刘辉贤[1]1999年在《大鼠精子发生阶段特异表达基因的分离和表达》文中研究表明精子发生是一系列基因严格按照时空顺序相继转录表达的过程。寻找和研究不同时期、不同发育阶段的差异表达基因，将有助于最终阐明精子发生的机理。由于大鼠生精细胞在曲细精管内的排列极为有序，本研究采用曲细精管分段分离结合差异显示PCR(DDRT-PCR)的方法，寻找精子发生中差异表达的基因。 在解剖显微镜下根据折光度不同将曲细精管分出Ⅱ～Ⅵ期和Ⅶ～Ⅷ期两段，Ⅱ～Ⅵ期中包含精原细胞分裂产生A、B两型精原细胞、变形期初级精母细胞向粗线期精母细胞的转化和2～6级以及15～18级精细胞，Ⅶ～Ⅷ期中包含A型精原细胞、休止型精母细胞、粗线期精母细胞、7～8级和19级精细胞以及成熟精子的释放，Ⅶ～Ⅷ期中不含细胞分裂。提取两段的组织总RNA并反转录成cDNA，以3个Oligo-dT_(12)N(N为A、C、G)单锚定引物分别与上游8个随机引物进行24种配对组合，共48个扩增反应，经聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影后选出112个差异cDNA条带，再经反向Northern斑点杂交验证，有76个cDNA条带代表的基因在不同区段中存在差异转录，其中17个差异达10倍以上。对36个有差异的cDNA条带进行克隆测序，得到22个彼GenBank接收的新的Expression Sequence Tags(ESTs)，其中来自Ⅱ～Ⅵ期的有14个(AF094604、AF094605、AF094606、AF094607、AF095318、AF095320、AF095321、AF095322、AF095324、AF095325、AF096087、AF096088、AF096089、AF134584、)，来自Ⅶ～Ⅷ期的有8个(AF095319、AF095323、AF096090、AF133655、AF133656、AF133287、AF133288、AF133289)。 在此基础上，选择6个ESTs作为混合探针筛选大鼠睾丸cDNA文库，得到一新的全长2183bp、编码526个氨基酸的cDNA序列(GenBank接收号为AF094609)，命名为R337，其编码蛋白的预测分子量为60000，等电点为4.0，经蛋白数据库分析发现其氨基酸序列存在一个P34cdc2的磷酸化位点、一个蛋白激酶A(PKA)磷酸化位点、多个蛋白激酶C(PKC)和酪蛋白激酶Ⅱ(CK-Ⅱ)的磷酸化位点以及多个DNA结合Motif。
俞作仁[2]2003年在《小鼠精子发生不同阶段生精细胞基因表达谱的研究》文中认为精子发生是一个特殊的细胞分化过程，双倍体的精原细胞经过两次减数分裂形成单倍体的圆形精子细胞，后者再经过精-组蛋白转换、核浓缩、细胞变态等过程最终形成长形精子。精子发生的分子机制尚处于探索阶段，越来越多的精子发生相关基因被发现，但还未见调控精子发生关键基因的报道。我们利用新近发展的生物技术，比如荧光差异显示，DNA微阵列等，研究不同生精细胞中众多基因的表达特征，从中寻找一批在精子发生不同阶段差异表达的基因，根据其有关功能及表达规律试图获得一些精子发生的基因调控信息或规律，或找到调控精子发生的关键基因，从而进一步深入研究精子发生的分子机理。本研究主要包括三个部分的内容。 一：各期生精细胞的分离。我们以2％-4％连续梯度为分离介质，采用重力沉降法结合贴壁培养的方法分离纯化各期生精细胞。从6日，9日，2周，3周，5周及8周龄的Balb／c小鼠睾丸中分别获得原始A型精原细胞，B型精原细胞，前细线期初级精母细胞，粗线期初级精母细胞，圆形精子细胞及长形精子细胞，细胞纯度分别达到94％，90％，88％，95％，96％及92％。采用离心的方法从12周龄小鼠附睾中获得成熟精子，纯度98％。 二：利用改进的DDRT-PCR方法克隆小鼠精子发生早期相关基因的EST。我们以小鼠的原始A型精原细胞及B型精原细胞为研究对象，以荧光差异显示方法筛选差异表达基因。利用斑点杂交技术对差异片段进行快速鉴定以排除假阳性。选取16条表达差异显著的片段做克隆测序，通过GenBank／Blast比较，有7个片段属于新的EST，且均表现为在B型精原细胞中表达强度高于原始A型精原细胞。提交GenBank获得注册号。从中选取较有意义的3条基因片段通过半定量RT-PCR方法进一步验证其表达特征。和传统的差异显示方法比较，文中所采用的改良mRNA差异显示技术可快速排除假阳性结果；避免同位素标记带来的放射性污染。结果表明所获得的7条新EST均表现为在B型精原细胞中表达上调，我们推
梁刚[3]2003年在《应用激光捕获显微切割技术进行人和大鼠不同阶段生精细胞差异表达基因的研究》文中认为精子发生是一个十分复杂但又高度有序的细胞分化过程，是相关基因严格受时空调控相继转录表达的结果。生精细胞的发生分多阶段进行，曲细精管截面上不仅可以看到处于精子发生过程不同阶段的各种生精细胞的组合，还可以看到支持细胞、间质细胞等其它类型的细胞。它们分别具有自己的基因时空表达规律。多年来人们采用了重力沉降法、密度梯度离心以及曲细精管分段分离等多种方法试图获得处于不同阶段纯净的各类细胞，但均存在着组织异质性问题。因此分离得到单一的生精细胞群并建立单一细胞类型的cDNA文库，就可以特异性地研究单一细胞的基因表达和有效地筛选不同精细胞群之间差异表达的基因。 我们利用激光捕获显微切割(Laser Capture Microdissection，LCM)技术，成功地捕获和分离了人和大鼠的初级精母细胞和圆形精子细胞。在此基础上从分离的两种细胞中提取RNA，合成双链cDNA，并进一步通过抑制性消减杂交(Suppressive Subtractive Hybridization，SSH)方法构建了人圆形精子细胞消减初级精母细胞cDNA文库、大鼠初级精母细胞(RSA)和圆形精子细胞(RSB)的双向cDNA消减文库。其中所构建人圆形精子细胞消减初级精母细胞cDNA文库的滴度高达5.6×10~7／ml，重组质粒克隆阳性率为88.89，插入片段大小分布主要集中于500bp～750bp。所构建文库的滴度高达8.3×10~9／ml，重组质粒克隆阳性率为91.67％，插入片段大小分布于250bp～1.7kb，主要集中于500bp～1kb。大鼠初级精母细胞(RSA)和圆形精子细胞(RSB)的双向cDNA消减文库的滴度达8.3×10~7／ml，重组质粒克隆阳性率为91.67％，插入片段大小分布于250bp～1.7kb，主要集中于500bp～1kb。 根据SSH的结果，在人圆形精子细胞消减初级精母细胞cDNA文库中选择421个PCR纯化产物进行斑点杂交(Dot Blotting)分析，以验证差异表达并分析其表达差异的强度。结果得到390个克隆在两种细胞之间表达差异相差大于2倍。对斑点杂交筛选出的390个克隆进行部分测序，共产生了329个质量满意的ESTs，测序成功率达到84.40％。在大鼠初级精母细胞
覃金洲[4]2015年在《雄性生殖细胞介导的转基因技术的研究》文中研究说明雄性生殖细胞是指通过有性生殖繁衍后代的雄性生物生殖系统中能将遗传信息传递给后代的一类细胞,其中精原干细胞是整个机体内唯一贯穿一生,既可通过增殖维持自身数目稳定又能定向分化为精子的成体干细胞;同时,精原干细胞在自发或诱导条件下,具有分化为三胚层的潜能,具有类似胚胎干细胞的特征而备受生物医学、转化医学和畜牧业广泛关注。目前对精原干细胞的研究主要集中在分子标记的筛选、体外培养体系建立及维持、经典及表观遗传修饰相关信号通路的研究、基于精原干细胞修饰的转基因动物制作以及睾丸组织块移植等领域,而这些研究中采用的免疫缺陷受体模型大大限制了精原干细胞的科研与应用,特别是实际生产及其在畜牧行业的推广;同时,基于精原干细胞显微移植的转基因动物制作具有一定的技术难度。因此,精原干细胞介导的简单易行的转基因动物制作策略亟需探讨。本研究主要着力于探究睾丸组织及精原干细胞非免疫缺陷移植受体模型制作的方法,探索体内简单易行的雄性生殖细胞介导的转基因技术的新方法。本研究获得如下结果:1,本研究探究了不同浓度的腺嘌呤(200mg/kg,260mg/kg,320mg/kg和380mg/kg)对非免疫缺陷大鼠(Sprague-Dawley,SD大鼠)睾丸的损伤情况,通过相关生理指标和睾丸切片观察,候选得到精原干细胞移植受体在SD大鼠体内的最佳的作用浓度(320mg/kg)。同时作为阳性对照,摸索了白消安(一种广泛使用精原干细胞受体模型制备的药物)在SD大鼠受体制作的合适作用浓度;从存活率、体重、睾丸指数及睾丸切片确定了腺嘌呤处理优于白消安处理,可作为替代方案阻滞内源性精子发生,为精原干细胞移植提供合适的微环境。同时,使用酶消化、差异贴壁及免疫磁珠分选等方法富集高纯度小鼠精原干细胞(Lin28阳性率达到84%,THY-1阳性率达到92%),同时利用体外慢病毒感染修饰的方法标记小鼠的精原干细胞,并移植到受体大鼠曲细精管内,首次检测到非免疫缺陷受体内异种移植完整的精子发生。本实验也使用细胞系和分离的原代生殖细胞及支持细胞作为研究对象,研究腺嘌呤对其体外作用机理;使用TUNEL证实染色体中DNA发生断裂,使用蛋白免疫印迹实验检测到了凋亡早期相关蛋白Caspase3和凋亡执行蛋白PARP浓度依赖性表达,初步探明了腺嘌呤通过诱导细胞凋亡对生殖细胞产生了特异的生殖毒性。2,本研究使用慢病毒体内感染雄性生殖细胞的策略,获得了超过67%的转基因后裔,生殖能力正常,外源转基因可稳定遗传给后代;同时也揭示了该策略与亲本年龄及慢病毒注射部位没有相关性(P>0.05),这提示我们可以在大家畜中尝试使用慢病毒注射睾丸间质部位获得转基因后裔,简化大家畜生产及育种中的繁琐环节和技术难题。同时,也比较了不同慢病毒系统对睾丸内精原干细胞感染能力,与慢病毒p CD513B-CMV-MCS-EF1相比,慢病毒p Lenti V-H1-MCS-CMV感染精原干细胞之后获得的转基因后代能正常表达外源转基因片段;进一步研究揭示不同慢病毒整合到子代基因组后,外源基因启动子序列甲基化水平存在显著差异:前者外源转基因片段启动子甲基化水平高达87.8%,而后者仅为45.5%。本研究为以后使用慢病毒载体制作转基因动物特别是对于曲细精管移植难于实现的大家畜提供了新思路。3,本研究探索了使用非免疫缺陷小鼠(成年昆明小鼠)作为睾丸组织块移植的受体,既可以完成同种不同品系间睾丸移植的精子发生,也首次检测到异种睾丸组织块移植后(大鼠睾丸移植到小鼠皮下),具有完整的异源精子发生。本研究同时发现,使用大量的睾丸组织块移植到非免疫缺陷受体小鼠皮下检测到移植组织块经历了破碎、重塑进而完成精子发生的过程;同时也发现在非免疫缺陷小鼠使用免疫抑制剂可提高异源组织块存活和完成精子发生的成功率,将完整精子发生的成功率从2-5%提高到了8.3%,并且重现了移植组织块经历破碎、重塑进入完成精子发生的过程,为精子发生及睾丸组织发育的研究提供了新模型,可为转基因动物制作提供新途径。综上所述,本研究着力探索了非免疫缺陷受体模型下精原干细胞研究的两大策略:其一是基于精原干细胞移植的相关研究,另一个是睾丸组织块移植的研究。探究了腺嘌呤作用于SD大鼠(免疫正常大鼠)睾丸组织生殖毒性,获得一种新型的可用于精原干细胞移植受体模型,经过输出小管移植获得了完整的异种移植精子发生;同时优化了基于慢病毒载体的依赖精原干细胞转基因动物制作的途径,从甲基化水平揭示了不同载体不同启动子在体内表达外源基因差异的原因。同时也对非免疫缺陷受体皮下睾丸组织块移植进行了探索,配合使用免疫抑制剂提高了异源组织块存活率和精子发生率。本研究对于精原干细胞功能、精子发生及睾丸组织发育提供了新见解,对于转基因动物制作提供了简单易行的策略,对于大家畜种和珍稀动物在生物学研究及实际应用具有重要意义。
陈宏波[5]2017年在《睾丸特异表达新基因Spata34和Mage-k1的克隆及蛋白表达和分离纯化》文中认为近十年来,育龄夫妇中约有10-15%的不育,而男性不育约占33.15%,其中一个重要的原因是男方生精障碍,表现为无精或严重少精。多个与精子发生或生精细胞凋亡相关的基因已被鉴定,但这些已知的基因如何与其它的基因相互作用来调控精子的生成过程,以及是否存在其它未知的基因参与精子的发生目前尚不完全清楚。因此,发现和克隆新的睾丸生精细胞发生、发育、凋亡特异基因并研究其功能对阐明精子发生的生理和病理机制具有十分重要的意义。在本研究中,应用生物信息学和分子生物学技术相结合的方法克隆了两个睾丸特异表达新基因Spata34和Mage-k1,并分别对其功能进行了初步研究。主要方法及实验结果如下:1.克隆了两个睾丸特异表达新基因Spata34和Mage-k1,并对其进行了系统的生物信息学分析。结果表明大鼠Spata34的cDNA全长为1986 bp,定位于2号染色体2q24区,含有11个外显子,编码由415个氨基酸组成的分子量为46.47 kD的蛋白质,推测Spata34蛋白定位于细胞核。小鼠Mage-k1基因cDNA全长为1602 bp,定位于X号染色体XA6区,含有2个外显子,编码由320个氨基酸组成的分子量为35.04 kD的蛋白质,可能为一种胞浆蛋白。2.对大鼠生精细胞凋亡相关基因Spata34进行了初步的功能研究。多组织RT-PCR结果显示:在已检测组织中,Spata34基因在正常大鼠睾丸组织中高表达,在卵巢组织中有微弱表达,而在其他组织中未检测到表达。原位杂交结果显示:Spata34在睾丸组织的精母细胞、精子中高表达,而在精原细胞中弱表达,提示Spata34基因可能在睾丸生殖细胞的发育过程中扮演着重要的角色。构建了原核表达载体pET28b/Spata34,并诱导Spata34基因在大肠杆菌Rosetta中表达融合蛋白。亚细胞定位结果显示:pEGFP-C3/Spata34质粒转染COS-7细胞后,绿色荧光出现在胞核和胞浆,表明Spata34蛋白主要在胞核和胞浆中表达。3.对小鼠睾丸特异表达新基因Mage-k1进行了初步的功能研究。多组织RT-PCR结果显示:Mage-k1基因在正常小鼠睾丸组织中特异性高表达,而在其他组织中未检测出表达。小鼠不同发育时期睾丸组织RT-PCR结果显示:Mage-k1基因在睾丸中的表达呈发育阶段特异性,其在小鼠出生后1-4周低表达,此后随着睾丸的发育其表达量逐步上升,并在性成熟时保持稳定表达。原位杂交结果显示:Mage-k1基因在睾丸组织的精母细胞、精子中高表达,而在精原细胞中不表达。成功构建出原核表达载体pGEX-4T-2/Mage-k1及pET28b/Mage-k1,并诱导了Mage-k1基因在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,用亲和层析法纯化了蛋白质,为后续Mage-k1基因功能的深入研究奠定了良好的基础。以上实验结果表明Spata34和Mage-k1基因与精子发生及生精细胞凋亡有关,可能在精子发生、睾丸发育以及生精细胞凋亡中起重要作用。克隆Spata34和Mage-k1基因并研究其功能,将有助于探明精子发生的分子机制,并为男性不育患者的的诊治以及新型避孕药物的研制提供了新的靶标。
黄海燕[6]2002年在《一个新的与生精有关的蛋白的特异性基因的分离、鉴定及功能研究》文中指出哺乳动物精子发生是一个复杂的增殖与分化过程，分为三个主要阶段：A型精原细胞增殖和B型精原细胞分化为初级精母细胞；初级精母细胞通过减数分裂形成圆形精子细胞；精子细胞转变为成熟的精子。此期间多种基因的表达具有严格的时间和空间特异性。体细胞表达的结构性基因静止，而生精细胞特异的基因表达则被激活。分离、克隆不同发育阶段的差异表达基因，有助于深入研究它们在精子发生中的作用，阐明精子发生的机理。 在本课题组以前的工作中，已经采用组织形态学观察与mRNA差异显示逆转录聚合酶链反应(DDRT-PCR)方法相结合，对1、3周龄和成年(8周龄)大鼠睾丸表达的基因进行比较，发现了一个在成年大鼠睾丸特异表达的cDNA片段(CG14)，通过与GenBank数据库进行基因及EST(Expressed Sequence Tag)同源性比较发现，该片段为新的EST(登录号为AF 164432)。原位杂交结果表明，该片段主要在大鼠睾丸的初级精母细胞表达。本文通过Northern杂交，对CG14片段表达的组织特异性进行研究，发现该片段在睾丸组织大量表达，在附睾组织微弱表达，而在心、肝、肾、及脑组织中无表达。 鉴于CG14片段含有一个246bp的完整开放阅读框架，为了研究这个基因的功能，我们成功地构建了重组表达质粒pGEX3X-CG14，并在E．Coli系统高效表达了融合蛋白。利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层析的方法纯化融合蛋白，以此为抗原，免疫日本大耳自家兔，制备了高效价的多克隆抗体。融合蛋白经Xa因子酶切获得分子量大约为8kD的CG14靶蛋白，免疫印迹实验表明，抗血清中含有CG14靶蛋白的特异性抗体。 用自行制备的抗体，对成年大鼠睾丸进行了靶蛋白的间接法免疫荧光细胞组织化学定位研究。结果显示CG14靶蛋白特异性存在于初级精母细胞的细胞浆。用Western Blot检查靶蛋白在成年SD大鼠心脏、肝脏、肾脏、脑、睾丸、附睾组织以及一周龄雄性SD大鼠睾丸组织中的分布，结果表明成年SD大鼠睾丸组织中存在的天然靶蛋白的分子量大约为14kD。而成年SD大鼠心脏、肝脏、肾脏、脑、附睾组织以及一周龄雄性SD大鼠睾丸组织中不存在阳性条带。 根据已知的CG14序列，设计3条基因特异性引物(GSPs)。采用5′RACE方法，对成年SD大鼠睾丸的反转录产物进行套式PCR扩增，获得目的基因的5′端序列，长度为715bp，通过与3′端的CG14序列进行拼接，得到全长cDNA
郭睿[7]2004年在《小鼠精子发生相关基因的表达特征及克隆》文中研究指明哺乳动物的精子发生是一个复杂的细胞分化过程，可分为有丝分裂期、减数分裂期和精子形成期三个阶段。精原细胞通过有丝分裂产生初级精母细胞，初级精母细胞通过第一次减数分裂产生两个次级精母细胞，次级精母细胞的间期很短，不发生DNA复制就进入第二次减数分裂，生成单倍体的圆形精子细胞，圆形精子细胞通过一系列复杂的形态变化，发育为具有头、颈、尾结构的精子。精子发生过程受许多特异分子及细胞间作用的严格调节，包括染色体结构的变化及一系列特定基因的程序性表达。这些内在基因水平的变化又受许多外部因素如激素、环境因素及旁分泌细胞因子的影响。目前对精子发生的外部调节机制已比较清楚，而对调节精子发生过程中一系列特殊现象的分子机制所知甚少，尤其缺乏对关键调节基因的认识。本课题组利用cDNA微阵列、RT-PCR、Northern blot、间接免疫荧光、Western blot、RNA干扰、免疫共沉淀、蛋白质谱等技术研究不同阶段生精细胞中的特异基因及蛋白，试图筛选出在精子发生过程中起关键作用的基因或蛋白，并研究其功能，从而进一步认识精子发生的分子机理。本研究主要包括以下三个方面的内容。 一．小鼠精子发生相关基因的筛选和表达特征分析。我们采用重力沉降结合贴壁培养的方法从不同生长发育时期小鼠睾丸组织中分离出了6种不同发生阶段的生精细胞，包括原始A型精原细胞、B型精原细胞、前细线期初级精母细胞、粗线期初级精母细胞、圆形精子细胞以及长形精子细胞，并从性成熟小鼠附睾中分离出成熟精子。利用cDNA微阵列技术分析了1176个小鼠已知基因在不同阶段生精细胞以及成熟精子中的表达谱，发现了多个阶段差异表达的基因。从中选择了28个较有意义的基因，利用RT-PCR方法研究了它们的生精细胞阶段特异性和组织特异性表达特征。结果发现：G_(β5)、VEGF、ephrin-B_1、EphB2、ERF和IGFBP4 6个基因仅在精原细胞中高表达；Egr2、FST、S100A11和E2F3 4个基因在早期生精细胞及成熟精子中高水平表达；Dvl-3和cyclin E1两个基因在减数分裂期高表达；TTF1和Dvl-1基因在圆形及长形精子细胞中表达水平较高；STAM、MAP4、FASL、cyclin F、TP~(53)、Nf1和Dvl-2 7个基因从A型精原细胞至长形精子细胞阶段持续表达，在成熟精子中表达下
张明[8]2002年在《哺乳动物性别控制相关问题的研究》文中研究说明本论文是研究有关哺乳动物性别控制相关的问题。论文共分为两大部分：第一部分，包括第一章和第二章，为文献综述部分；第二部分，包括第三至第六章，为试验研究部分。 第三、四章研究的目的是确定流动细胞分离检索仪分离的精子对牛卵母细胞体外受精和胚胎发育的影响，以及确定精子分离过程及染色是否会引起胚胎染色体异常。共使用了4273个从牛卵巢抽取的卵母细胞并分别与3种类型的冷冻精子(分离、染色未分离和未染色未分离)进行体外受精(IVF)试验。这些精子分别来自于3头公牛，每头公牛重复试验3～5次。此外，还应用细胞遗传学方法对351个第6～8 d的IVF囊胚进行了染色体分析。数据使用ANOVA程序、方差分析或卡方检验等进行统计分析。结果显示，1)3种类型精子受精后的囊胚率未有显著差异，分别为20.4％，22.62％和22.14％，只是分离精子的卵裂率比未分离的精子要低(71.93％比53.66％；P＜0.05)。2)所测试的3头公牛的卵裂率和囊胚率在公牛之间有所差异，即H008号公牛的卵裂率明显低于H010和H016号公牛(分别为40.6％比74.4％和69.8％；p＜0.05)，囊胚率明显低于H010号公牛(17.4％比25.1％；p＜0.05)。3)分离精子、染色未分离精子和未染色未分离精子的胚胎中，染色体组成表现为异常的，即嵌合体的胚胎分别占57％(82／145)、59％(59／106)和65％(65／100)，三者染色体异常的比例无显著差异。4)胚胎染色体异常的频率在不同公牛之间存在差异，即H016号公牛与H008号公牛的胚胎染色体异常率差异显著(30％比45％；p＜0.05)。5)第6、第7d和第8d回收的囊胚染色体异常频率之间没有显著差异。结果证明：1)分离过程或染色并没有影响胚胎发育到囊胚，也没有影响胚胎的染色体组成，流动细胞分离检索仪分离的精子可以有效地用于牛胚胎的体外生产；2）胚胎的发育阶段对胚胎染色体的异常也没有影响． 第五章研究的目的是，比较由流动细胞分离检索仪分离的牛X和Y精子及未分离精子进行单精子胞质内注射（ICS ）和IVF后的胚胎发育状况及染色体组成情况，确定分离精子是否对ra结果有影响。用来自于同一头公牛叫）分离的 X和 Y及未分离的精子分别禾体外成熟的萝母细月进行IC＊和1＊F，结果显示，Z）3禾精子ICSI或IVF后的卵裂率和囊胚发育率没有显著差异（只是IVF组分离精子的卵裂率低于未分离精子，p＜0．05）； 2）同一种类型精子ICSI或＊ 后的卵裂率及囊胚率差异也不显著，分离精子ICSI的卵裂率禾囊胚率与其IVF 白结果相近，分别为71．75O比65O，22．1o比25．6o。爿 ICSI禾 IVF产生的第 7 d禾第 8 d囊胚进行《 渗、固定及染色等处理后，检查胚胎细胞数和染色体组成，其结果是，分离的X和 Y精子和未分离精子ICSI后囊胚的平均细胞数三者之间无差异 巾功．l），同样＊ 后的翼胚平均细胞数也无差异，但ICSI i的平土全胞数低 于 IVF组（p、0＊05）。染色体分析的结果表明，ICSI禾 IVFZtfl囊胚的染色体异常率，3种类型的精子之间不存在差异。ICSI和IVF两组的囊胚染色体异常率，二者之间也未有显著差异＊0．9％比33．6O）。总之，分离精子没有影响ICSI胚胎的发育，n 过程及分离精子也没有增加 ICSI胚胎染色体的异常率，流动细胞分离仪分离的牛精子可以有效的应用于ICSI。 第六章的研究是运用分子克隆技术，从小鼠的睾丸中分离和克隆一个新的基因，称为GSE（gonad－specific expression gene）。fR省酸序列分析揭示，GSE CDNA的开放阅读框架的长度为 745hp，编码由247个氨基酸残基组成的、预测分子量为 27石 Kda的蛋白质。从推断出的蛋白质氨基酸排列顺序表明，GSE蛋白质在细胞中可能是一个不带有信号肚的可溶性蛋白石 印迹只检测到有限数量的基因组DNA片断，提示GSE是一个单拷贝的基因u用放射性同位素标记了的小鼠 GSE CDNA为探针，与从各种成年小鼠组织中提取的 POly（A）’RNA（各 ZPg ） 进行Norther＊印迹分析显示，GSE mRNA在小鼠 卜体细胞组织卜心、肝、肾、肺、脑。骨骼肌、及脾）中没有检测到其表达，但在睾丸中有强转录表达，在卵巢中有低转录表达。为了阐明GS［5表达与配子发生的关系，从0。～49 日龄小鼠睾丸和卵巢中提取mRNA 每祥品 0．sllg）将其与特定的 GSE cDNA引物进行 RT－PCR反应，分析的结果发现，GSE；nRNA在出生后第 14天的小鼠睾丸中首先被检测到，这一时间正是中粗线期精母细胞很可能出现的时期。为了进一步调查GSE是否在限定的睾丸生殖细胞中特异表达，以小鼠 GSE CDNA反向转录的 RNA为探针与小鼠睾丸切片进行原位杂交的分析证实，GSE mRNA分布于精母细胞 z（粗线期人 圆形精细胞以及伸长精细胞的细胞质中，这一结果与 RT干C R分析的结果相吻合。从另一方面来看，GSE mRNA在出生时小鼠的卵巢中己经出现，这也正是生殖细胞进行减数分裂的时间。上述的这些结果提示，GSE与配子发生过程中的减数分裂有?
杜颖[9]2008年在《大鼠睾丸特异表达基因Ube1的分离鉴定及生物学特征研究》文中研究表明精子发生是一个十分复杂但又高度有序的细胞分化过程,是相关基因严格受时空调控相继转录表达的结果。生精细胞的发生分多阶段进行,曲细精管截面上不仅可以看到处于精子发生过程不同阶段的各种生精细胞的组合,还可以看到支持细胞、间质细胞等其它类型的细胞。它们分别具有自己的基因时空表达规律,但是此过程中的分子机制尚未完全阐明。因此分离得到单一的生精细胞群并建立单一细胞类型的cDNA文库,就可以特异性地研究单一细胞的基因表达和有效地筛选不同生精细胞群之间差异表达的基因。本研究采用牛血清白蛋白的梯度沉降法分离高纯度生精细胞,并通过抑制性消减杂交(Suppressive Subtractive Hybridization,SSH)技术,构建了A型精原细胞和粗线期精母细胞的双向消减cDNA文库,并对筛选出来的部分已知和未知基因进行深入探索。根据SSH的结果,我们从A型精原细胞和粗线期精母细胞的双向消减cDNA消减文库中选择了576个PCR纯化产物进行斑点杂交(Dot Blotting)分析,以验证差异表达并分析其表达差异的强度。结果得到480个克隆在两种细胞之间表达差异相差大于2倍。随后我们选取40个存在明显表达差异的克隆进行测序分析,共产生了37个质量满意的ESTs序列,总测序成功率达到92.50%。将这些EST分为已知基因、已知EST和全新EST三类。由于不同组织中基因的表达水平不同及cDNA文库构建所产生的冗余性,结果从大鼠A型精原细胞和粗线期精母细胞双向消减cDNA文库中得到的已知基因、已知EST和全新EST分别为89.19%、5.40%和5.40%。对代表已知基因的ESTs按照功能分类,发现主要涉及细胞凋亡、信号传导和细胞间物质运输、细胞结构/运动、转录调节、代谢、线粒体基因几类,并初步探讨了大鼠精子发生过程中差异表达基因的作用和意义。将大鼠精原细胞特异表达的克隆编号为P5B10的EST序列进行RACE(RapidAmplification of cDNA Ends)技术扩增,获得一个新的cDNA序列,命名为大鼠泛素激活酶基因(Rattus norvegicus Ubiquitin-Activating Enzyme E1,Ubel)。在我们发现大鼠Ubel之前,GenBank库中没有大鼠Ubel的报道,我们第一次克隆了大鼠的Ubel基因的全长,登录GenBank,获得登录号为EF690356。该基因序列全长3433bp,其中开放阅读框有3171bp,编码一个含1057个氨基酸的蛋白质。预测其编码蛋白分子量为11.78kD,等电点5.32。Blast比对显示,Ubel基因与小鼠泛素激活酶基因(Ubelyl)的同源性为92%,与人泛素激活酶基因(UBE1)的同源性为83%。Ubel基因编码的蛋白质包含了泛素激活酶信号位点和泛素激活酶活化位点,分别位于410-418aa和629-637aa,它们均存在于人类和小鼠的泛素激活酶中。逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)结果显示,Ubel在大鼠睾丸中大量表达,而在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脑、卵巢中没有表达;我们用RT-PCR和荧光定量PCR检测了精原细胞、粗线期精母细胞、圆形精子细胞和支持细胞中Ubel的表达特性,结果显示精原细胞中Ubel基因大量表达,精母细胞、精子细胞和支持细胞中微弱表达。因此,Ubel是大鼠睾丸特异表达的基因,可能通过参与泛素/蛋白酶体途径来影响大鼠精子发生。以上这些工作为Ubel的进一步功能研究完成初步的准备工作。
侯宇[10]2010年在《小鼠Miwi基因在减数分裂过程中特异表达的调控机制》文中提出小鼠Miwi基因属于Argonaute基因家族Piwi基因亚家族的一员,Satomi Kuramochi-Miyagawa等人于2001年最早克隆到。研究发现Miwi只在小鼠睾丸组织中有表达,表达于从粗线期中期到圆形精子细胞时期的生殖细胞中。最近的研究发现Miwi能与一类新发现的、在小鼠雄性性腺中特异表达的小分子RNA(piRNA)相互作用,并参与转座子转录活性的调控,维持精子发生过程中基因组的稳定等重要功能。是什么原因导致了Miwi基因的高度时空特异性表达?这是我们非常感兴趣的问题。本论文的研究目的旨在克隆小鼠Miwi基因启动子,研究Miwi基因启动子区CpG岛在不同组织、不同细胞类型中的甲基化模式；分析小鼠Miwi基因启动子区甲基化模式与Miwi基因表达模式的关系；分析小鼠Miwi基因核心启动子区域的重要调控元件及相关转录因子,力图阐明小鼠Miwi基因组织特异性表达的转录调控机制。获得的主要研究结果如下：1.小鼠Miwi基因具有睾丸特异性表达通过RT-PCR的方法检测小鼠Miwi基因在生后2.5天、4.5天、6.5天、8.5天、10.5天、12.5天、14.5天、16.5天、18.5天、20.5天小鼠的睾丸、成年小鼠睾丸、肝脏和卵巢组织中的表达。在肝脏、卵巢组织中没有检测到Miwi的表达,在不同时期的小鼠睾丸中,Miwi基因从出生后12.5天的小鼠睾丸中开始表达,在出生后18天(粗线期精母细胞在小鼠睾丸中占到最大比例)时达到最高值,其后有所降低并保持在一个固定水平。同时也进行了免疫荧光和免疫组化实验检测Miwi蛋白在小鼠睾丸中表达的细胞类型,结果显示Miwi蛋白在成年小鼠睾丸的粗线期精母细胞到圆形精子细胞时期表达,在粗线期Miwi蛋白分散在细胞质中,而到了圆形精子细胞时期Miwi蛋白集中到了P body中形成一个点。通过对Miwi基因表达谱的研究,发现Miwi基因具有高度组织特异性表达。2.小鼠Miwi基因启动子区CpG岛的甲基化模式运用"MethPrimer"软件对Miwi基因启动子区进行分析,预测CpG岛,通过亚硫酸氢盐测序PCR (Bisulfite sequencing PCR,BSP),分别检测不同组织、不同细胞类型Miwi基因启动子区CpG岛的甲基化状况,结果显示：在肝脏组织、精原细胞、支持细胞和附睾精子中Miwi基因启动子区CpG岛高度甲基化,而在粗线期精母细胞、圆形精子细胞Miwi基因启动子区CpG岛去甲基化。Miwi基因启动子区CpG岛的甲基化状况与其表达呈现明显的负相关,提示Miwi基因启动子区CpG岛的甲基化可能参与了Miwi基因组织特异性表达的调控。3.小鼠Miwi基因转录起始位点的确定及核心启动子的鉴定采用5’端cDNA末端快速扩增法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)确定了Miwi基因转录起始位点在基因组上位于起始密码子ATG上游2871bp附近。通过构建包含Miwi基因5’上游序列的缺失突变的荧光素酶报告质粒,利用脂质体瞬时转染,检测荧光素酶活性,对Miwi启动子区进行分析,结果显示,启动子核心区域位于-106-+181区域,而该区域正好位于Miwi基因启动子的CpG岛上。4.转录因子NFY和USF上调Miwi-Luc通过对Miwi基因核心启动子区域的DNA序列进行转录因子结合位点预测,发现在MiWi核心启动子上存在转录因子NFY结合的CCAAT box和USF1/2结合的两个E box.突变分析证明了CCAAT box和第二个E box(E2 box)对Miwi的表达具有重要作用。通过构建NFYa、NFYb.NFYc.USF1、USF2的真核表达质粒与含Miwi基因5’上游序列的荧光素酶报告质粒共转染,检测荧光素酶活性发现转录因子NFYa. NFYb.NFYc.USF1和USF2均能上调Miwi的表达,而与其相应的结合位点突变的荧光素酶报告质粒共转染,则不能上调Miwi的表达。同时,NFYa的显性负效应质粒NF-YAm29或者USF的显性负效应质粒A-USF与含Miwi基因5’上游序列的荧光素酶报告质粒共转染,则降低荧光素酶报告基因的表达。说明转录因子NFYa.NFYb. NFYc能通过与CCAAT box的结合上调Miwi基因的表达,而转录因子USF1.USF2能通过与E2 box的结合上调Miwi基因的表达。5.转录因子NFY和USF在体外与体内状态下与MiWi基因启动子结合电泳迁移率变动实验(electrophoresis mobility shift and supershiftassay, EMSA)及染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)证明：NFYa/b/c和USF1/2可在体外及体内与Miwi基因启动子-102～-71区域相结合。6. E2 box区甲基化是Miwi基因组织特异性表达的关键EMSA实验证明E2 box中CpG二核苷酸甲基化能阻止转录因子USF与其结合位点E2 box的结合；Miwi基因启动子区CpG岛的甲基化与其表达呈现明显的负相关,特别是E2 box中CpG二核苷酸在Miwi基因表达的细胞类型和组织中去甲基化,而在不表达的细胞和组织中始终处于甲基化状态；同时ChIP实验表明在肝脏组织中,E2 box中CpG二核苷酸处于甲基化状态时,USF不能与该位点结合,而在睾丸组织中,E2 box中CpG二核苷酸处于去甲基化状态时,USF能与之结合；以上实验结果表明：E2 box中CpG二核苷酸中胞嘧啶甲基化是Miwi基因在雄性生殖细胞中从粗线期到圆形精子细胞时期特异性表达的关键。7.303bp Miwi基因启动子片段可指导外源基因在精子发生中特异表达Miwi-GFP转基因小鼠的结果证明：Miwi基因启动子-122-+181区域包含ccaat box (-97～-93)和E2 box (-82～-77)的DNA片段能够指导外源基因EGFP在雄性生殖细胞中从粗线期到圆形精子细胞时期特异表达。
参考文献：
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[9]. 大鼠睾丸特异表达基因Ube1的分离鉴定及生物学特征研究[D]. 杜颖. 中国协和医科大学. 2008
[10]. 小鼠Miwi基因在减数分裂过程中特异表达的调控机制[D]. 侯宇. 武汉大学. 2010
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