李翔[1]2002年在《重组人干扰素-γ生产工艺的重大改进》文中进行了进一步梳理直径为500mm的生产型色谱饼是在短柱理论的基础上合理设计制造的。为了证明色谱饼的分离效果，用相同柱体积的色谱柱和它进行了比较。此外，在论文中用重组人干扰素-γ(rhIFN-γ)复性及同时纯化新工艺，在得到纯度及比活均符合要求的前提条件下，与传统的先稀释复性再纯化的工艺进行了比较，无论从两种工艺的质量回收率，活性回收率以及产品纯度方面，还是从生产周期及成本上进行了上比较，结果表明新工艺优于传统工艺。本文包括叁部分： 1．短柱原理 对于生物大分子而言，其保留主要是由流动相中置换剂的浓度决定的，柱长对生物大分子的分离几乎没有影响。由于在色谱分离中分离度会随色谱填料颗粒直径的减小而增大，所以可以用色谱饼装填平均粒径为5μm的填料以用于制备分离。用小颗粒填料装填的色谱饼在高流速下其反压仍然很低，可以在色谱饼的分离纯化中使用较高流速以缩短生产周期，降低成本。本章从理论上推导并计算出在一定色谱条件下分离生物大分子的最短柱长，同时通过实验验证，为制备型色谱饼的设计和制造奠定了理论基础。 2．50×500mmI.D.色谱饼的设计与制造 为了达到生产要求，设计了50×500mmI.D.的色谱饼及其支架。在设计中对生产型色谱饼的设计理论基础，外壳材料选择，密封，流动相均匀分布问题及其总体结构进行了研究。考虑到小颗粒填料通过径向匀浆装柱法装填色谱饼时，是在高压下操作的，所以应认真选择色谱饼的材料和外壳厚度，以适应实际操作的需要。通过理论计算，对色谱饼的结构和不锈钢外壳的厚度进行了优化设计。 3．重组人干扰素-γ复性及同时纯化新工艺 传统的对rhIFN-γ复性及纯化工艺是先将rhIFN-γ的7.0mol/L盐酸胍抽提液稀释复性，再将复性后的rhIFN-γ经多步纯化。只要包涵体中干扰素的纯度足够高，按文献方法用离子交换色谱，金属离子亲合色谱和排阻色谱三步分离纯化后，就能得到纯度95％以上的产品。然而，我们的结果表明经过20个小时以上的复性和纯化，仅仅得到纯度为90％的rhIFN-γ，这是由于包涵体中rhIFN-γ的纯度只有30％左右。而采用新工艺，可将的盐酸肌提取液直接进到装填疏水填料的色谱饼上，在一定色谱条件下洗脱，就可在3小时内一步将rhIFN－Y复性及同时纯化，并且纯度可达到 950，比活达 8．9 xlo勺．U．／mg，再经除盐后其比活为 5．lx10勺．U．／mg，纯度可达到95％以上，其活性口收率是传统工艺的 1．7倍。此外，新工艺还具有周期短，操作步骤简单等优点。尽管两种工艺所用色谱柱的成本相差不大，但新工艺每年的产量远远高于传统工艺。在新工艺中所需色谱仪少，这又可使药用蛋白的生产成本大大降低。
刘鸿丽[2]2005年在《按大肠杆菌偏爱密码子化学合成人干扰素α-2b 基因在大肠杆菌中高效表达的研究》文中研究指明利用聚合酶链式反应将质粒pUC19/rhIFN α-2b上的化学合成人干扰素α-2b(rhIFN α-2b)基因cDNA扩增并重组至载体pBV220上,构建重组质粒pBV220/rhIFN α-2b,之后转化大肠杆菌DH5 α。经筛选,检测,测序正确后通过温度诱导表达重组人干扰素α-2b,通过SDS-PAGE电泳观察到了特异带,经AlphaImager V5.1软件分析化学合成人干扰素α-2b基因表达量最大时表达的人干扰素α-2b可占到菌体总蛋白的36%。Western Blotting检测可见与IFN α抗体特异性结合的条带,并且化学合成的人干扰素α-2b基因的表达量是天然人干扰素α-2b基因的表达量的约123.5倍。 通过设计实验对不同的表达温度条件及使用不同的培养基对人干扰素α-2b蛋白表达的影响作了比较。 研究不同的表达温度对人干扰素α-2b蛋白表达的影响时发现利用LB培养基培养,菌体在35℃培养到OD_(600)约0.4时转移到30℃培养50min后立即升温到42℃诱导表达,表达量最高,可占到菌体总蛋白的约35%。 研究使用不同的培养基培养对人干扰素α-2b蛋白表达的影响时发现培养及诱导表达温度相同时,即经30℃培养,42℃诱导表达,使用培养基成分为1%
饶春明[3]2016年在《我国重组药物质量控制技术体系的建立和应用研究》文中研究表明为确保生物技术药物安全和有效,国家食品药品监督管理总局发布了一系列法规和指南,中国食品药品检定研究院建立了有效的重组药物质量控制技术体系。笔者简要回顾生物技术制药领域重要发展阶段和我国重组药物研究开发情况,详细介绍我国30年来重组药物质量控制技术体系的建立和应用情况,内容包括:质量标准研究依据及法规要求,《中国药典》叁部重组药物质量标准以及新版药典对重组药物质量控制的相关要求;1986年以来国家科技课题对中检院生物技术药质量控制技术体系的支持以及相关重组药物质量标准及其各类检定方法如生物学活性测定、蛋白含量测定、理化分析与蛋白结构鉴定、纯度与杂质测定等方法的建立与应用情况;生物学活性测定和含量测定国家标准品的研究建立以及用于肽图分析和等电点测定用的重组药物理化对照品质量标准建立和鉴定;2001年以来由重组药物室完成的包括注册检验、进口检验、抽验检验、委托检验、合同检验等各类生物技术药检验共计5 920批次检验报告结果分析。
高永贵[4]2002年在《溶菌酶和重组人干扰素-γ包涵体体外折叠复性的研究》文中研究指明迄今为止，人们对确信存在的第二遗传密码——蛋白质折迭密码还知之甚少。如何对包涵体蛋白进行高浓度、高收率的复性以获得活性产品是人们经常面临的一个难题，现已成为生物工程产业化的瓶颈之一。为此，本文对模型蛋白溶菌酶和基因工程药物人干扰素—γ包涵体蛋白的体外折叠复性进行了研究，以期促进这一问题的早日解决。 首先以溶菌酶为模型蛋白，通过研究还原剂二硫苏糖醇(DTT)对其变复性过程中自由巯基和复性的影响，结果发现若蛋白质浓度不超过40 mg／mL，变性液中DTT最适浓度为30mM，这样直接稀释复性时无需脱除DTT，简化了后续的复性过程。溶菌酶的变性程度对复性效果有重要影响，因此研究了溶菌酶合适的变性条件，达到了提高复性收率的目的。 稀释复性法是研究其他方法的基础。通过对高浓度溶菌酶的直接稀释复性法的研究，发现最适GSH浓度为3～6mM，GSH：GSSG则为2～5，此外还需添加3～4M脲。同时在此范围内，合适脲浓度随蛋白质浓度增加略有增大。与一步稀释复性法相比，分步流加变性溶菌酶的复性操作不仅能够获得较高的复性终浓度，而且复性收率提高10％～15％，且降低了脲浓度。然后着重探讨了体积排阻层析复性溶菌酶的条件，包括柱高、GSSG与GSG的量及比例、脲浓度、流速、上样量(上样方式和上样体积)以及蛋白质浓度。首次探讨了体积排阻层析复性方法的连续上样操作，并与单次上样操作进行比较，结果两者的活性收率没有差异，但连续操作提高功效约25％，而且节约了复性缓冲液。 在提出变性蛋白质体外复性过程的动力学模型和模型方程求解的基础上，采用C~(++)程序对模型方程与溶菌酶稀释复性的实验数据进行了拟合，拟合系数R基本上在0.98～0.99之间，表明动力学模型能够很好地描述溶菌酶的体外复性过程。复性液中添加脲后使得速率常数K_2和K_3值减小，复性时间延长，但却增加了K_2／K_3，说明脲对聚集反应具有更强的作用，这正是适量脲促进溶菌酶复性的机理。根据拟合出的脲浓度与速率常数K_2和K_3的数学表达式，并结合模型方程，首次探讨了如何从理论上对折迭复性的收率进行预测以及对复性条件进行优化，特别是根据蛋白质浓度而选取最适脲浓度，从而可为复性方法和工业复性过程的设计提供重要的理论指导。 采用单因素和正交试验相结合的方法，对重组人IFN-γ包涵体的洗涤纯化进行了研究，最终使IFN-γ包涵体纯度达到80％以上，目标蛋白仅损失约15％。浙江大学博士学位论文 摘要然后考察了体积排阻层析技术复性IFN－Y包涵体，结果表明该技术不仅具有促进变性 IFN－Y包涵体的体外再折迭，而且对目标蛋白具有纯化作用。在实验室建立IFN－Y活性测定的基础上，对体积排阻层析复性IFN－Y包涵体的方法进行了研究，并获得了比活为 6．09 gi 06 IU／mg，浓度为 0．24 mg／mL的 IFN－v样品，方法的收率为82．1％。最后提出从基因工程菌pBV220IFN1DH5a生产活性IFN1的工艺。 在实验室制备新型小分于伴侣Mini－GroEL的基础上，研究了游离小分子伴侣协助正N－Y包涵体的再折迭。根据小分子伴侣具有 Histidine tag的特点，首次设计了Ni－NTA亲和固定化小分于伴侣柱复性正N－Y包涵体的实验装置。研究结果表明，该装置不仅可以避免变性剂对小分子伴侣及固定化结合损害，而且连续重复使用4次，再折迭IFN－Y的活性大小没有明显变化。使用该装置复性丁N－Y包涵体，一次进样0．98mg变性IFN－Y包涵体，经过固定化小分子伴侣柱后可得到活性达 6．4X 10勺U／mg、浓度为 0．14mg／mL的 IFN－Y样品，操作非常方便。
李柳萍, 杨胥微, 王妍[5]2011年在《干扰素(Ⅰ型α、β,Ⅱ型γ)的分子结构和生物活性的对应关系及其临床应用》文中指出干扰素是由干扰素诱生剂诱导生物细胞后所产生的一类高活性多功能的糖蛋白,自发现后一直处于细胞因子基础和临床研究的前沿。本文通过分析Ⅰ型干扰素α、β和Ⅱ型干扰素γ各自的分子结构,来综述对应的亚型的干扰素的生物活性和特点,同时对其临床应用尤其是最近开发的新的适应症进行了介绍和展望。
翁红雷, 蔡卫民, 汪国运, 陈峰, 刘荣华[6]1999年在《γ-干扰素抗肝纤维化实验研究》文中指出目的观察重组人γ－干扰素（IFN－γ）治疗大鼠肝纤维化疗效。右法用二甲基亚硝胺（DMN）腹腔注射诱导大鼠肝纤维化模型，染毒开始及染毒3周后分别用IFN－γ须防和治疗肝纤维化，并与正常对照组和染毒对照组相比较，观察各组血清透明质酸（HA）、肝组织羟脯氨酸（Hyp）、病理肝纤维化程度分期及α-平滑肌肌动蛋白（α－SMA）变化。结果IFN-γ预防和治疗组肝纤维化程度明显轻于染毒对照组，α－SMA阳性细胞表达较染毒对照组明显减少，肝Hyp、血清HA水平较染毒对照组亦有显着降低。IFN－γ台疗组和IFN-γ预防组之间各项指标无显著差异。结论IFN-γ对DMN所致大鼠肝纤维化有较好疗效。
王永亮[7]2009年在《γ-干扰素对慢性乙型肝炎患者肝功能和肝纤维化指标的影响》文中研究说明慢性乙型肝炎是肝硬化的主要病因,肝纤维化是慢性乙型肝炎向肝硬化发展的必经病理过程。重组人γ-干扰素(γ-rhIFN)目前已知有确切抗肝纤维化作用,现已被较多的体外实验与动物实验研究证实为一种较好的抗肝纤维化药物。本研究通过观察γ-干扰素对慢性乙型肝炎患者血浆肝纤维化指标透明
朱仲丽[8]2012年在《人外周血淋巴细胞亚群抗肿瘤效应的研究》文中研究指明目的对人外周血淋巴细胞各亚群杀伤肿瘤细胞效应进行比较，寻找具有高效杀伤肿瘤细胞能力的细胞亚群，并探索体外优势扩增该群细胞的方法，同时对体外扩增的该细胞亚群的抗肿瘤效应进行分析，从而建立肿瘤细胞治疗的新方法。方法采集健康志愿者的外周血，标记人淋巴细胞谱系标志CD3、CD56、CD8、CD4等对各样本淋巴细胞亚群进行分析和分选。根据自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)细胞和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxiclymphocyte，CTL)细胞在肿瘤免疫中的作用，本课题关注的淋巴细胞亚群包括CD3~-CD56~+CD8~+细胞、CD3~-CD56~+CD8-细胞、CD3~+CD56~+细胞、CD3~+CD56-CD8~+细胞以及CD3~+CD56-CD8bri细胞。分选的淋巴细胞亚群与8种不同个体、不同组织器官来源的人肿瘤细胞系进行体外共培养实验。通过各淋巴细胞亚群与各肿瘤细胞系的共培养实验体系，寻找到具备高效广谱抗肿瘤能力的淋巴细胞亚群，并借助流式细胞仪对其进行了表型和细胞因子分泌谱的检测。利用现有基础研究成果，通过体外添加白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)、同种异体树突状细胞等方式，建立体外扩增该细胞亚群的方法学。扩增后细胞经体外精细亚群分选后培养实验，确定其是否来自于体内原有细胞亚群。最后通过体内和体外抗肿瘤实验，确证体外扩增的该细胞亚群能否保持原有的抗肿瘤效应。结果对人外周血各淋巴亚群体外杀伤肿瘤细胞效应比较的结果表明，每个样本中CD8~+CD56~+细胞对60%以上肿瘤细胞系的杀伤效率最高。流式细胞仪检测结果表明，CD8~+CD56~+细胞活化后可表达CD25和CD69，不表达CD107a，并分泌IL-2、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)和干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)等细胞因子。体外精细亚群分选后培养，表明体外扩增的CD8~+CD56~+细胞仍然来源于原有CD8~+CD56~+细胞亚群。该亚群可通过添加IL-2和同种异体树突状细胞进行体外活化和扩增，且扩增后该亚群对肿瘤细胞系的杀伤能力能够继续保持。体内抗肿瘤实验表明，扩增后CD8~+CD56~+细胞能够有效抑制HepG2肿瘤细胞在裸鼠体内的生长。结论人外周血各淋巴亚群中CD8~+CD56~+细胞杀伤肿瘤效应最强，杀伤肿瘤谱最广。CD8~+CD56~+细胞活化后表达T细胞活化相关标志，分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ等细胞因子，但并不表达CD107a，提示其抗肿瘤效应可能通过诱导靶细胞凋亡，而非颗粒酶释放途径。本课题初步建立了CD8~+CD56~+细胞体外活化扩增的方法。通过体外添加同种异体树突状细胞和白介素2，能够显着提高CD8~+CD56~+细胞的扩增能力，并证明扩增后的CD8~+CD56~+细胞来源于原有的CD8~+CD56~+细胞，并能够继续保持其原有高效抗肿瘤能力。
周晔[9]2014年在《EpCAM特异性免疫效应细胞对EpCAM~(high)腺癌细胞的体外杀伤实验研究》文中研究表明目的：研究体外诱导生成的EpCAM抗原特异性免疫效应细胞对EpCAMhigh腺癌细胞的体外杀伤效率。比较EpCAM抗原特异性免疫效应细胞及EpCAMhigh腺癌细胞全抗原特异性免疫效应细胞对EpCAMhigh腺癌细胞的杀伤效率，并比较EpCAM抗原特异性免疫效应细胞对EpCAMhigh腺癌细胞及EpCAMlow腺癌细胞杀伤效率。方法：体外培养多种腺癌细胞株，流式法检测各种细胞株表面EpCAM的表达量，分别选择EpCAM高表达的（EpCAMhigh）LS174-T结肠腺癌细胞及EpCAM低表达（EpCAMlow）的PaCa-2胰腺癌细胞作为靶细胞。采集健康成人外周血，经梯度密度离心法收集单个核细胞（PBMCs），贴壁法分离淋巴细胞及imDCs。体外诱导淋巴细胞中T细胞转化为CIK细胞并扩增[2]。以LS174-T细胞裂解物负载imDCs促进其成熟，生成LS174-T腺癌细胞裂解物-mDCs（LS-mDCs），LS-mDCs与自体CIK细胞进行体外共培养，向CIK细胞提呈LS174-T肿瘤全抗原信息，部分CIK细胞转化为具有LS174-T全抗原特异性杀伤活性的CTL，从而制备LS174-T腺癌细胞全抗原特异性DC-CIK-CTL效应细胞（LS-effector）。相似的方法，以纯化EpCAM多肽抗原负载imDCs促进其成熟，生成EpCAM-mDC（sEp-mDCs），Ep-mDCs与自体CIK细胞体外共培养，向CIK细胞提呈EpCAM抗原信息，部分CIK转化为具有EpCAM特异性杀伤活性的CTL，从而制备成纯化EpCAM抗原特异性DC-CIK-CTL效应细胞（Ep-effector）。流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）分别检测imDCs、LS-mDCs及Ep-mDCs表面CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表达量，对其差异进行统计学分析。设单纯CIK组、LS-effector组及Ep-effector组，流式法分别检测day0、day7、day14（d0、d7、d14）单纯CIK组中CD3+CD8+T细胞及CD3+CD56+细胞比例变化，LS-effector组及Ep-effector组中CD3+CD8+T细胞及CD3+CD4+T细胞比例变化，CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值变化，分别对其差异进行统计学分析。细胞毒试验（CCK-8法）检测不同效靶比时各组效应细胞对EpCAMhigh的LS174-T及EpCAMlow的PaCa-2的杀伤效率，对其差异进行统计学分析。结果：1LS174-T细胞EpCAM表达量为99.95%，PaCa-2细胞EpCAM表达量为6.70%。2LS-mDCs及Ep-mDCs表面CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表达量均较未负载抗原的imDCs明显增多，差异均具有统计学意义（P <0.05），LS-mDCs及Ep-mDCs表面CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表达量无统计学差异（P>0.05）。3体外培养d0、d7、d14后各组效应细胞表型发生变化。d14单纯CIK组中CD3+CD8+T细胞比例为80.47±1.38%，高于d0的CD3+CD8+T细胞比例25.10±0.53%（P <0.05），CD3+CD56+细胞比例为13.37±0.61%，高于d0的CD3+CD56+T细胞比例为5.73±0.68%（P <0.05）。LS-effector组中CD3+CD8+T细胞比例为76.60±2.96%，Ep-effector组中CD3+CD8+T细胞比例为81.80±2.63%，均高于d0的CD3+CD8+T细胞比例为25.10±0.53%（P<0.05，P <0.05），LS-effector组中CD3+CD4+T细胞比例为23.33±1.80%，Ep-effector组中CD3+CD4+T细胞比例为25.77±1.50%，均低于d0的CD3+CD4+T细胞比例为30.07±0.85%（P <0.05，P <0.05）。LS-effector组中CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值为0.30±0.03，Ep-effector组中CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值为0.30±0.01，均低于d0的CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值为1.20±0.02（P <0.05，P <0.05）。4随效靶比（E:T）增高，各组效应细胞的杀伤效率均升高。单纯CIK组对LS174-T的杀伤效率E:T=5:1时为39.59±9.37%，E:T=10:1时为49.48±11.71%，E:T=20:1时为69.39±6.65%，E:T=20:1时单纯CIK组对LS174-T的杀伤效率高于E:T=5:1（P <0.05）。单纯CIK组对PaCa-2的杀伤效率E:T=5:1时为37.68±6.09%，E:T=10:1时为47.10±7.61%，E:T=20:1时为66.33±10.04%。E:T=20:1时单纯CIK组对PaCa-2的杀伤效率高于E:T=5:1（P <0.05）。LS-effector组对LS174-T的杀伤效率E:T=5:1时为53.01±6.91%，E:T=10:1时为66.26±8.64%，E:T=20:1时为74.71±8.36%，E:T=20:1时LS-effector组对LS174-T的杀伤效率高于E:T=5:（1P <0.05）。LS-effector组对PaCa-2的杀伤效率E:T=5:1时为41.99±6.87%，E:T=10:1时为52.48±8.58%，E:T=20:1时为65.56±8.62%，E:T=20:1时LS-effector组对PaCa-2的杀伤效率高于E:T=5:1（P <0.05）。Ep-effector组对LS174-T的杀伤效率E:T=5:1时为63.34±1.85%，E:T=10:1时为71.07±8.48%，E:T=20:1时为93.57±5.68%，E:T=20:1时Ep-effector组对LS174-T的杀伤效率高于E:T=5:1（P <0.05）。Ep-effector组对PaCa-2的杀伤效率E:T=5:1时为43.40±5.65%， E:T=10:1时为59.42±5.67%， E:T=20:1时为78.37±9.63%，E:T=20:1时Ep-effector组对PaCa-2的杀伤效率高于E:T=5:1（P <0.05）。5E:T=20:1时，比较各组效应细胞对LS174-T及PaCa-2杀伤效率的差异。单纯CIK组对LS174-T的杀伤效率为69.39±6.65%，对PaCa-2的杀伤效率为66.33±10.04%，两者比较无统计学差异（P>0.05），LS-effector组对LS174-T的杀伤效率为74.71±8.36%，对PaCa-2的杀伤效率为65.56±8.62%比较，两者比较无统计学差异（P>0.05）。Ep-effector组对LS174-T的杀伤效率为93.57±5.68%，高于对PaCa-2的杀伤效率78.37±9.63%（P<0.05）。6E:T=20:1时，比较各效应细胞组间对LS174-T及PaCa-2杀伤效率的差异。单纯CIK组对LS174-T的杀伤效率为69.39±6.65%，LS-effector组对LS174-T的杀伤效率为74.71±8.36%，Ep-effector组对LS174-T的杀伤效率为93.57±5.68%，组间整体杀伤效率具有统计学差异（P <0.05），Ep-effector组高于LS-effector组（P <0.05），Ep-effector组高于单纯CIK组（P <0.05），LS-effector组与单纯CIK组无统计学差异（P>0.05）。单纯CIK组对PaCa-2的杀伤效率为66.33±10.04%，LS-effector组对PaCa-2的杀伤效率为65.56±8.62%，Ep-effector组对PaCa-2的杀伤效率为78.37±9.63%，两两组间比较无统计学差异（P>0.05）。结论：1EpCAM抗原表达于多种腺癌细胞表面，但表达量高低不等，在LS174-T细胞中的表达量高达99.95%，EpCAM可能成为LS174-T腺癌细胞的免疫治疗靶点。2EpCAM抗原及LS174-T细胞裂解物负载imDCs均能够促其成熟，Ep-mDCs与LS-mDCs均具有抗原提呈能力，分别将EpCAM抗原信息及LS174-T细胞全抗原信息提呈给自体CIK细胞，分别促使其向具有EpCAM特异性及LS174-T细胞全抗原特异性杀伤功能的CTL细胞转化。3PBMCs中的T淋巴细胞在体外培养条件下能够诱导生成具有免疫杀伤活性的CIK细胞，LS-mDCs及Ep-mDCs均能够激活自体CIK细胞产生具有高效免疫杀伤功能的LS-effector及Ep-effector。4单纯CIK、LS-effector及Ep-effector对LS174-T细胞均具有高效杀伤活性，随E:T比值升高，各组杀伤效率均升高，Ep-effector组杀伤效率高于LS-effector组及单纯CIK组。单纯CIK组对LS174-T及PaCa-2的杀伤效率相同，Ep-effector对LS174-T的杀伤效率高于对PaCa-2的杀伤效率，表明Ep-effector对EpCAM具有更高的特异性杀伤活性。
参考文献：
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