刘谦[1]2002年在《先天性巨结肠Cajal间质细胞的研究》文中提出目的：先天性巨结肠症(Hirschsprung’s disease，HD)的发病率为1/5000，尽管对先天性巨结肠的病因学研究已有近百年的历史了，其发病原因和发病机制目前仍不十分清楚。本研究通过观察Cajal间质细胞(interstitial cell of Cajal，lCC)在先天性巨结肠患者狭窄段、移行段、扩张段中的分布情况，探讨lCC在先天性巨结肠发病中的作用。 方法：收集我院26例先天性巨结肠患儿标本，于手术中分别选取扩张段，移行段及狭窄段肠壁的全层组织，常规固定石蜡包埋组织切片备用。采用SP法(过氧化物酶标记的链霉卵白素法)免疫组织化学技术，对26例先天性巨结肠的狭窄段，移行段及扩张段标本分别进行c-kit免疫组织化学反应，观察Cajal间质细胞分布情况。 结果：发现ICC的密度从扩张段一移行段一狭窄段是逐渐减低的，在狭窄段少见。ICC与肌间神经丛关系密切，在扩张段ICC分布在神经丛的周边部，且数量相对较多，在神经丛内部亦可见散在ICC，在狭窄段ICC偶见于神经丛的周边部，在神经丛内部不可见该细胞。 结论：根据我们的结果，ICC的分布异常与先天性巨结肠的发生有密切关系。进一步推测其原因，我们考虑有如下可能： ①胚胎基质的某种缺陷不仅损害了神经嵴细胞的移行，也影响ICC的分化和成熟。 天津医科大学硕士毕业论文②ENS的存在可能需要丰富的且完全分化的 ICC网络。③神经节细胞移行和完全发育需要ICC。 结合ICC的功能（起搏胃肠道平滑肌活动、推进电活动的传播、调节神经递质等功能人 我们可以推论，与HD肠壁神经节缺失一样，KC分布异常导致 HD病变肠管慢波节律和兴奋传导异常，从而引起或加重HD的发病。
刘谦, 胡晓丽, 谷继卿[2]2003年在《先天性巨结肠Cajal间质细胞的研究》文中研究指明目的 本研究通过观察Cajal间质细胞 (interstitialcellofCajal,ICC)在先天性巨结肠患者狭窄段、移行段、扩张段中的分布情况 ,探讨ICC在先天性巨结肠发病中的作用。方法 收集我院1999～ 2 0 0 2年 2 6例先天性巨结肠患儿标本。短段型 2 4例 ,长段型 2例。于手术中分别选取扩张段 ,移行段及狭窄段肠壁的全层组织。采用SP法 (过氧化物酶标记的链霉卵白素法 )免疫组织化学技术 ,对 2 6例先天性巨结肠的狭窄段、移行段及扩张段标本分别进行c kit免疫组织化学反应 ,观察Ca jal间质细胞分布情况。 结果 发现ICC的密度从扩张段→移行段→狭窄段是逐渐减低的。ICC与肌间神经丛关系密切 ,在扩张段ICC分布在神经丛的周边部和内部 ,且数量相对较多 ,在狭窄段ICC偶见于神经丛的周边部 ,在神经丛内部未见该细胞。光学显微镜下比较同一例患者扩张段和狭窄段神经丛中Cajal间质细胞的数目不同 (t=2 3.0 4 ,P <0 .0 5 ) ,有统计学显着性差异。结论 ICC的分布异常与先天性巨结肠的发生有密切关系。我们推测胚胎基质的某种缺陷不仅损害了神经嵴细胞的移行 ,也影响ICC的分化和成熟。我们可以推论 ,与HD肠壁神经节缺失一样 ,ICC分布异常导致HD病变肠管慢波节律和兴奋传导异常 ,从而引起或加重HD的发病。
何智丽[3]2009年在《Connexin43与Cajal间质细胞在先天性巨结肠结肠壁的分布的研究》文中进行了进一步梳理背景和目的先天性巨结肠(Hirschsprung's diseas,HD)是小儿外科的常见病,临床症状主要为腹胀、便秘等肠动力障碍表现,以患儿的一部分肠壁缺失神经节细胞为特征表现,近几年有研究发现先天性巨结肠与Cajal间质细胞(interstitial cells of Caja,ICC)减少和细胞间通讯功能障碍有关。ICC是胃肠道平滑肌细胞间的起搏细胞,它们可以产生自发性慢波并介导神经递质传递。ICC之间及ICC与平滑肌细胞之间信号传递由缝隙连接(Gap Junction,GJ)介导,GJ是细胞间信息通讯的主要通道。缝隙连接蛋白是GJ基本构成部分,而缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)是人类最重要的缝隙连接蛋白。本实验运用免疫组化方法观察Cx43和ICC特异性标志物c-kit在HD结肠壁的表达情况,并应用电镜技术观察HD结肠壁的ICC和缝隙连接的超微结构,以探讨二者与HD发病的关系。材料和方法1.应用免疫组化方法观察30例HD手术切除标本(分别取狭窄段和扩张段全层组织)和15例正常结肠组织中c-kit和Cx43的表达;2.应用电镜技术观察5例新鲜HD手术切除标本(包括狭窄段和扩张段全层组织)中ICC和GJ的超微结构;3.统计学处理:所得到的计量资料分析采用单因素方差分析,最小显着差法(LSD);定性资料采用x~2检验;有统计学意义者进行x~2分割。显着水准取α=0.05,x~2分割时调整检验水准为α=0.05/3=0.1666。结果1.c-kit在HD狭窄段中的表达明显少于正常对照组和HD扩张段(P＜0.01),在正常结肠和HD扩张段中表达比较差别无统计学意义(P=0.535＞0.05);2.Cx43在HD狭窄段中的表达较正常对照组和HD扩张段明显减少(P＜0.01),而在正常对照肠壁和HD扩张段中表达之间的差别无统计学意义(P=0.458＞0.05);3.扩张段平滑肌及ICC之间可见到缝隙连接,神经节完整,ICC围绕神经节分布。HD狭窄段可见孤立的ICC,其形态及内部结构未见明显变化。结论1.与神经节细胞缺如一样,先天性巨结肠病变肠管缺少Cajal间质细胞是HD的病理改变之一;2.先天性巨结肠病变肠管不仅Cajal间质细胞减少,而且存在缝隙连接蛋白connexin43表达和分布减少;3.ICC和connexin43数目和分布异常可能HD发病的原因之一。
谭宇彦[4]2015年在《Cajal间质细胞在胆囊结石形成中的作用以及保胆取石术方法学研究》文中进行了进一步梳理目的：1、胆囊结石是一种常见的消化系统疾病。胆囊结石的成因复杂,胆囊运动功能异常是一个关键的因素。以往的研究多集中在胆囊对胆囊收缩素(Cholecystokinin, CCK)敏感性下降、CCK受体功能失调、胆囊平滑肌功能减退以及肝外胆道系统调节功能紊乱等方面。随着对消化道Cajal间质细胞(Interstitial ICC of Cajal,ICC)的深入研究,发现ICC异常与多种消化道动力紊乱性疾病关系密切。最新的研究表明ICC存在于动物和人类胆囊,其对胆囊动力的调控以及与胆囊结石发病的关系成为了研究热点。我们在构建兔胆囊胆固醇结石模型的基础上,通过一系列体内、外实验,对胆囊结石形成过程中胆囊收缩功能与ICC的变化关系以及相关原因和机制进行探讨,为胆囊结石的病因研究和预防提供新的理论依据。2、胆囊切除被认为是治疗胆囊结石的“金标准”,但是术后多种并发症以及胆囊切除后对人体生理机能的影响,使得一些专家对此进行了反思,提出了“新式的微创保胆取石手术”。但经过多年的临床实践,专家们发现该术式在适应症及技术操作标准等方面仍有一些细节值得改进和规范。我们根据ICC在胆囊的分布特点,对保胆取石手术的方法学进行探索研究,取得了初步结果。方法：(1)52只新西兰大白兔随机分为对照组20只,实验组32只,分别予以普通饲料和致石饲料喂养,6周后行B超检查成石情况。核素扫描评估胆囊收缩功能；多导生理记录仪检测在体胆囊基本电节律和胆囊肌条对CCK反应张力的改变。免疫荧光全层铺片计数胆囊ICC变化；电镜观察ICC超微结构改变。Western Blot检测胆囊c-kit蛋白表达。(2)全自动生化仪检测两组胆汁胆固醇饱和指数、胆囊组织氧化应激指标,TUNEL染色观察两组胆囊ICC凋亡的变化。应用胶原酶II消化法分离培养兔胆囊原代ICC,c-kit免疫荧光鉴定,通过梯度离心、显微机械刮除技术对其进行纯化。用不同浓度的胆固醇(0,25,50,100mg/L)对ICC进行干预,通过细胞膜片钳、流式细胞仪等检测ICC起搏电位、氧化应激和凋亡的变化。随后在含100mg/L胆固醇的培养基加入不同浓度的胆固醇清除剂甲基-p-环糊精(0,2,4,6mM)对ICC进行干预后,检测ICC起搏电位、氧化应激和凋亡的变化。(3)65名符合保胆取石术指征并自愿接受手术的胆囊结石患者,根据ICC在胆囊的分布特点设计不同胆囊切口位置,随机分为胆囊底部切口组(35名),胆囊体部切口组(30名),对比两组患者术后胆囊功能恢复的情况；同时就手术的适应症、禁忌症进行补充和完善；并定期随访保胆术后患者的疗效及结石复发情况。结果：(1)B超检测实验组兔胆囊成石率为74.2%(23/31)。核素扫描结果显示,实验组胆囊收缩功能较对照组明显下降(P<0.05)。实验组胆囊基本电节律的频率和振幅和胆囊肌条对CCK反应张力明显低于对照组(P<0.05)。胆囊全层铺片免疫荧光检测示实验组ICC数目明显少于对照组(P<0.05)。结石胆囊ICC超微结构发生线粒体肿胀、自噬小体形成、细胞核内陷、染色质边集等病理改变。Westen Blot显示结石胆囊组织c-kit蛋白表达低于正常胆囊(P<0.05)。(2)成石胆汁胆固醇饱和指数明显高于对照组(P<0.05)。结石胆囊组织氧化应激指标显着高于正常胆囊(P<0.05)。全层铺片CD117/TUNEL免疫荧光双染显示正常胆囊组织有极少ICC凋亡,而结石组ICC凋亡明显增多(P<0.05)。体外试验中,成功对胆囊原代ICC进行了分离、培养和纯化,纯化率约为85%。随着培养液中胆固醇浓度的逐渐增加(0,25,50, 100mg/L),ICC的起搏电流的振幅和频率逐渐减小、氧化应激反应逐渐增强、ICC凋亡率逐渐升高,呈剂量依耐性变化,各组间比较差异均有显着性(P<0.05)。随着甲基-p-环糊精浓度的增加,对细胞结合胆固醇清除的增多,ICC起搏电流的振幅和频率逐渐恢复、氧化应激反应逐渐减弱；ICC凋亡率逐渐降低,呈剂量依耐性变化,各组间比较差异均有显着性(P<0.05)。(3)65名胆囊结石患者接受保胆取石手术,中转腹腔镜胆囊切除4例,保胆取石手术61例,均无手术并发症。术后随访18(6-24)月,结石复发3例,复发率为4.92%。术前存在的消化道症状,术后基本消失。观察胆囊不同切口部位对术后胆囊收缩功能恢复的影响,发现术后1月底部切口和体部切口两组胆囊射胆分数(Gallbladder EjectionFraction, GEF)较术前均有减弱,且两者无明显差异(P>0.05)；术后3月及6月的GEF检测显示,底部切口术后胆囊收缩功能的恢复明显优于体部切口,两者差异有显着性(P<0.05)。结论：(1)饮食诱导兔胆囊胆固醇结石形成过程中,胆囊ICC明显减少,胆囊运动功能下降。(2)成石胆汁中胆固醇过饱和诱发胆囊组织氧化应激反应,导致胆囊ICC凋亡。(3)高胆固醇影响胆囊ICC电生理活动,使ICC起搏电位减弱,妨碍了胆囊平滑肌基本电节律的产生,介导了胆囊收缩功能减弱。(4)保胆取石术中选择胆囊底部切口,更有利于术后胆囊收缩功能的恢复。(5)保胆取石手术有严格的适应症和禁忌症。其远期疗效尚需通过前瞻性、大样本、多中心的随机对照研究进行临床评估。
何丹[5]2008年在《Cajal肠间质细胞、nNOS神经与先天性巨结肠及术后小肠结肠炎的关系》文中进行了进一步梳理目的:通过检测先天性巨结肠(HD)病理组织中Cajal间质细胞(ICC)和神经型一氧化氮合酶(nNOS)的表达,调查HD术后小肠结肠炎及排便功能,探讨HD的发病机制以及术后小肠结肠炎发生的原因。方法:收集我院2002～2006年术后病理确诊为HD的手术标本40例。每例标本采集狭窄段,移行段及扩张段蜡块每段各一块,分别行HE染色,nNOS和C-kit免疫组化染色,以4例非消化道疾病死亡小儿结肠标本作为对照,观察各段肠壁Cajal间质细胞和神经节细胞病理组织学变化。并对各个病例进行排便功能以及肠炎发生情况的随访,建立数据,进行统计学分析。结果:正常结肠Cajal间质细胞主要分布在环肌内侧面与粘膜下层之间即粘膜下Cajal间质细胞(ICC-SM)、环肌与纵肌之间的肌间神经丛周围即肌间Cajal间质细胞(ICC-IM)以及环肌与纵肌内;HD患儿狭窄段粘膜下、肌间Cajal间质细胞数较扩张段和对照组明显减少(P<0.01),且Cajal细胞的细胞突起的分支亦减少,彼此之间不能形成完整的细胞网络;HD患儿移行段粘膜下、肌间nNOS阳性神经节细胞较扩张段和对照组明显减少(P < 0.01),狭窄段未查见nNOS阳性神经节细胞;扩张段神经节细胞和Cajal细胞与对照组比较无明显差异(P>0.05)。本组病例随访到30例,其中术后肠炎者有6例。肠炎的发生与手术时的年龄和性别无关。对发生肠炎的6例病例切除肠段进行分析,发现扩张段近端ICC分布较无肠炎者明显减少,结构松散,网状结构不完整,差异有统计学意义(P<0.05)。本组排便功能评分为优者22例(73.3%),良者4例(26.7%),均无评分为差者。其中肠炎组评分为优者2例(33.3%),良者3例(66.7%),与未发生肠炎者比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1、HD患儿的病变肠管中存在ICC分布异常,考虑与神经节细胞缺失一样,也是由于胚胎基质的某种缺陷,不仅损害了神经嵴细胞的移行,也影响了ICC的分化成熟。2、由于ICC是肠道平滑肌的起搏点及协调者。本研究证实扩张段近端ICC的异常分布,推测与术后EC的发生具有相关性,排便功能与EC的发生具有一致性。可能尽量切除扩张段近端ICC不正常的肠管对降低术后EC的发生有一定的帮助。
王加勇[6]2006年在《Cajal间质细胞、神经节细胞在先天性巨结肠分布的免疫组化研究》文中进行了进一步梳理目的 先天性巨结肠(Hirschsprung's disease，HD)，的发病率为1／5000，是小儿肠梗阻的常见原因，其发病原因认为病变肠管缺乏神经节细胞，致使肠管持续痉挛，肠蠕动障碍。近年研究发现Cajal细胞参与胃肠道平滑肌活动的起搏，推进电活动的传播，调节神经递质等。本研究通过观察神经节细胞与Cajal细胞在正常结肠及先天性巨结肠患者痉挛段、移行段、扩张段的分布，探讨先天性巨结肠的发病机制。 方法 收集山东省立医院25例先天性巨结肠患儿标本，于手术中分别选取扩张段、移行段、痉挛段肠壁的全层组织，另取6例正常结肠全层组织标本，常规固定石蜡包埋组织切片备用。对标本分别行HE染色、NSE免疫组化染色和c-Kit免疫组化染色。光镜观察神经节细胞和Cajal细胞的分布并计数，进行统计学分析。 结果 正常结肠Cajal间质细胞(ICC)主要分布在环肌内侧面与粘膜下层之间即粘膜下ICC(ICC-SM)、环肌与纵肌之间的肌间神经从周围即肌间ICC(ICC-IM)以及环肌与纵肌内。HD患儿移行段粘膜下、肌间神经节细胞较扩张段和正常对照组明显减少(P＜0.01)，痉挛段未查见神经节细胞；痉挛段粘膜下、肌间Cajal细胞数较扩张段和正常对照组明显减少(P＜0.01)，且Cajal细胞的细胞突起的分支亦减少，彼此之间不能形成完整的细胞网络。而扩张段神经节细胞和Cajal细胞与正常对照组比较无明显差异(P＞0.05)。
王霞[7]2006年在《先天性巨结肠和巨结肠同源病中c-kit～+间质细胞的分布及突触素表达的研究》文中认为先天性巨结肠(Hirschsprung’s disease,HD)是由于直肠或结肠远端的肠壁内无神经节细胞,导致病变处肠管痉挛狭窄,丧失蠕动和排便的功能,使近端结肠粪便淤滞、积气,而继发肠管肥厚、扩张,逐渐形成巨结肠改变。先天性巨结肠同源病(Allied Hirschsprung’s disorder,HAD)为临床症状、X线表现与先天性巨结肠相似,病理改变介于先天性巨结肠(肠壁内神经节细胞缺失)和正常人结肠之间的一类疾病统称,包括神经节细胞减少症、神经节细胞未成熟症、肠神经元发育不良等类型。目前认为HD和HAD肠动力障碍的发病机制主要是病变肠段粘膜下神经丛和肌间神经丛的神经节细胞的缺失和减少,病变肠壁内的副交感、交感及第叁类(非肾上腺能非胆碱能)神经系统均有改变。但是临床上HD患儿的临床症状与无神经节细胞段的长度并不直接相关,因此可能还有其它因素在其肠动力障碍的发病中起作用。近年来,随着c-kit的发现,可以应用c-kit对Cajal间质细胞(interstital cells of Cajal, ICCs)进行标记,ICCs越来越受到人们的关注。ICCs是分布在胃肠道神经末稍与平滑肌之间的一类特殊细胞,由西班牙神经解剖学家Cajal在1893年首次描述,它既不是神经元,也不是胶质细胞,更不是平滑肌细胞,而是具有独立功能的特殊间质细胞。ICCs在胃肠运动中起着重要的作用,主要表现在:①ICCs是胃肠平滑肌的起搏细胞,是胃肠的起搏器;②可能促进胃肠电活动的传播;③介导肠神经信号的传递。胃肠正常运动功能的实现同时需要肠神经系统、平滑肌细胞、肠间质细胞(ICCs)的相互协调作用。因此,肠神经系统、平滑肌细胞、肠间质细胞这叁者之间形成的突触功能正常与否,是胃肠道正常运动的基本条件。突触素是突触囊泡膜上的特异性蛋白质,可作为突触的特异标记物之一。本实验从两个方面对HD及HAD肠动力障碍的发病机制进行研究:第一部分应用针对c-kit的免疫组化方法观察ICCs在HD及HAD患儿肠壁的分布,探讨其与HD及HAD肠动力障碍发生的关系;第二部分应用针对突触素单克隆抗体的免疫组化方法观察HD及HAD肠壁突触素的表达,进一步阐述HD及HAD肠动力障碍的发病机制。实验结果:我们观察到,正常对照组近端和远端结肠壁粘膜下层、肠肌层内弥散分布着中等数量的c-kit+ICCs,肌间神经丛周围分布有大量的c-kit+ICCs,并相互连接成网络状结构。HAD远端结肠壁内粘膜下层、环肌层内和肌间神经丛周围的c-kit+ICCs细胞密度减少,与正常对照组相比,差异有极显着性意义(P<0.001)。HD远端结肠壁内粘膜下层、环肌层内和肌间神经丛周围的c-kit+ICCs细胞密度明显减少,与正常对照组相应部位比较,差异也有极显着性意义(P<0.001);与HAD组相应部位相比,差异有显着性意义(P<0.05)。第二部分的突触素免疫组化结果显示,突触素在正常对照组结肠、HD及HAD近端结肠均呈现强阳性免疫反应(P>0.05)。在HD及HAD远端结肠壁肌层突触素免疫反应较正常对照组肠壁肌层稍弱(P<0.05),而粘膜下神经丛及肌间神经丛均呈现弱阳性免疫反应,与正常对照组相应部位比较差异有极显着性意义(P<0.001)。结果提示:ICCs在HD及HAD肠壁的异常分布,以及HD及HAD肠壁突触功能的明显降低,与这两种疾病肠动力障碍的发生密切相关。
王合锋[8]2009年在《Cajal间质细胞与先天性巨结肠病的相关性研究》文中进行了进一步梳理无神经节细胞性巨结肠病(aganglionic megacolon)又称Hirschsprung氏病(Hirschsprung's disease,HD),是一种严重危害婴幼儿健康的先天性畸形,据统计,其发病率高达1/3000～1/5000,居消化道畸形第二位。先天性巨结肠的主要病理变化是一段结肠壁内缺乏神经节细胞,致使该段结肠持续性痉挛,肠腔狭窄,其近端肠腔扩张,内容物潴留。目前,有关先天性巨结肠的发病机制尚不完全清楚,多数观点认为该病属于多因子遗传性疾病,即由遗传和环境因素共同作用所致。先天性巨结肠的主要临床表现是腹胀、顽固性便秘、不完全性肠梗阻。目前临床上唯一有效的治疗方法是手术,但由于手术损伤比较大和结肠缩短,术后常出现小肠结肠炎、稀便、患儿心理障碍等后遗症。因此,有人尝试进行了神经干细胞移植治疗无神经节细胞性巨结肠病的实验研究,即用各种来源的神经干细胞移植入缺少神经节细胞的病变肠壁内。虽然移植进去的神经干细胞可以在肠壁的微环境中存活,并分化为功能性的肠神经细胞,但只是部分恢复了无神经节细胞肠段的运动功能。这说明在先天性巨结肠的发病机制中除了神经节细胞缺如之外,还有其他因素的参与,其中肠壁中的Cajal间质细胞引起了人们的关注。Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)是分布在胃肠道内由中胚层间充质细胞分化而来的一类细胞,由西班牙神经解剖学家Cajal在1893年首次描述。它既不是神经元,也不是神经胶质细胞,更不是平滑肌细胞,而是具有独立功能的特殊间质细胞。目前Cajal间质细胞的生物学特性和特殊功能越来越受到国内外学者的关注。研究发现,这类细胞是胃肠道平滑肌的起搏细胞,能产生生理慢波,并参与电活动的扩布,从而调控胃肠道平滑肌的舒缩和蠕动,其数量减少或缺失与多种胃肠动力性疾病的发生密切相关。先天性巨结肠病属胃肠动力性疾病之一,Cajal间质细胞的异常与先天性巨结肠的发病也必然存在一定的相关性。揭示Cajal间质细胞的异常与先天性巨结肠病发病的相关关系,可进一步阐明无神经细胞性巨结肠病的发病机理,并为先天性巨结肠病的细胞替代治疗提供实验依据。根据上述理念,我们对Cajal间质细胞与先天性巨结肠病的相关性进行了比较深入的研究,论文发表于Neuroscience Letters杂志,实验分为叁个部分:第一部分大鼠结肠Cajal间质细胞的分离与培养为了更好地从形态上识别Cajal间质细胞和利用特异性表面抗原准确地鉴别Cajal间质细胞,从而为下一步的研究奠定基础,我们对大鼠结肠壁内的Cajal间质细胞进行了分离和体外培养。体外细胞培养,是研究细胞功能以及相应细胞信号转导机制的基础,也有利于更深入地掌握疾病本质,制定合理有效的防治措施。但是由于Cajal间质细胞的数量少,分散在结缔组织、神经纤维及平滑肌等组织之中,分离提取的难度较大。对于这类细胞的体外培养,由于无这样的经验可循,因而难度更大。我们采用胶原酶及胰酶酶解和密度梯度离心法,经过多次调配两种酶的浓度和作用时间,成功地对Cajal间质细胞进行了分离。分离出细胞后,将细胞悬液接种于含有干细胞因子(stem cell factor,SCF)的M199培养基中,进行培养。培养24小时后,ICCs即可贴壁生长,培养3天后,可分辨出ICCs形态,胞体呈叁角形或梭形,有少量突起,核大。培养5天后,ICC形态更为清晰,自胞体发出的突起向周围伸长,相邻细胞胞体伸出的突起相互靠近。培养7天后,相邻ICC突起间有连接形成,细胞间彼此联系,突起相互交织,形成网络状结构。细胞培养稳定后,用Cajal间质细胞的特异性标志物c-kit进行免疫细胞化学染色,结果显示Cajal间质细胞呈阳性着色。第二部分小儿结肠壁内Cajal间质细胞的正常分布模式的检测研究表明,从小鼠的胚胎时期直至出生后,Cajal间质细胞在胃肠道内有一个不断发育成熟的过程,并形成不同的亚型。根据Cajal间质细胞在胃肠道内分布部位的不同,通常将其分为叁个亚型,即位于肠壁粘膜下层的粘膜下ICCs,称为IC-SM;位于纵行肌与环形肌之间的肌间ICCs,称为IC-MY;位于肌层内的肌内ICCs,称为IC-IM。有关小儿结肠壁内的叁种亚型的Cajal间质细胞的正常分布状况及其功能至今仍未见报道。基于此,我们收集临床手术切除的小儿正常结肠标本,用小鼠抗人c-kit单克隆抗体(CD117)作标记,免疫组织化学染色,荧光显微镜检测了结肠标本冰冻切片中ICCs的分布状况,观察了叁种亚型的ICCs在小儿正常结肠壁中的分布状况,结果显示肌间ICCs(IC-MY)含量最为丰富,呈网络状包绕在肌间神经节细胞周围,肌层内ICCs(IC-IM)数量也较多,与平滑肌细胞平行分布,粘膜下ICCs(IC-SM)的数量最少。用兔抗人nNOS多克隆抗体标记NOS神经,免疫组织化学染色,荧光显微镜检测了标本冰冻切片及肠壁铺片中NOS神经元及神经纤维的分布情况,结果显示,在纵行肌和环形肌之间,NOS阳性神经元和神经纤维形成网络状结构,肌层内也有较多的NOS阳性神经纤维平行于平滑肌细胞分布。应用c-kit与nNOS双重染色检测了结肠壁中ICCs和NOS阳性神经元及神经纤维的位置关系,结果显示,NOS阳性神经纤维与ICCs之间密切接触,ICCs与平滑肌细胞的接触也很密切。上述实验结果提示,小儿结肠壁内的Cajal间质细胞已形成正常的规律性分布,并与肠神经及平滑肌之间存在着密切接触,可能由此形成肠壁规律性舒缩的结构基础。第叁部分Cajal间质细胞在先天性巨结肠病中的异常变化选择确诊为先天性巨结肠的患儿21例,其中普通型巨结肠16例,全结肠型巨结肠(TCA)5例,取巨结肠根治术标本痉挛段全层肠壁作为实验组,另取7例正常结肠相应节段标本作为对照组,冰冻切片,片厚10μm。用小鼠抗人c-kit单克隆抗体(CD117)作标记,免疫组织化学染色,荧光显微镜检测了实验组及对照组结肠标本冰冻切片中ICCs的分布状况,结果显示,与正常组结肠相比,实验组各结肠标本中叁种亚型的ICCs(IC-MY,IC-IM,IC-SM)数量均明显减少,有显着差异(P＜0.01),与普通型巨结肠相比,肌间ICCs(IC-MY)在全结肠型巨结肠中的数量减少更为明显,有统计学差异(P＜0.01),而粘膜下ICCs(IC-SM)和肌内ICCs(IC-IM)的分布则无明显差异性(P＞0.05)。用兔抗人nNOS多克隆抗体标记NOS神经,免疫组织化学染色,荧光显微镜检测了两组标本冰冻切片及肠壁铺片中NOS神经元及神经纤维的分布情况,结果显示,实验组NOS阳性神经元及神经纤维数量明显减少,甚至缺失,与对照组相比,差异显着(P＜0.01)。应用c-kit与nNOS免疫荧光双重染色,检测了两组标本冰冻切片中ICCs和NOS阳性神经的位置关系,结果显示NOS阳性神经元及神经纤维与ICCs位置疏远,无密切接触。同时,我们还将收集到的结肠标本的肌层,匀浆后提取总RNA和蛋白,应用逆转录多聚酶联反应(Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction,RT-PCR),在mRNA水平上检测正常结肠和HD痉挛段结肠c-kit基因、nNOS基因与看家基因GAPDH的表达,用Western blot方法检测两组标本中c-kit蛋白及nNOS蛋白的表达,对实验结果条带进行半定量分析,结果证实,先天性巨结肠病变肠壁内c-kit蛋白和mRNA表达明显降低(P＜0.01),nNOS蛋白与mRNA表达也明显减少(P＜0.01)。以上实验结果提示,无神经节性巨结肠病患儿病变段结肠壁内叁种亚型的Cajal间质细胞的数量明显减少甚至缺失,病变段肠管必然丧失产生电慢波的能力,同时NOS阳性神经元及神经纤维的数量也明显降低,导致或加剧了巨结肠病变段肠管的功能紊乱。结论1、本课题成功地对Wistar大鼠结肠Cajal间质细胞进行了分离和体外培养,体外培养的ICCs可以形成独立网络状结构,从而为这种细胞的深入研究提供技术支持。2、小儿结肠壁内的Cajal间质细胞和NOS阳性神经网络状结构已经形成,具有了调控结肠运动的结构基础,肌间神经丛中NOS阳性神经元与肌间ICCs(IC-MY)关系密切,NO能神经可能对肌间ICCs(IC-MY)起调节作用。3、无神经节性巨结肠病患儿病变段结肠壁内叁种亚型的Cajal间质细胞(IC-IM,IC-SM和IC-MY)数量均明显减少甚至缺失,病变肠管丧失产生电慢波的能力,同时也有神经节细胞的减少共同导致了HD动力紊乱。
彭洪皓[9]2017年在《脾气虚证大鼠小肠肠神经-Cajal间质细胞-平滑肌网络损伤和针刺足叁里、天枢穴修复作用的实验研究》文中认为背景:脾气虚证(Syndrome of Deficiency of Spleen-Qi,SDSQ)是临床上最常见的虚证之一,临床上主要是以进餐后胃部饱胀不适、消瘦乏力、倦怠易疲劳、面色枯黄无血色、大便稀溏等为临床表现。现代西方医学研究证实:脾气虚证的主要表现是胃肠道运动功能、消化吸收功能、内分泌功能和免疫功能等多系统、多因素的紊乱。然而消化道运动功能的恢复是消化吸收功能、内分泌和免疫功能低下等系统恢复的前提条件。胃肠道运动功能的恢复既是纠正胃肠道损害的最初始同时也是最关键的一步。促进胃肠道动力的治疗能够有效的治疗胃肠道运动功能、消化吸收功能、内分泌和免疫功能障碍等。所以说,探讨脾气虚证胃肠道运动功能障碍的本质,研究治疗脾气虚证胃肠道运动功能障碍的有效方法变得十分必要。针灸作为祖国医学中一种传统的治疗方法,在中国应用已有两千多年的历史。在临床实践中,越来越多的研究显示,针刺足叁里、天枢穴可以纠正胃肠道运动功能紊乱,有效的治疗脾气虚证,在治疗功能性胃肠道疾病方面有着自己独特的优势,但确切的机制仍不十分清楚,需要进一步的研究。目的:通过苦寒泻下结合耗气破气的方法建造脾气虚证大鼠模型,以脾气虚证大鼠小肠肠神经-Cajal间质细胞-平滑肌细胞网络为研究对象,观察脾气虚证大鼠小肠肠神经-Cajal间质细胞-平滑肌细胞网络的损伤,研究脾气虚证的发病机制。然后对脾气虚证大鼠进行针刺足叁里、天枢穴进行治疗,观察针灸对脾气虚证大鼠小肠肠神经-Cajal间质细胞-平滑肌细胞网络损伤的修复作用,进一步探索针刺足叁里、天枢穴治疗脾气虚证的作用机制。方法:选取清洁级成年Wistar大鼠,雌雄不限,参考中国中医科学院陈小野教授的方法,先通过体质筛选,再采用苦寒泻下结合耗气破气的方法建造脾气虚证大鼠动物模型。将大鼠分为对照组、模型组、自然恢复组、假针刺穴位组(针刺非经非络穴位组)、针刺天枢穴治疗组、针刺足叁里穴治疗组、针刺足叁里+天枢穴联合治疗组。造模成功及治疗结束后,采用颈椎脱臼法处死大鼠,打开腹腔切取小肠的近幽门端用于实验。本实验研究分为以下叁部分:第一部分、通过观察一般行为学变化、监测体重、测定尿d-木糖排泄率、大体解剖观察、测定胃排空率、测定小肠推进率、病理学he染色观察、透射电镜超微结构检测、免疫荧光标记激光扫描共聚焦显微镜检测等方法来观察脾气虚证大鼠小肠肠神经-icc-平滑肌网络的形态学变化和针刺足叁里、天枢穴的修复作用。第二部分、通过免疫荧光双重标记激光扫描共聚焦显微镜检测的方法来观察脾气虚证大鼠小肠肠神经-icc之间的信号传导通路的损伤和针刺足叁里、天枢穴的修复作用。第叁部分、通过免疫组织化学、westernblotting、qpcr等方法来观察脾气虚证大鼠小肠icc-平滑肌之间的信号传导通路的损伤和针刺足叁里、天枢穴的修复作用。通过叁部分实验来探索脾气虚证所导致的胃肠道运动功能障碍的实质和针刺足叁里、天枢穴治疗脾气虚证的作用机制。结果:1.与正常对照组相比,脾气虚证模型组大鼠的一般行为学表现明显变差,大体解剖肉眼观察小肠蠕动明显缓慢,小肠组织he病理学表现小肠组织结构明显破坏,icc的超微结构遭到严重破坏,体重增长明显缓慢,尿d-木糖排泄率、胃排空率、小肠推进率均明显降低,肠神经系统的pgp9.5神经纤维、ach神经纤维、sp神经纤维、vip神经纤维、no神经纤维、icc、smc、ens-icc-smc网络的数量明显减少,结构遭到明显破坏(p<0.05),而模型组、自然恢复组、假针刺组叁组之间相互比较,无明显差异(p>0.05)。与模型组相比,天枢组、足叁里组略有好转(p<0.05),但天枢组、足叁里组两组之间比较,无明显差异(p>0.05)。与天枢组、足叁里组相比,联合治疗组效果明显好转(p<0.05),但仍低于正常对照组(p<0.05)。总体来说,其基本趋势为:模型组≈自然恢复组≈假针刺组<天枢组≈足叁里组<联合组<正常组。2.与正常对照组相比,脾气虚证模型组大鼠小肠肠神经-icc之间的信号传导通路,主要有ach神经纤维的m受体、sp神经纤维的nk受体、no神经纤维的受体-鸟苷酸环化酶(sgc)、vip神经纤维的vpac受体、pka、pkc、cgk/pkg数量明显减少,其信号通路g蛋白偶联受体-camp-pka途径、g蛋白偶联受体-磷脂酶c(plc)-pkc途径、sgc-cgmp-pkg途径明显遭到破坏(p<0.05),而模型组、自然恢复组、假针刺组叁组之间相互比较,无明显差异(p>0.05)。与模型组相比,天枢组、足叁里组略有好转(p<0.05),但天枢组、足叁里组两组之间比较,无明显差异(p>0.05)。与天枢组、足叁里组相比,联合治疗组效果明显好转(p<0.05),但仍低于正常对照组(p<0.05)。总体来说,其基本趋势为:模型组≈自然恢复组≈假针刺组<天枢组≈足叁里组<联合组<正常组。3.与正常对照组相比,脾气虚证模型组大鼠小肠icc-平滑肌之间的信号传导通路,主要是缝隙连接和缝隙连接蛋白43数量明显减少,信号传导途径明显破坏(p<0.05),而模型组、自然恢复组、假针刺组叁组之间相互比较,无明显差异(p>0.05)。与模型组相比,天枢组、足叁里组略有好转(p<0.05),但天枢组、足叁里组两组之间比较,无明显差异(p>0.05)。与天枢组、足叁里组相比,联合治疗组效果明显好转(p<0.05),但仍低于正常对照组(p<0.05)。总体来说,其基本趋势为:模型组≈自然恢复组≈假针刺组<天枢组≈足叁里组<联合组<正常组。结论:1.脾气虚证时,大鼠一般行为学表现明显变差,体重增长缓慢,尿d-木糖排泄率明显降低,大体解剖观察小肠蠕动明显缓慢,胃排空率明显降低,小肠推进率明显降低,小肠病理学he染色观察小肠组织结构明显破坏,icc超微结构明显破坏,小肠的pgp9.5神经纤维、ach神经纤维、sp神经纤维、no神经纤维、vip神经纤维、icc、smc数量明显减少,网络结构明显破坏。针刺足叁里和天枢穴治疗后,可明显修复脾气虚证的损伤,其基本趋势为:模型组≈自然恢复组≈假针刺组<天枢组≈足叁里组<联合组<正常组。2.脾气虚证时,大鼠小肠肠神经-icc之间的信号传导通路,主要有ach神经纤维的m受体、sp神经纤维的nk受体、no神经纤维的受体-鸟苷酸环化酶(sgc)、vip神经纤维的vpac受体、pka、pkc、cgk/pkg数量明显减少,其信号通路g蛋白偶联受体-camp-pka途径、g蛋白偶联受体-磷脂酶c(plc)-pkc途径、sgc-cgmp-pkg途径明显破坏。针刺足叁里和天枢穴治疗后,可明显修复脾气虚证的损伤,其基本趋势为:模型组≈自然恢复组≈假针刺组<天枢组≈足叁里组<联合组<正常组。3.脾气虚证时,大鼠小肠ICC-平滑肌之间的信号传导通路-缝隙连接、缝隙连接蛋白43的数量明显减少,信号传导途径明显破坏。针刺足叁里和天枢穴治疗后,可明显修复脾气虚证的损伤,其基本趋势为:模型组≈自然恢复组≈假针刺组<天枢组≈足叁里组<联合组<正常组。
杨烨[10]2008年在《先天性巨结肠CX43和Cajal间质细胞的研究》文中认为实验背景:先天性巨结肠(Hirschsprung’s disease,HD)是以结肠远端或直肠内缺失神经节细胞为特征的胃肠动力性疾病,其病变肠段缺乏推进式运动,从而引起梗阻症状,是新生儿期低位肠梗阻常见原因之一。病因尚未阐明,目前大多认为系遗传及环境多种因素综合作用、共同调控的结果[1]。Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)广泛分布于消化道,是胃肠慢波活动的起搏细胞及其基本电节律的主要传播细胞,并参与胃肠道神经信息的传递[2]。近年研究表明,ICC与众多胃肠道疾病关系密切,其分布异常、数目减少可能是这些疾病发病的重要病理生理机制之一。缝隙连接(gap junction,GJ)是相邻两个细胞之间的连接通道排列而成的一种特殊膜结构,相邻细胞通过缝隙连接进行信息、能量和物质交换,参与细胞间物质、电信号的传递。其中连接蛋白43(Connexin43,Cx43)是人类主要细胞缝隙连接蛋白,其表达异常与多种疾病发生有关[3]。实验目的观察缝隙连接蛋白43(Connexin 43,Cx43)及Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)在先天性巨结肠(Hirschsprung’s Disease,HD)肠壁中的分布,探讨Cx43和ICC与先天性巨结肠症发病的关系。实验方法运用免疫组织化学方法观察42例经病理诊断为先天性巨结肠的肠壁标本内各层之间Cx43蛋白和ICC的分布情况,其中男33例,女9例(年龄2月—10岁),实验标本全部为散发病例,全部取材经组织病理学检测符合HD诊断,包括常见型30例,短段型12例,并取5例肠套迭患儿(30天—8岁,男4例,女1例)作为对照组。实验结果HD狭窄段(无神经节细胞肠段)肠壁肌层内Cx43和ICC表达缺失,各层中几乎未见Cx43表达和ICC分布,与HD扩张段(有神经节细胞肠段)及正常对照组之间的差异有统计学意义(P<0.01)。HD移行段肠壁Cx43和ICC有中等强度表达,与扩张段、狭窄段之间有明显差异(P<0.01)。HD扩张段肠壁Cx43和ICC呈强阳性分布,粘膜下层和纵肌层未见或少见Cx43表达。HD扩张段和正常对照组肠壁内Cx43和ICC表达无显着性差异(P>0.05)。结论Cx43表达缺失或减少、缝隙连接结构的破坏及ICC结构、分布异常,导致细胞间物质、电信号的传递障碍,可能是先天性巨结肠发病的原因之一。
参考文献：
[1]. 先天性巨结肠Cajal间质细胞的研究[D]. 刘谦. 天津医科大学. 2002
[2]. 先天性巨结肠Cajal间质细胞的研究[J]. 刘谦, 胡晓丽, 谷继卿. 中华小儿外科杂志. 2003
[3]. Connexin43与Cajal间质细胞在先天性巨结肠结肠壁的分布的研究[D]. 何智丽. 郑州大学. 2009
[4]. Cajal间质细胞在胆囊结石形成中的作用以及保胆取石术方法学研究[D]. 谭宇彦. 东南大学. 2015
[5]. Cajal肠间质细胞、nNOS神经与先天性巨结肠及术后小肠结肠炎的关系[D]. 何丹. 南昌大学. 2008
[6]. Cajal间质细胞、神经节细胞在先天性巨结肠分布的免疫组化研究[D]. 王加勇. 山东大学. 2006
[7]. 先天性巨结肠和巨结肠同源病中c-kit～+间质细胞的分布及突触素表达的研究[D]. 王霞. 华中科技大学. 2006
[8]. Cajal间质细胞与先天性巨结肠病的相关性研究[D]. 王合锋. 山东大学. 2009
[9]. 脾气虚证大鼠小肠肠神经-Cajal间质细胞-平滑肌网络损伤和针刺足叁里、天枢穴修复作用的实验研究[D]. 彭洪皓. 大连医科大学. 2017
[10]. 先天性巨结肠CX43和Cajal间质细胞的研究[D]. 杨烨. 第四军医大学. 2008