刘文华[1]2001年在《中药黄芪、葛根对牛视网膜微血管周细胞增殖的影响》文中认为目的：探讨中药黄芪、葛根对高糖下牛视网膜微血管周细胞增殖的影响 方法：以新鲜牛眼为材料，分离并培养周细胞；采用细胞计数法及噻唑蓝比色法，研究不同浓度黄芪注射液(1、5、10、20、40、60、120mg/ml)与葛根素(1、5、10、20、40、50mg/ml)对周细胞增殖的影响。 结果：高浓度葡萄糖(40mmol/l)培养液中加入各浓度黄芪注射液培养周细胞24小时，浓度为10、20、40、60、120mg/ml时对周细胞的增殖有促进作用(p<0.01)，其中浓度为10mg/ml时对周细胞增殖的促进作用最大；加入各浓度葛根素培养周细胞24小时，浓度为1、5、10mg/ml时对周细胞的增殖无明显抑制或促进作用，浓度为20、40、50mg/ml时周细胞的增殖与对照组比较有显着性差异(P<0.01)。 结论：黄芪注射液可促进高糖下视网膜微血管周细胞的增殖，低浓度葛根素对周细胞的增殖无明显抑制或促进作用，高浓度葛根素可抑制周细胞的增殖。
陶铮[2]2016年在《芪灯明目胶囊有效成分抗血管生成作用及其机制研究》文中研究说明糖尿病性视网膜病变(DR)作为糖尿病全身微血管并发症在眼部较早呈现的表现,随着病程的发展可导致严重的视力损害,甚至在后期因眼底血管增殖性病变的出现而致盲,是现在医学领域亟待解决的四大致盲性眼病难题之一。本病的研究近年来是医学界的研究热点,但由于发病机制复杂,目前的治疗和预防手段均难以达到理想效果,目前尚无有效药物治疗品种,本研究开展的中药防治DR的研究可能在治疗DR形成突破,在糖尿病及其并发症防治方面取得重要的进展,可以在糖尿病性视网膜病变防治方面形成突破,甚至拓展国际大市场。本课题所在团队长期以祖国医学理论为指导,针对糖尿病患者发生眼部并发症过程里呈现出的气阴亏虚、目络瘀滞的基本中医病机,开展中药有效部位复方制剂治疗糖尿病性视网膜病变的开发研究。经过课题组前期研究已经明确芪灯明目胶囊是有效治疗本病的药物,能减少糖尿病性视网膜病变引起的盲和视力损害,本研究通过离体细胞实验、VEGF转基因斑马鱼、EGFR和p-STAT3信号通路蛋白表达叁个层面针对芪灯明目胶囊有效成分抑制糖尿病视网膜新生血管的作用机制进行了实验研究,希望研究的结果能为糖尿病专科临床治疗指导提供有力的支撑,也能助力发挥中医治疗糖尿病并发症的优势和特点。第一部分：芪灯明目胶囊有效成分抑制体外新生血管实验目的：新生血管生成依赖于血管内皮细胞和细胞外基质的相互作用,因此血管内皮细胞已作为目前研究对抗血管生成治疗的独特靶细胞。本研究探讨芪灯明目胶囊有效成分对体外培养的血管内皮细胞增殖和迁移的抑制作用,为证明芪灯明目胶囊有效成分防治糖尿病视网膜新生血管的确切有效性提供实验依据。方法：观察芪灯胶囊与其3个单体化合物在细胞水平、组织水平对抑制微血管生成活性的影响。实验内容包括3个成分分别考察在多浓度剂量对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、脐内皮迁移、鸡胚尿囊膜微血管生成、大鼠动脉环微血管生成的影响。结果：实验结果显示各项实验中对照组细胞生长良好,用药组野黄芩素、葛根素与黄芪甲苷均在不同实验中显示出了明显的抑制内皮细胞生长的作用,并呈现剂量依赖性,总体评价野黄芩素和葛根素在抑制脐内皮细胞增殖的环节中作用较强,黄芪甲苷的作用较弱,在相同浓度情况下有野黄芩素>葛根素>黄芪甲苷趋势。第二部分：芪灯明目胶囊有效成分抑制VEGF转基因斑马鱼血管生成实验目的：VEGF是一种多功能的细胞因子,其主要作用是促进血管内皮细胞增殖和增加血管通透性,是各种生理、病理的血管生成的中心调控因素。前期实验证明芪灯明目胶囊有效成分具有明显的抑制内皮细胞生长的作用,在此基础上,创新性的选择‘'VEGF转基因斑马鱼”作为实验模型进行抑制血管生成实验,为进一步证明芪灯明目胶囊有效成分防治糖尿病视网膜新生血管的确切有效通路探索提供实验依据。方法：实验所用的斑马鱼为血管荧光转基因斑马鱼(VEGFR2:GFP)。斑马鱼的养殖和培育参照Westerfield[1]的方法。施药鱼胚胎于24hpf后取出,置于1μg·ml-1链霉蛋白酶溶液中数分钟后,用吸管吹去胚胎卵膜,将脱膜胚胎加入96孔板中,每孔一只；将试验药物加入96孔板中,分别设置对照组,葛根素组,黄芪甲苷组,野黄芩素组,每组分设3个浓度组,每个浓度各10个胚胎；加药后吸出鱼体放于载玻片上,在荧光显微镜下观察记录斑马鱼异常和节间血管并拍照,对体节间血管计数,计算抑制率。结果：表现出芪灯明目胶囊能明显抑制斑马鱼模型体节间血管生成。对照组中斑马鱼体节间血管生成良好,无缺失,无断裂,荧光强。作用后的斑马鱼,体节间血管缺失、断裂明显,血管数减少,荧光强度减弱。荧光血管计数显示,125μg·ml-1葛根素对斑马鱼体节间血管的抑制率为16.93%,具有显着性差异(p<0.05)；血管荧光计数结果显示葛根素组,野黄芩素125μg·ml-1组与150μg·ml-1组与对照组比较具有显着性差异(p<0.01)。从本实验结果来看,在血管计数方面,葛根素125μg·ml-1有明显抑制效果；但在荧光计数方面,野黄芩素有明显的效果,说明葛根素与野黄芩素在抑制作用靶点方面有不同。第叁部分：芪灯明目胶囊有效成分抑制新生血管的机制研究目的：在第二部分斑马鱼实验中,明确了芪灯明目胶囊有效成分抑制新生血管生成通过VEGF通路有效,在此基础上为了更深入研究其起效机制设计本实验,选用前期效果最明显的芪灯明目胶囊两个成分“野黄芩素”与“葛根素”对多个血管生成关键信号p- 38、AKT、EGFR、STAT3、EKR1/2的磷酸化水平以及mmp-9蛋白表达的影响,探寻其血管生成关键信号通路蛋白表达的影响,探讨其分子机制,以进一步阐明芪灯明目胶囊有效成分的作用机制。方法：用培养皿做细胞培养,分别建立对照组,阿法替尼高中低3组(0.01μm、0.1μm、1μm)、.野黄芩素高中低3组(1μm、10μm、100μm)、葛根素(1μm、10μm、100μm)高中低3组,施药后9h结束实验,细胞总蛋白提取后使用Western Blot检测蛋白表达。结果：实验结果显示各目标蛋白在正常细胞内的磷酸化水平较低,经EGF刺激后,Akt、EGFR、ERK1/2、p-38、STAT3等蛋白的磷酸化水平显着升高(m组),在afatinib处理后,各组蛋白的磷酸化水平明显降低,并呈现明显剂量依赖；与对照组比较,野黄芩素与葛根素对STAT3的磷酸化抑制较为明显,具有一定浓度依赖性；可显着抑制EGFR蛋白的磷酸化,但对AKT、EKRR1/2、p-38的磷酸化水平无明显影响。结论：1.芪灯明目胶囊胶囊各组成成分在整体动物水平、器官水平和细胞水平确有抑制新生血管生成的作用,其中野黄芩素和葛根素的抑制作用较强。2.芪灯明目胶囊能明显抑制斑马鱼模型体节间血管生成,在血管计数方面,葛根素有明显抑制效果；但在荧光计数方面,野黄芩素有明显的效果,说明葛根素与野黄芩素在抑制作用靶点方面有不同。3.芪灯明目胶囊胶囊组成成分野黄芩素和葛根素可能是通过对STAT3和EGFR的磷酸化通路影响而产生新生血管抑制的作用,葛根素的作用强于野黄芩素。通过此项研究,有望为临床工作中糖尿病性视网膜病变的防治提供新的药物靶向与线索。
周云丰, 李琳, 葛争艳, 郭宇洁, 金龙[3]2016年在《中医药防治糖尿病视网膜病变周细胞凋亡的研究进展》文中认为糖尿病视网膜病变是糖尿病患者常见的微血管并发症之一,视网膜周细胞凋亡是糖尿病视网膜病变早期的主要病理改变,近年来其机制研究进展明显。中药单味药、有效成分及复方均从多个途径如减轻高糖对视网膜周细胞的损害、抑制糖基化终末产物对周细胞的损伤、抑制视网膜微血管的炎性反应等方面发挥作用,对防治视网膜病变周细胞凋亡有着自身的优势。本文总结了近年来糖尿病视网膜病变周细胞凋亡的分子机制研究现状,并对中药在保护视网膜周细胞方面的作用进行综述,为深入的中药研究和防治糖尿病视网膜周细胞凋亡的创新药物开发提供科学依据。
周云丰[4]2016年在《黄芪甲苷对甲基乙二醛诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用及机制研究》文中指出研究背景糖尿病视网膜病变(DR)是1型糖尿病和2型糖尿病患者常见的微血管并发症之一,是导致成年人失明的主要原因。研究表明,视网膜病变与自由基介导的氧化损伤有关,氧化应激反应可调节细胞的生理功能和生化反应,在细胞增殖分化过程中发挥重要作用。同时视网膜组织在遭受各种有害刺激时,高活性分子如活性氧和活性氮产生过多,超出机体的清除能力,导致氧化还原平衡失调,从而引起细胞凋亡等病理反应。视网膜色素上皮细胞(RPE)处于神经视网膜和富含血管的脉络膜之间,是外血-视网膜屏障的重要组成部分。RPE间和临近的内皮细胞间的紧密连接对于维持视网膜的完整性至关重要,研究证实在DR早期已经发现RPE出现损伤。甲基乙二醛(MGO)是一种活性二羰基化合物,作为糖酵解的中间产物,它是晚期糖基化终末产物的前体。在糖尿病患者中血糖的持续升高,糖酵解增加,MGO大量生成,导致AGEs在RPE基底膜中异常聚集,引发细胞损伤和DR。黄芪甲苷(AS-Ⅳ)是中药黄芪的主要活性成分,具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老、清除氧自由基、改善胰岛素抵抗、促进细胞增殖和抗细胞凋亡等多种药理作用。并且AS-Ⅳ能够降低糖尿病患者的血糖,抑制糖尿病大鼠氧化应激反应的发生,减少AGEs的形成,因此AS-Ⅳ有可能在MGO诱导的RPE细胞氧化损伤中发挥保护作用。实验目的研究AS-Ⅳ对MGO诱导的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)损伤的保护作用,并探讨其分子机制。实验方法用不同浓度的MGO(2、1、0.75和0.5 mmol.L-1)诱导ARPE-19细胞损伤,以CCK-8法检测细胞活力,确定MGO损伤细胞的最佳浓度和时间;以不同浓度的AS-Ⅳ预给药6h,然后加入MGO造模,检测细胞活力,确定AS-Ⅳ保护ARPE-19细胞的最佳浓度。以DCFH-DA为荧光探针检测细胞内ROS的水平,利用试剂盒测定细胞内SOD活力和MDA含量,探究AS-Ⅳ对MGO引起的ARPE-19细胞氧化应激的影响。以Hoechst 33342对细胞核进行染色,利用高内涵成像系统观察细胞核的形态和蓝染情况;对细胞进行Annexin V/PI双染,利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;以JC-1为荧光探针对线粒体膜电位进行检测。Western Blot法检测细胞凋亡的线粒体通路中Bcl-2、Bax和PARP蛋白的表达和PI3K/Akt通路中p-Akt的表达,利用荧光酶标法检测Caspase-9和Caspase-3的活化水平,从而探究AS-Ⅳ保护ARPE-19细胞分子机制。实验结果1、随着MGO浓度的增加,ARPE-19的细胞活力逐渐降低。当MGO孵育16 h,浓度为1 mmol·L-1时细胞活力为60%左右,即选取1 mmol·L-1MGO孵育16 h作为最佳的造模条件;AS-Ⅳ预给药能提高细胞活力,减轻MGO对细胞的损伤,当AS-Ⅳ浓度10μmol·-1时细胞活力提高至最大,与模型组相比有显着性差异。2、ROS染色结果显示,MGO组ROS产生明显增多,荧光强度显着增加,AS-Ⅳ预给药后荧光强度减弱,证明AS-Ⅳ能够减少ROS的产生;并且与MGO组相比,AS-Ⅳ预给药能显着逆转MGO引起的SOD活力降低和MDA水平升高。3、Hoechst 33342染色发现正常组细胞核呈长椭圆状,呈均匀淡蓝着色;MGO组部分细胞核皱缩或破碎,染色不均匀,有致密的亮蓝着色;AS-Ⅳ预给药后细胞核形态明显改善,仅有少数细胞核呈不均匀蓝染。AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测结果显示,MGO能诱导ARPE-19细胞发生凋亡,MGO组细胞凋亡率显着高于对照组,AS-Ⅳ能显着降低MGO诱导的细胞凋亡,起到抗凋亡的作用。4、JC-1染色结果显示,与正常组相比,MGO组红/绿荧光比值显着降低;与MGO组相比,AS-Ⅳ预给药后细胞红/绿荧光比值明显提高,表明AS-Ⅳ预给药能够抑制MGO诱导的线粒体膜电位下降。Western Blot结果显示,与正常组相比,MGO组Bcl-2/Bax比值显着下降,AS-Ⅳ预给药能提高Bcl-2蛋白的表达水平,显着提高Bcl-2/Bax比值;另外,AS-Ⅳ能够抑制具有DNA修复功能的PARP的裂解,并提高Akt的活化水平,发挥促进细胞存活的作用。荧光酶标法结果显示,MGO组细胞Caspase-9和Caspase-3活化程度明显升高,AS-Ⅳ预给药能显着降低Caspase-9和Caspase-3活化水平,起到调节细胞凋亡的作用。研究结论AS-Ⅳ对MGO损伤的ARPE-19有明显的保护作用。AS-Ⅳ能够明显抑制MGO诱导的细胞氧化应激反应,减少ROS的生成和MDA的含量,增加抗氧化酶SOD的水平;AS-Ⅳ能够调节线粒体通路中Bcl-2家族和Caspase家族蛋白的表达发挥抗细胞凋亡的作用;AS-Ⅳ还能够通过提高Akt的磷酸化水平,促进细胞存活。以上这些结果提示AS-Ⅳ可能在防治DR上具有一定的开发潜力,但是还需要进行在体实验进一步验证,另外AS-Ⅳ保护ARPE-19细胞的其他分子机制仍需要深入研究。
陈晨[5]2007年在《糖目宁治疗早期糖尿病视网膜病变的临床及实验研究》文中提出随着糖尿病(diabetes mellitus，DM)发病率的增高，作为其主要及严重并发症的糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)越来越成为威胁人类视功能的疾病，已成为西方首要的致盲性眼病。由于目前关于DR的发病机制未完全阐明，各种治疗方法效果尚不理想，并且疾病发展至后期，治疗费用高，患者痛苦大，治疗效果差。因此如何在相对可逆的疾病早期实现对DR病情的控制或改善，是目前防治DR的重点及热点，具有非常重要的社会意义。本研究是在导师唐由之研究员、高健生研究员学术思想指导下，把中医的理论思维和前沿技术有机结合，对糖目宁治疗早期DR的临床疗效及其分子机制进行研究。该药在临床应用中取得显着疗效，可以明显提高早期DR患者视力，改善早期DR患者的眼底病变，提高DR患者视功能，有效控制病情。在此基础上，我们采用细胞培养技术、流式细胞术、real-time PCR等实验技术及方法，从细胞凋亡率、凋亡因子Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Cytochrome C的表达等方面，多层次研究了糖目宁治疗早期DR的分子机制，取得了有学术价值的研究结果。1理论研究目前中医药防治早期DR的文献很多，但总体的临床辨证用药思路没有突破。导师高健生研究员在总结前人经验的基础上，经过长期大量的临床及实验研究，对DR的辨证用药提出新的见解：①DR的发生是在DM中、后期的阴阳、寒热、虚实的转化过程中渐进发展而成的，一方面我们要用益气养阴法针对性治疗DR患者基本的证候表现，另一方面又要采用温阳化气、水火既济法改善机体阴阳、寒热、虚实交错的证候特点，提高视网膜微循环，改善毛细血管无血管区的血液灌注，抑制新生血管的出现和机化物的形成。②DR眼底出血、水肿、渗出等一系列改变，与心、肝、胆实火引起的出血不同。DR是由于糖代谢紊乱引起的微血管的病变，其病理改变与细胞的退行性改变—细胞凋亡密切相关，而肝胆实火引起的细胞损伤，则为细胞死亡所致的出血渗出，二者病证性质不一样，故不宜采用大队凉血止血药治疗，恐其伤阳、凝滞之弊。③临床治疗过程中，单用黄连素、肉桂控制血糖，对部分病人确实有效，并且简便价廉，但一部分病人发生不良反应。这是因为只对病或对症(高血糖状态)，而非辨证治疗，将二药合并使用，寒热相互发挥优势而又相互制约，去性存用，这也恰恰正是交泰丸连、桂合用的道理，对虚实、寒热互见的复杂证候，尤为对证。实验研究证实：交泰丸能够有效地抑制链脲佐菌素性糖尿病大鼠视网膜血管病变的发生发展，能够有效地抑制内皮细胞的凋亡，减轻新生血管的发生；能够改善STZ性DM大鼠的一般状况，改善实验大鼠血浆纤溶活性，保护胰腺B细胞，增加胰岛素的分泌。④综合考虑早期DR患者全身及眼局部的证候特点，组方糖目宁方防治早期糖尿病视网膜病变，方剂组成：生黄芪、女贞子、益母草、乌梅、黄连、肉桂、密蒙花。2糖目宁治疗早期DR的临床研究采用对照研究的方法，选择符合早期DR诊断标准的患者，将其分治疗组与对照组，分别给予糖目宁及2,5-二羟苯磺酸钙口服3个月，评价治疗前后的视力、眼底病变程度、平均敏感度、OPs波振幅、血液学指标及全身症状情况。结果显示：①糖目宁可明显提高早期DR患者的视力，与治疗前相比存在显着性差异；与对照组相比眼底病变明显减轻；②糖目宁治疗组患者治疗后OPs波振幅提高，较治疗前存在显着性差异；视野平均敏感度提高，较治疗前有显着性差异，对照组无明显变化；③糖目宁治疗组及对照组患者治疗前后糖化血红蛋白、血生化、血液流变学各项指标均无明显变化；④糖目宁治疗组可明显改善早期DR患者乏力、手足心热、腰膝酸软、大便秘结等气阴两虚的症状，对照组无明显变化。3糖目宁治疗早期DR的实验研究通过流式细胞术、real-time PCR技术，检测体外培养的高糖状态下牛视网膜微血管内皮细胞的凋亡率及相关凋亡因子的表达，研究显示：①流式细胞仪检测显示：糖目宁可以明显降低高糖状态下体外培养的牛视网膜微血管内皮细胞的凋亡率；②通过real-time PCR检测显示：糖目宁可以降低高糖状态下体外培养的牛视网膜微血管内皮细胞的Bax、Caspase-3、Caspase-9及Cytochrome C表达，增加Bcl-2的表达。4本研究的创新之处①从病、症、证叁方面的宏观和微观辩证，提出心、肾论治糖尿病视网膜病变，为其辨证用药提供新思路。②方证结合，组方糖目宁治疗早期糖尿病视网膜病变，采用多种客观检查相结合的方法，客观评价治疗效果，并从分子水平探讨其作用机制。
胡凤丽[6]2012年在《参葛颗粒对糖尿病大鼠血清NO、AGEs及视网膜超微结构的影响》文中进行了进一步梳理目的：本课题以糖尿病模型大鼠为研究对象，以中医理论为指导，结合现代医学相关研究及实验技术，通过对糖尿病大鼠视网膜超微结构的观察、眶静脉血清中一氧化氮（NO）和蛋白质非酶糖基化产物（AGEs）含量的检测，探讨参葛颗粒对实验性糖尿病大鼠视网膜病变的影响及作用机理，为参葛颗粒的临床应用提供理论依据。方法：采用四氧嘧啶（ALX）诱发糖尿病大鼠模型。所致的糖尿病大鼠随机分为3组：模型组（MG）、导升明组（DG）、参葛颗粒组（SG），并设正常组（NG）。正常组、模型组、导升明组、参葛颗粒组分别以生理盐水、生理盐水、羟苯磺酸钙、参葛颗粒灌服，每日1次，共计6个月。实验期间每半月测1次血糖、尿糖与体重，在第1、3、6月糖尿病大鼠各组随机挑选2只，处死，采集标本，通过形态学、免疫组化等方法进行如下指标观测：1.血清中NO、AGEs含量的变化，2.电镜下观察糖尿病大鼠视网膜超微结构的改变情况。结果：1.正常组大鼠生存状态良好，模型组大鼠―叁多一少‖现象明显，导升明组、参葛颗粒组大鼠的―叁多一少‖现象较模型组轻。2.正常组大鼠体重增加迅速，模型组体重增加缓慢，导升明组、参葛颗粒组用药后体重较用药前有所增加，以参葛颗粒组增加明显。3.模型组、导升明组、参葛颗粒组血糖、尿糖始终高于正常组（P<0.05），模型组血糖、尿糖最高，参葛颗粒组血糖、尿糖最低。4.模型组、导升明组、参葛颗粒组的眶静脉血清AGEs均值明显高于正常组（P<0.05），模型组AGEs值始终最高，参葛颗粒组AGEs值低于导升明组（P<0.05），各组组间比较均有统计学意义（P<0.05）。5.模型组、导升明组、参葛颗粒组的眶静脉血清NO均值明显低于正常组（P<0.05），模型组NO值始终最低，参葛颗粒组NO值最接近正常组。6.电镜下，正常组：可观察到大鼠视网膜神经细胞、神经原纤维、神经胶原细丝等，神经细胞结构完整，神经原纤维、神经胶原细丝丰富，排列规则。模型组1月、3月、6月随病程的延长，神经细胞凋亡增多，神经原纤维、神经胶质细丝逐渐减少，结构紊乱呈逐渐加重的趋势。运用中药干预治疗的各组大鼠，视网膜超微结构的病变与模型组相比明显改善。结论：采用参葛颗粒干预糖尿病模型大鼠，视网膜超微结构的病变与模型组相比明显改善，能够减慢糖尿病模型大鼠血清中AGEs的堆积，抑制NO氧化损伤，同时具有整体调节功能，减轻其病变程度，减慢病变发展，对早期糖尿病大鼠视网膜病变具有良好的防治作用。
参考文献：
[1]. 中药黄芪、葛根对牛视网膜微血管周细胞增殖的影响[D]. 刘文华. 成都中医药大学. 2001
[2]. 芪灯明目胶囊有效成分抗血管生成作用及其机制研究[D]. 陶铮. 成都中医药大学. 2016
[3]. 中医药防治糖尿病视网膜病变周细胞凋亡的研究进展[J]. 周云丰, 李琳, 葛争艳, 郭宇洁, 金龙. 世界科学技术-中医药现代化. 2016
[4]. 黄芪甲苷对甲基乙二醛诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用及机制研究[D]. 周云丰. 北京协和医学院. 2016
[5]. 糖目宁治疗早期糖尿病视网膜病变的临床及实验研究[D]. 陈晨. 中国中医科学院. 2007
[6]. 参葛颗粒对糖尿病大鼠血清NO、AGEs及视网膜超微结构的影响[D]. 胡凤丽. 河南中医学院. 2012
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