混合斑分析与其在法医学中的应用

王巍巍，郭宁，张曙光，张旭，冯敏

(锦州市公安局刑侦支队，辽宁 锦州 121000)

摘要: 目的 通过本实验室经典案例的检测分析，为基层法医提供一种简单、有效的混合斑类检材的分析方法。方法 对一起抢劫案件中检出的混合DNA分型进行人工拆分获得嫌疑人图谱。结果 人工拆分获得的嫌疑人DNA分型与嫌疑人血样在15个基因座上基因型相同。结论 在已知一个供体的情况下，结合混合样本各基因座的峰高、峰面积进行人工拆分，可以推断出另一供体基因型。但在实际应用中，要谨慎，以免造成冤假错案。

关键词： 法医学；混合斑；人工拆分

混合斑是指包含两名或者两名以上个体的混合生物检材，在多数情况下，DNA分型往往表现为两人或多人的混合分型^[1]。大量的命案现场和性犯罪现场的样本往往存在着微量和混合的特性^[2]，在法医学检验中混合斑类检材一般为以下几种情况：(1)强奸案件中提取到的检材，主要为阴道擦拭物、被害人内裤、床单、卫生纸、犯罪嫌疑人阴茎拭子等检材，这类检材包含精子和阴道上皮细胞，属男、女个体成分的混合物；(2)多人受伤的伤害、杀人案件中提取到的检材，主要为凶器、现场血迹、被害人或者嫌疑人身上及衣物上的血痕，一般为两个或两个以上个体的混合血迹；(3)强奸案或者其他案件中提取到的咬痕拭子，一般含有被咬者的皮肤细胞和咬者的口腔上皮细胞；(4)指甲垢，可能含有被抓者和抓者本人的细胞；(5)带血的衣物，有时候混有他人的唾液、汗液或尿液。

混合斑类样本的研究受到很多挑战，这是由于混合斑类检材中各组分难以分离，检出的STR分型结果往往表现为各供体的等位基因相互重叠、相互并存的现象，常规STR分型结果解释方法和标准的不统一，混合斑人数难以判定，不平衡混合斑中次要成分的检测困难导致分型结果的分析极其复杂^[3]。

目前国内外关于混合斑的研究主要分两个方面进行，一是实验技术，通过各种实验技术分离出混合斑的组分，使混合样本成为单一样本，按照单一样本检测分析方法进行检测、分析，得出准确结论。一般的实验手段包括：磁性/荧光激活细胞分离法、显微操作和激光捕获显微切割法、声波差异分离法、基于芯片的DNA提取法和液滴微流控技术、ePCR和BEAMing、大规模平行测序技术。这些技术给混合斑类样本的检测提供了新的方法和途径，但是由于这些技术需要精准的仪器设备和专业的技术人员，所以在基层法医的DNA检验中应用起来困难。二是统计分析，对无法通过实验手段获得单一样本的混合DNA，通过数学计算等方法尽可能多地获得有价值的信息，与参照样本比对，确定混合样本的来源。本文就我实验室的典型案例来谈一谈在实际工作中混合斑结果分析与应用。

1 混合斑结果分析

目前法医DNA检验的主要遗传标记是STR，即短串联重复序列，因为其遗传多态性较高，对于混合斑类样本的检测也能够提供较多的遗传信息。混合斑类样本检测和结果分析解释的研究大多集中在对DNA分型图谱的分析方面。混合斑类样本的结果分析大致分为以下几个步骤。

1.1 确定为混合样本

在法医DNA检验过程中，DNA结果分析之前最重要的是判定样本是否为混合DNA样本。一般在排除检材被污染的前提下，多个基因座同时出现两个以上等位基因条带、杂合子两个等位基因峰高比小于60%、Stutter峰高大于15%，这三个条件同时存在时可判断为混合DNA样本。这就要求DNA实验室在检验过程中要做好防污染措施，包括：建立合理的样本检验区域、样本分人、分时检验，每次检验中都要建立阴阳对照，建立和完善现场勘查人员、实验室检验人员及辅助人员的质控库，每次结果分析时均要利用DNA数据库系统排除、查找人为污染，确认混合DNA样本是否与案件具有联系。排除人为污染后、确定为混合型DNA样本再继续进行分析。

1.2 判定等位基因型

接下来就是确定混合比例，在该混合分型中D21S11、D2S1338、vWA等3个基因座均出现4个等位基因峰，根据之前所述vWA基因座对于混合样本混合比例的分析较为准确、且在此例中不存在基因共享，因此我们优先选用vWA基因座推断各组分比例，根据峰高、峰面积大致推断嫌疑人与被害人混合比例大概为2∶3。

1.3 确定混合来源的个体数目

继续加大对临床科研工作的支持力度，不断加强将科研成果转化为临床诊疗新技术的扶持力度。通过协同创新，以科学研究反哺技术创新，不断提升医院的整体医疗技术水平。

2011年12月10日10时33分许，曾某(女)报警称：2011年12月10日2时至10日10时33分，有一名年龄大约四十岁、身高约1.70 m的男子，从其家北窗户进入室内实施抢劫。

1.4 确定混合样本中各供体所占比例

对已知量DNA模板的混合样本的研究表明，经PCR扩增后，混合样本中各组分的比例基本不会变化^[9-10]，混合DNA的扩增产物的峰面积与混合DNA存在正比例关系^[11]。由此可以确定，在进行DNA检验结果分析时完全可以根据基因型图谱中各个等位基因的峰面积、峰高来逆向推断出各供体在混合斑类样本中所占的比例。

不同的基因座在混合样本的混合比例的推断中受多种因素影响，比如扩增后杂合型的等位基因均衡性、等位基因分子量的大小、PCR扩增效率。由于这些影响是无可避免的，那么就需要我们在同等条件下，尽可能选择那些在混合样本的组成比例推断中差异性较小的基因座。研究^[12]结果发现常用的1个性别基因座、15个常染色体基因座在混合比例的推断中是有差异的，vWA、D18S51、D16S539三个基因座对于混合比例的推断均较准确，与理论混合比例没有差异且残差较小；Amel、D3S1358、D13S317、TH01、 D8S1179基因座得出的混合比例与理论比例有差异，且残差值较大，对于混合DNA的解释不够准确。其余基因座D21S11、TPOX、D19S433、D7S820、D2S1338、CSF1PO、D5S818、FGA对于混合比例的推断不够稳定。而且有文献^[13]曾报道等位基因不存在等位基因共享的基因座用于推断混合样本的混合比例是最精确的。由于男女两人混合DNA存在共享等位基因X，因此性别基因座不能作为推断混合比例的优先选择，可是在目前的实际检案中，常常根据性别基因座来推断混合比例，这样做并不是最准确的。

因此，在混合斑类检材的DNA结果分析时要尽可能的优先选择那些不存在等位基因共享的基因座。这提示我们：在实际案件中检验未知混合样本时，当某个基因座出现2个或3个等位基因时，我们往往无法判断是否存在等位基因共享，在判断混合比例时就不要选择这样的基因座，而是要优先选择那些出现4个等位基因峰、不存在共享等位基因的基因座来判断混合样本的混合比例。

1.5 结合已知个体DNA分型，分析有可能存在的基因型组合

对于混合斑类样本基因型的拆分方法，不同的研究者采用不同的方法，国外关于混合样本拆分问题的研究开始于20世纪90年代，主要采用的拆分方法是贝叶斯学派提出的定性分析法用于定性数据分析，频率学派主张的PE法，Gill则利用对等位基因峰面积的残余量的分析，排除那些可能性不大的基因型组合。Perlin、Martin、Wang这三人均利用了基因型图谱中峰高/峰面积的定量信息，运用最小二乘法原理寻找最可能的混合样本中的基因型，相继提出线性混合样本分析方法、钟摆系统、最小二乘法拆分。康艳荣^[14]等提出以图的挖掘算法为基础的MDG算法。The Probabilistic Mixture Model^[15]是一种新的分析技术，分析中考虑了峰高和峰个数等因素，优势在于最大限度的涵盖了基因型出现的可能性。

为确保业务人员可以对备选经销商进行全面的调研，以筛选相对更加合适的经销商，建议B公司针对市场业务人员薪资方案进行改进。比如在经销商出现空缺时，根据市场容量以及其他市场指标，明确经销商的设立期限，在市场空白的前几个月给予业务人员一定的达成工资。比方说，在经销商出现空缺时，第一个月按照达成100%进行达成工资兑现，第二个月按照80%进行达成工资兑现，第三个月按照60%进行兑现，第四个月按20%进行兑现。如此在市场存在经销商空缺的前期，业务人员有足够的动力去寻找经销商，针对备选经销商的市场调研也会更加充足和全面。

但是目前在各个法医检验的基层单位，采用最多的是人工拆分方法，主要针对两个供体的混合样本，利用其中已知供体的基因型，结合峰高、峰面积推算混合比例，进而推断出另外一个供体的基因型。本文采用的混合样本人工拆分的方法在法医实际工作中有成功的报道^[16-17]。这种人工拆分的主要依据是所有基因座上2个供体的比例保持相对恒定，以混和比例为根据“扣除”掉已知样本的贡献部分，既可拆分出另外一个未知样本的可能分型^[18]。但是这种方法要求分析人员有足够的经验，而且在分析前不能有主观的定性式判断，以防出现不准确的分析，造成冤假错案。

冯道知晓自己的处境，处事圆滑，避难以存身。据史书所载冯道的几则故事，可见其处事圆滑、善于揣摩上意，后晋高祖曾以兵事问冯道，他答道：“臣本自书生，为陛下在中书，守历代成规，不敢有一毫之失也。臣在（后唐）明宗朝，曾以戎事问臣，臣亦以斯言答之。 ”〔4〕（卷一百二十六，P3869）武夫当权的时代文人的地位本就低微，冯道很清楚君王不愿意文人过多参问军机要务，含糊其辞、蒙混过关无疑是最佳的明哲保身之计。

2 混合样本分析的应用

2.1 案例

2.1.5 结果分析

人体细胞核DNA为二倍体，一名个体STR等位基因最多为两种(杂合子为两个不同的等位基因，纯合子为两个相同的等位基因)^[5]。依据混合样本的DNA分型谱带来推断，两个人的混合DNA等位基因数(峰)不超过4个；如在一个基因座上出现5个或6个等位基因，表示有3个或3个以上供体^[6]。在法医DNA检验中，经常会遇到混合样本，其中2人份混合样本所占比例最大^[7]。包括：两个嫌疑人、嫌疑人与一无名氏、嫌疑人与被害人样本的混合^[8]，实际法医检验工作中，对一个已知供体和犯罪嫌疑人组成的混合样本的DNA检验分析具有相对较高的应用价值。本文主要就这种情况进行讨论。

2.1.2 送检物证

勘查人员在案发现场提取剪子、尖刀送检。两种均为接触类检材，而且剪子为被害人家中所有，被害人用来抵抗；尖刀为嫌疑人带到现场，但是在作案过程中，被害人与嫌疑人争抢过尖刀。在检验初期推断，尖刀检出混合基因型的可能性较大。

秋浦河：上游起于祁门县，经石台县进入贵池区，至池口向北注入长江。流域面积2 235 km2，河道全长149 km，河面宽250 m，底宽100 m，洪水深度7.0 m，枯水深度0.7 m，泄洪能力1 000 m3/s，历史最大流量为2 710 m3/s(1957年7月4日)，长年不断流。下游段最高水位17.7 m，最低水位8.8 m。

2.1.3 检验过程

同样，本研究还发现心理弹性与主观幸福感之间呈显著正相关，这意味着心理弹性对主观幸福感具有明显的预测力，具有良好心理弹性的个体拥有更高的主观幸福感。这一结果得到国内其他学者研究的支持[24,25]。一项针对浙江高校大学生的调查研究显示，大学生心理弹性对其主观幸福感具有显著正向预测效应。这表明大学生越表现出坚强、乐观、坚韧的心理品质，其主观幸福感的水平就越高[26]。因此，加强心理健康教育、培养良好的心理品质、提升心理健康水平是提高主观幸福感的必要途径。

DNA室鉴定人员用半干棉签反复擦拭来提取剪子柄、尖刀刀把DNA，擦拭范围适中。这是由于棉签过干或过湿会导致DNA转移不彻底，擦拭范围过小则提取到的细胞过少或者擦拭范围过大无法获得满意的STR分型^[19]。常规Chelex-100法提取DNA；QiagenⅡ试剂盒纯化浓缩；分别用1、4 μL模板进行梯度扩增；3130型基因分析仪电泳分析。

2.1.4 检验结果

经过检验后基因型分析，剪子获得单一女性DNA分型与被害人曾某血样在15个基因座上基因型相同；尖刀不同模板浓度获得的基因型分型相同(见图1)。

图 1尖刀刀把获得的 DNA分型

本例尖刀分别用1、4 μL模板进行扩增，获得的分型一致，而且在11个基因座上具有3或4个等位基因峰，推断该分型为两个个体的混合型，且每个基因座均包含被害人曾某的全部基因型，大概推断出该混合型极大可能为被害人与嫌疑人的混合。

案件中送检样本由于现场环境复杂、人为破坏、高温、降水等影响，往往质量较差，通常含有PCR扩增抑制成分，或者存在促进DNA降解的因素等。这些影响因素通常都会影响DNA分型结果中等位基因峰的均衡性。为了降低上述因素的影响，建议采用不同DNA模板浓度进行梯度扩增。比如扩增体系里分别加1、2、3、4 μL DNA模板量使体系中模板浓度不同；或先对DNA模板进行梯度稀释以降低PCR扩增抑制成分的影响，再用不同浓度梯度的DNA模板进行扩增；对各浓度的扩增产物的DNA分型图谱进行比较，排除Stutter峰、pull-up峰的影响，确认DNA图谱中稳定出现的分型。这些稳定出现的基因分型可以作为DNA混合样本的分型。

根据已知供体基因型结合混合比例推断未知个体基因型。D21S11、D2S1338、vWA 等3个基因座分别检出4个峰，去除受害人的2个峰，留下的则为嫌疑人的等位基因型。通过D21S11、D2S1338两个基因座中被害人与嫌疑人，等位基因的峰高和峰面积的比例，进一步验证混合比例的推断是正确的。D8S1179、D7S820、TH01、D13S317、D16S539等5个基因座分别检出3个峰，被害人的等位基因峰不等高现象明显，由此可以推断大峰为两供体的共享峰，进而推断出嫌疑人的基因型。D3S1358、D18S51、D5S818等3个基因座分别检出3个峰，被害人的等位基因峰均衡性较好，推断嫌疑人为纯合子。D19S433、FGA基因座分别检出2个峰，且被害人为杂合子，2个等位基因峰均衡性较差、峰面积差异明显，推断嫌疑人为大峰的纯合子；TPOX基因座检出2个峰，且两个峰的峰面积大体和混合比例相符，被害人为大峰的纯合子，推断嫌疑人为小峰的纯合子。CSF1PO基因座检出1个峰说明嫌疑人和被害人为相同基因型的纯合子。

通过人工拆分，嫌疑人15个基因座基因型(见表1)全部推断出来，将基因型录入DNA数据库进行快比无比对结果，但是在2013年3月29日DNA室人员清理积案的过程中再次将拆分出的基因型录入数据库进行比对比中前科人员刘某，将刘某血样送检后与之前拆分结果比对，15个基因座基因型推断全部正确。将刘某血样和混合样本进行Y-STR检测，发现两者的Y-STR分型相同，进一步验证了拆分结果的准确性。

表 1被害人、混合样本、嫌疑人及人工拆分STR分型结果

2.1.1 简要案情

由于径向基RBF核函数具有良好的学习能力，能够逼近任何非线性函数，因此该研究选取RBF核函数进行分类研究。核函数参数δ和惩罚因子c的选取对于SVM的结果有重要影响，而参数的选择多以经验选取为主，其分类精度和速度都无法得到保证，因此，将通过使用粒子群算法对SVM的参数进行调整和优化，以寻求参数的最优解。PSO-SVM算法首先将系统初始化为一组随机解，然后通过迭代搜寻最优值。在该研究中SVM的核函数选用RBF核函数，通过使用粒子群算法的搜索能力，能够对支持向量机中的参数进行优化，从而得到参数的最优解。

Poly(S)-TPBO螺旋构型能稳定存在于各种有机溶剂中,比如：二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、二甲基亚砜(DMSO)、甲苯和苯等.

利用常规的STR检验、分析技术，推断某混合样本的来源数目不能完全达到100%的准确率，因为DNA分型存在等位基因共享现象，造成混合斑类检材各供体的等位基因型在混合斑基因型图谱中不表现出来。因此对混合斑的杂合型均衡比以及来源个体数的推断等有影响，通常用各基因座出现的最大等位基因计数法来粗略推断来源个体数，该方法比较容易被法庭接受^[4]。

本案从送检的尖刀刀柄获得1个混合分型，除包含被害人的分型外，还包含1未知男性个体分型，结合案情分析另一个供体应为嫌疑人。通过分析混合分型中无基因共享的具有4个等位基因的基因座(D21S11、D2S1338、vWA)，推测出2个供体的混合比例为2∶3，再逐个基因座扣除已知供体的贡献部分，拆分出未知供体的基因型。

把拆分出来的基因型录入数据库，比中犯罪嫌疑人、破获案件。

本案没有其他有利的线索，尖刀刀柄检出的混合基因型成为破案的关键。本案选择的人工拆分方法简单、有效，在2个供体的情况下，准确推测出嫌疑人的基因型。

本案不仅检测了常染色体基因分型，同时利用Y-STR进行检测，常染色体和Y染色体联合检测互为补充。在实际工作中对混合斑类样本的分析中，也要注意应用常染色体STR检测以外的其他检测手段，如Y-STR检测、mtDNA检测。结合常染色体和Y染色体STR分型结果，不仅可以确定是否存在男性生物检材，还可以确定混合来源的个数^[20]；由于mtDNA也具有伴性的遗传特征，因此在分析混合斑的供体时，能发挥独特的作用。多种手段结合，鉴定结果相印证可以最大限度的避免错误分型的产生，提高鉴定结果的准确性。

2.2 混合样本DNA分析在法医学中的应用

混合样本DNA分析的准确性受到多种因素的干扰：等位基因共享(遮盖效应)，往往造成混合样本中各供体的等位基因在混合图谱中不表现出来，影响混合斑的杂合型均衡比的判断，进一步影响供体数目的推断；Stutter峰影响混合斑中次要组分的分析，由于次要组分的峰值较低，如果出现在Stutter峰位置的谱带无法准确判读^[21]；pull-up峰与混合样本中真正的等位基因难以区分；杂合子扩增不均衡影响混合斑基因型的判断，因此要牢记在分析混合斑时杂合型均衡比应在60%以上；等位基因的丢失可能误认为某个杂合子为纯合子，造成误认为混合斑不存在或者错误估计供体的数量，影响混合斑类样本的分析；低拷贝DNA组分可能会出现插入、缺失、Stutter峰增加等影响混合斑分析的因素；降解的DNA成分在PCR扩增过程中容易发生错误的引物配对、错误的延伸，造成在基因型图谱中出现多个等位基因峰，无法确定是否为混合斑类样本。这些因素使混合样本的分析具有复杂性,分析时要慎重。

参照上述的干法工艺流程图，按照正常处理1 t废旧电池干法处理模式，三元材料动力电池以传统的干法回收工艺计算成本和收益，LFP分别以传统的干法回收工艺（干法1）和改进的干法回收工艺（干法2）计算成本和收益，成本分别命名为CLFP干法1、CLFP干法2、C 三元干法，收益命名为 ELFP干法1、ELFP干法2、E 三元干法。处理成本价格根据实际调研及综合参考文献[6-7]，具体如表3所示。

第三，去产能调结构稳步推进,能源资源消耗强度大幅下降。通过供给侧结构性改革,加大化解钢铁、煤炭等过剩产能和落后产能淘汰力度,从2013年至2017年,退出钢铁产能1.7亿吨以上、煤炭产能8亿吨。加强散煤治理,基本完成地级及以上城市建成区燃煤小锅炉淘汰,71%的煤电机组实现超低排放。提高燃油品质,黄标车淘汰基本完成,新能源汽车累计推广超过180万辆。2017年清洁能源消费占比增加到20.8%,单位GDP能耗、水耗均下降20%以上,水电装机容量、核电在建规模、太阳能集热面积和风电装机容量均居世界第一位。煤炭消费比重由2013年的67.4%下降到60.4%。

目前伴随DNA检验技术的不断提高，DNA检验的灵敏度大大提高，造成越来越多的混合分型的出现，这就要求我们学习国外，在实验技术分离混合斑各组分和统计学分析等两方面来提高混合斑的检验分析的准确性。

但是由于资源的有限性，在大多数DNA检验的基层单位，不具备先进的实验技术来分离混合斑，因此通过精确的计算结合有经验的专家对混合样本进行人工分析，具有实际的价值。但在实际工作中，从混合斑类样本的DNA分型中分离嫌疑人DNA分型时要格外小心，在排除实验室污染的前提下，要考虑到DNA分型图谱质量好坏，再充分结合峰高/峰面积等信息及案情的基本情况进行综合分析，不能凭借主观的臆断来分析混合样本，以免获得错误的分型结果，避免给侦查破案提供错误的方向。

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Mixed Stain Analysis and Its Application in Forensic Medicine

Wang Weiwei，Guo Ning，Zhang Shuguang，Zhang Xu，Feng Min

(Criminal Investigation Detachment of Public Security Bureau in Jinzhou，Jinzhou 121000 China)

Abstract ：Objective To provide a simple and effective method for the analysis of mixed stain samples in primary forensic medicine through the testing and analysis of classic cases in our laboratory.Methods Mixed DNA typing detected in a robbery case was artificially split to obtain the suspect profile. Results The DNA genotype obtained by artificial split was the same as that of the suspect’s blood samples on 15 loci.Conclusion When one donor is known，another donor genotype can be inferred by combining the peak height and peak area of each locus in the mixed sample. But the mixed sample analysis and application must be careful in practice，avoiding miscarriages of justice.

Key words : forensic medicine；mixed stain；artificial analysis

中图分类号： R446. 69

文献标志码： A

文章编号： 2096-305X( 2019) 05-0018-05

作者简介： 王巍巍(1984)，女，辽宁锦州人，副主任法医师，硕士学位，主要研究方向为法医物证学检验。

收稿日期： 2019-04-05

标签：法医学论文;  混合斑论文;  人工拆分论文;  锦州市公安局刑侦支队论文;