摘要 目的:观察西格列汀对AGES诱导GRP-78心肌细胞凋亡相关因子Grp78、CHOP表达的影响。方法:通过AGEs诱导H9C2心肌细胞凋亡建立体外糖尿病心肌病模型,并分为正常组、模型组、低浓度组及高浓度组。采用RT~PCR法测定内质网应激相关因子GRP-78、CHOP因子的表达。结果:模型组细胞内Grp78、CHOP表达均明显上升（P<0.05)。与模型组比较低浓度组中，Grp78(P<0.05)及CHOP(P<0.05)均有明显下降，高浓度组Grp78、CHOP较模型组下降(P<0.05)。低浓度组较高浓度组Grp78、CHOP下降更显著(P<0.05)。结论:低浓度西格列汀可以通过减轻内质网应激减少心肌细胞的凋亡,保护心肌细胞。
关键词 西格列汀；内质网应激;心肌细胞凋亡
心肌缺血再灌注损伤（Ischemia/Reperfusion Injury)是介入技术广泛应用以后带来的新难题，也是目前医学亟待解决的重要问题[1]。有研究显示[2]，内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress,ERS)是缺血再灌注损伤的原因之一。西格列汀是临床上用于治疗2型糖尿病的一种二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂，具有潜在的心血管保护作用；有研究发现[3]，黄芪总黄酮抗心律失常作用可能是通过降低小鼠心肌细胞葡萄糖调节蛋白78（Glucose regulate protein-78,GRP-78）的表达，缓解内质网应激实现的。早期的研究工作证实心肌细胞存在晚期糖化蛋白终末产物（Advanced glycation end-products,AGEs）受体,可以促进心肌细胞的一氧化碳合成酶（NOS）的表达，使心肌细胞中NO过度表达增加，损伤心肌细胞结构及功能[4]。本实验将通过西格列汀对AGES诱导GRP-78心肌细胞凋亡进行干预，观察其对ERS相关因子GRP78及CHOP表达的影响。
1材料和方法
1.1制备AGEs
将2.5gBSA、4.5gD-葡萄糖加入到50mLPBS中，经0.22um微孔膜过滤除菌后，置于37℃CO2恒温孵箱中避光孵育90d。所得产物经透析以除去未结合的葡萄糖，即得实验所需的AGEs-BSA。
1.2H9C2心肌细胞培养
在37℃、5%CO2条件下培养于含15%胎牛血清的DMEM培养基中，每日观察细胞生长情况。2-3d传代1次，取对数生长期的H9C2心肌细胞进行实验。
1.3实验分组
正常组：0.9%生理盐水+H9C2心肌细胞
模型组：0.9%生理盐水+300mg/LAGEs+H9C2心肌细胞
低浓度组：5umol/L西格列汀+300mg/LAGEs+H9C2心肌细胞
高浓度组：20umol/L西格列汀+300mg/LAGEs+H9C2心肌细胞
1.4RT-PCR测定 使用Primer5.0设计目的基因，GRP78引物序列上游为：5，-CTGGACTGAATGTCAT-GAGG-3，；下游为：5，-TATCCAGGCCATATGCAATAG-3，;预计扩增片段长度为66bp。CHOP引物序列上游为：5，-TCCCAAAGCCCTCGCTCTCCA-3，；下游为：5，~GCTGCGCAC-TGACCACTCTGTT-3，；预计扩增片段长度为111bp。GAPDH引物序列上游为：5，-T-GCACCACCAACTGCTTAGC-3，,下游为：5，-GGCATG-GACTGTGGTCATGAG-3，,预计扩增片段长度为87bp。PCR反应条件:95℃，3min,95℃30s,60C30s,72℃30s,共40个循环。
2.6数据统计数据采用SPSS22.0统计软件包进行分析。结果以均数±标准差（x±s)表示，使用student-Newman-CeulsTest法进行组间差异性比较。P<0.05为差异有统计学意义。
3结果
3.1西格列汀对AGES诱导GRP-78心肌细胞凋亡Grp78 mRNA表达的影响 模型组心肌细胞Grp78 mRNA表达明显增加，为正常组的169%(P<0.05)。低浓度组细胞GRP78 mRNA含量降至正常组的130%(P<0.05)。高浓度组Grp78表达为模型组的160%,与低浓度组比较有统计学意义(P<0.05)，见图1。
图1西格列汀对AGES诱导GRP-78心肌细胞凋亡Grp78 mRNA表达的影响
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正常组 模型组 低浓度组 高浓度组
注：**与正常组相比P<0.05；AA与模型组相比P<0.05。
3.2西格列汀对AGES诱导GRP-78心肌细胞凋亡CHOP mRNA表达的影响 模型组心肌细胞CHOPmRNA表达显著增加，是正常组的212%(P<0.05)。低浓度组细胞CHOP mRNA含量为正常组的170%(P<0.05)。高浓度组CHOP表达为正常组的186%,与低浓度组有统计学意义(P<0.05)，见图2。
图2 西格列汀对AGES诱导GRP-78心肌细胞凋亡CHOP mRNA表达的影响
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正常组 模型组 低浓度组 高浓度组
注：**与正常组相比P<0.05；AA与模型组相比P<0.05。
4讨论
内质网（EndoplasmicReticulum,ER)存在于除晡乳动物成熟的红细胞外的各种真核细胞中，是重要的细胞器之一，其主要的功能是参与蛋白质的折叠、加工、分泌及调节Ca2+储存、转运。在细胞内外部环境改变下，内质网功能紊乱而引起了ERS[5]。ERS激活细胞内三条通路,即未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response,UPR)、内质网超负荷反应(Endoplasmic Reticulum Overload Response,EOR)和固醇调节级联反应[6]。大量的未折叠蛋白及错误蛋白的蓄积启动了UPR,细胞内葡萄糖调节蛋白78(Grp78)为对蛋白质进行重新折叠而与跨膜蛋白ATF6、IRE1、PERK解离，导致了ATF6、IRE1和PERK分别激活，通路分别激活了下游的凋亡因子（如bcl4、caspase42、CHOP等），导致细胞凋亡[7]。Grp78表达上调是内质网应激的标志之一。EOR是内质网应激的另一种表现形式，由正确折叠蛋白在内质网过度蓄积激活NF~kB而引起。固醇调节元件结合蛋白（SREBP)是肝内调节固醇代谢的重要蛋白，当ERS时因内质网膜表面合成胆固醇被消耗可以启动SREBP而调控脂质代谢。实验表明，心肌细胞的缺血缺氧条件可引起内质网应激并最终导致心肌细胞的凋亡。
西格列汀是一种DPP-4抑制剂，能够迅速灭活肠促胰岛素胰高血糖样肽1和糖依赖性胰岛素释放肽等激素，增强人体自身的控制血糖能力，是目前临床治疗2型糖尿病的常用药物之一。DPP-4抑制剂安全性较好，迄今为止，尚未发现严重的不良反应，且低血糖风险明显低于磺脲类药物。心肌细胞是心脏主要的功能细胞，早期的研究工作证实心肌细胞存在AGEs受体,AGEs可以促进心肌细胞的NOS表达，使心肌组织中NO过度增加，损伤心肌细胞的结构及功能[8]。高海洋[9]等研究发现，胰高血糖素样肽素-1（GLP-1）对AGES诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用。但GLP-1的心血管保护作用依赖于超生理剂量的血液浓度或GLP-1类似物产生的超生理状态的信号途径激活，而DPP-4抑制剂对GLP-1的调节往往处于生理剂量范围，在本实验中，缺血/再灌注模型组细胞内Grp78、CHOP的表达均明显上升，提示细胞内质网应激启动，可通过CHOP的过表达诱发细胞凋亡。在西格列汀低浓度组中，Grp78及CHOP的表达较模型组均有明显下降，在高浓度组中下降没有低浓度组明显，提示了西格列汀低浓度组可以通过减轻内质网应激减少心肌细胞的凋亡，保护心肌细胞。
参考文献
[1]Kyoko Tanimura-Inagaki,Mototsugu Nagao,Taro Harada,Hitoshi Sugihara,Shigeki Moritani,Jun Sasaki,Suminori Kono,Shinichi Oikawa. Sitagliptin Improves Plasma Apolipoprotein Profile in Type 2 Diabetes: A Randomized Clinical Trial of Sitagliptin Effect on Lipid and Glucose Metabolism (SLIM) Study[J]. Elsevier B.V.,2020.
[2]Daniele Giuseppe,Tura Andrea,Dardano Angela,Bertolotto Alessandra,Bianchi Cristina,Giusti Laura,Kurumthodathu Jancy Joseph,Del Prato Stefano. Effects of treatment with metformin and/or sitagliptin on beta-cell function and insulin resistance in prediabetic women with previous gestational diabetes.[J]. Pubmed,2020,22(4).
[3]Giuseppe Daniele,Andrea Tura,Angela Dardano,Alessandra Bertolotto,Cristina Bianchi,Laura Giusti,Jancy Joseph Kurumthodathu,Stefano Del Prato MD. Effects of treatment with metformin and/or sitagliptin on beta‐cell function and insulin resistance in prediabetic women with previous gestational diabetes[J]. Blackwell Publishing Ltd,2020,22(4).
[4]柯欢娅. 西格列汀对高糖高脂环境下H9c2心肌细胞自噬及凋亡的影响[D].湖北科技学院,2019.
[5]Ba Jianming,Han Ping,Yuan Guoyue,Mo Zhaohui,Pan Changyu,Wu Fan,Xu Lei,Hanson Mary E,Engel Samuel S,Shankar R Ravi. Randomized trial assessing the safety and efficacy of sitagliptin in Chinese patients with type 2 diabetes mellitus inadequately controlled on sulfonylurea alone or combined with metformin.[J]. Pubmed,2017,9(7).
[6]Bloomgarden Zachary T,Tunceli Kaan,Liu Jinan,Brodovicz Kimberly G,Mavros Panagiotis,Engel Samuel S,Radican Larry,Chen Yong,Rajpathak Swapnil,Qiu Ying,Brudi Philippe,Fonseca Vivian. Adherence, persistence, and treatment discontinuation with sitagliptin compared with sulfonylureas as add-ons to metformin: A retrospective cohort database study.[J]. Pubmed,2017,9(7).
[7]Kim Sang Soo,Kim In Joo,Lee Kwang Jae,Park Jeong Hyun,Kim Young Il,Lee Young Sil,Chung Sung Chang,Lee Sang Jin. Efficacy and safety of sitagliptin/metformin fixed-dose combination compared with glimepiride in patients with type 2 diabetes: A multicenter randomized double-blind study.[J]. Pubmed,2017,9(4).
[8]王兆振,裴苗苗,钟宇敏,刘洋,刘桢睿,李盈盈,杨昌山.西格列汀对阿霉素诱导的慢性充血性心力衰竭的保护作用研究[J].广东医学,2016,37(S1):4-6.
[9]高海洋. JAK2/STAT3通路对糖尿病心肌病的调节作用及药物的干预效应[D].北京协和医学院,2015.
论文作者:贺星1,彭梦芬2,李好3,李一帆4,向菁5,向光盛
论文发表刊物:《中国医学人文》2020年5期
论文发表时间:2020/4/23
标签：心肌论文; 细胞论文; 内质网论文; 西格论文; 凋亡论文; 模型论文; 诱导论文; 《中国医学人文》2020年5期论文;