):571-573,576.
论文作者:黄丽静,陈焯彬,李崇建
论文发表刊物:《医师在线》2016年1月第2期
论文发表时间:2016/5/24
标签：菌株论文; 结核杆菌论文; 利福平论文; 基因论文; 杆菌论文; 结核论文; 分枝论文; 《医师在线》2016年1月第2期论文;