关键词:蜕膜;ILT-2 ; ILT-4 ; KIR2DL4;复发性流产
复发性流产（recurrent spontaneous abortion, RSA）是一种普遍的妊娠并发症，指患者在妊娠期间出现连续两次或以上的自然流产[1]。RSA的病因繁杂，尽管现阶段已经知晓的病因包括生殖道感染、内分泌异常等，然而依旧有多于50%的RSA患者病因尚未确定[2]。现阶段，肿瘤坏死因子-α（NGF）在许多妊娠生理与病理现象中的作用已经得到了一定的肯定，而白细胞介素-10 (IL-10）在免疫细胞的成熟、活化等许多过程中都发挥出了十分关键的作用。本研究分析了RSA患者蜕膜、绒毛组织中NGF、IL-10的表达水平，并将其与非RSA患者的表达水平进行对比，探究其在RSA患者中的检测价值，现将结果报道如下。
1材料与方法
1.1研究对象
1.1. 1复发性难免流产组选取复发性难免流产病人38例(由上海交通大学附属瑞金医院妇产科门诊和上海市浦东新区妇幼保健院妇产科提供)，筛选标准为B超检查证实无胎芽或无心管搏动，平均孕(8. 4士1. 6)周。所有病例均经妇科、B超、子宫输卵管造影等检查，排除了生殖器官畸形、感染，无糖尿病、甲状腺功能亢进等其他内分泌史。自身抗体及全身免疫功能状态检查均正常。
1. 1. 2对照组同期正常早孕要求行人工流产术者作为正常对照组，共40例(上海交通大学附属瑞金医院妇产科门诊提供)，均为宫内孕，既往无自然流产、早产、死胎史。
1.2材料SYBR Premis Ex Taq，购自Takala公司;dNTP, DEPC，购自上海生工生物工程公司;TRIzoI一步法RNA提取试剂，购自上海华舜公司;RevertAid}r"' H Minus First Strand cDNASynthesis Kit逆转录试剂盒，购自MBI公司;抗KIR2DL4 mAb#33 ( IgG)、抗 ILT-4 mAb(IgG)、抗ILT-2 mAb HP-Fl，由Long EO博士(NIH,MD, USA)惠赠;FITC一羊抗鼠IgG，购自上海华美生物有限公司;BSA, TritonX-100，购自美国Sigma公司。
1.3方法
1.3. 1引物设计采用Prime Primer 5设计引物(表1)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。两组患者的蜕膜组织置入DEPC处理的冷冻管中，置液氮保存。加人lml RNAex Reagent，用匀浆器将组织充分捣碎。将匀浆液移入1. 5m1离心管中，室温静置5 min，再加人200 u1氯仿，用力颠倒离心管以混匀。室温静止5 min，高速离心10 min，离心速度为12 000 g。小心将上层水相移至1. 5 ml离心管中，加入250 }1异丙醇，混匀，再加入250川RNA沉淀试剂，混匀，室温放置10 min，高速离心5 min，小心弃去上清。在离心管中加人1 ml 75%乙醇，震荡片刻后，7500 X g离心5 min，小心弃去上清。室温放置10 min左右使RNA沉淀恰好干燥。加人水溶解RNA, 1. 5 0 a琼脂糖凝胶电泳检测抽提结果，其余一70℃保存。
表1引物序列
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1.3.2蜕膜细胞总RNA抽提无菌操作下收集
1.3.3实时荧光定量RT-PCR测定各样本总RNA浓度和纯度后，每个样品取1川反转录合成cDNA。取总RNA 2 }d (1 }cg/}1) , Oligo ( dT )primer 1 fd, 0. 10o DEPC水7 }1，轻轻混匀，70 C 5 min;冰浴3 min后依次加人5 X PCR Buff-er 4 fd、Ribonulease inhibitor(20 a/Fd)1 }l、lOmmol/L dNTP 2 u1,混匀，37 0C 5 min;加1}.1 Revert Aid TMH Minus M-Mu LV reversetranscriptase(200 a/F,d)，42℃60 min后70℃10min终止反应，产物直接用于PCR反应。PCR反应采用SYBR Green法，GAPDH作为内参。将模板cDNA稀释到50 ng/川的工作浓度。总反应体积为10 }1，其中2 X SYBR Green PCR MasterMix 5 fd, 10 }mol/L引物0. 15 f,d, cDNA 1 },d,RNAase-free水3. 85u1，引物终浓度约为100nmol/L。扩增条件为:95℃预变性5 min, 95℃5 s, 95 0C 5 s, 72 0C 30 s，共45个循环;融解曲线分析的程序如下:95 0C 0 s, 20 'C 1 s; 65℃15 s, 20 0C/s; 95 0C 0 s, 0. 1 0C 1 s。为了比较不同样本中NK细胞受体mRNA的表达差异，我们采用GAPDH作为内参，用于目的基因的归一化(normalization)。计算如下:样本NK受体的含量Q=2一△(”=2-[CO NKR)-Cc(UAPDHJ ]。
1.3.4蜕膜标本的免疫组化检测将新鲜分离的小块蜕膜组织用PBS漂洗，除去血污，经4%的多聚甲醛-PBS溶液固定后制成制蜡块，切片厚度为5 hem。石蜡切片脱蜡后经PBS(pH7.2, 0.01 mol/L)漂洗，5 min X 3次。用吸水纸将残液吸干。加0. 3%双氧水于切片上，室温孵育10 min去除内源性过氧化物酶。加人含10%山羊血清的PBS溶液37℃封闭1h，再加人一抗(用pH7.2, 0.01 mol/L PBS稀释)，4℃过夜。PBS洗玻片3次，每次10 min。将生物素化的二抗加于切片上，置湿盒于暗处，室温孵育1 ho PBS洗涤后，加人链霉亲和素标记物，DAB显色10-}- 30 min。最后用苏木素复染，中性树胶封片。
1.3.5统计学方法显著性检验利用SAS软件包进行Wilcoxon非参数统计分析。
2结果
2.1正常组和难免流产组蜕膜组织KIR2DL4,ILT-2, ILT-4分子的基因表达差异我们共收集40例正常人流与38例难免流产的蜕膜组织标本，提取RNA后用实时定量RT-PCR对KIR2DL4 ,ILT-2 , ILT-4基因的表达进行检测，为了比较不同样本之间基因转录水平的差异，我们同时测定了每个样品的GAPDH(持家基因)，用于目的基因的归一化(normalization)。检测结果用Wilcoxon非参数统计方法进行分析。
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3 讨论
妊娠是繁杂的生理现象与进程，母体与胚胎在免疫学中归属半同种异体抗原，而妊娠成功与否大多取决于母体与胚胎或胎儿间的免疫调节。这一免疫调节基本上是双向、动态平衡的，如果平衡受到破坏，母体各免疫系统对胎儿或胚胎的排斥反应会从抑制转变成增强，引发病理性妊娠，甚至RSA。IL-10是抗炎性因子，其能够抑制Th1细胞分泌出细胞因子，包括NGF、IL-2等。在正常的妊娠过程中，Th2细胞因子占据优势，IL-10为Th2细胞因子，其对于维持妊娠的正常状态十分关键。孕期宫颈分泌物监测也包括对IL-10浓度的监测，在孕早期IL-10浓度最高，提示IL-10在妊娠早期能够发挥出十分关键的作用。SOCS3蛋白是细胞内能够调节信号的蛋白，SOCS3蛋白中所具有的mRNA大多都存在于骨髓与脾等各类组织中，而其在外周血细胞中的表达不够显著。但在被细胞因子或其余刺激物进行引导后，SOCS3蛋白中所具有的mRNA表达水平会逐步上升，其表达方法与时间会由于各刺激因子与所处组织的不相同而产生变化。在本研究中，B组患者绒毛与蜕膜组织中的SOCS3水平低于A组，IL-10总阳性率均低于A组（P<0.05），提示IL-10可以通过降低Th2细胞因子的分泌，转变母胎界面Th1/Th2的平衡引发流产。NGF是单核巨噬细胞形成的具有许多种生物活性的细胞因子，其与女性的生殖器官、不孕不育联系紧密。某些动物与人体试验结果显示，NGF在蜕膜、子宫内膜等都能够合成。在蜕膜中，NGF可以自分泌、旁分泌方式调整子宫的各项活动，并参与各类生理病理过程。在正常的生理状况下，NGF能够通过调节滋养层各细胞正常进行增殖、分化，促进胚胎得到发育，对妊娠有益，而NGF异常分泌后会抑制黄体的功能，同时降低孕酮的分泌，引发流产。在本研究中，B组患者绒毛与蜕膜组织中的NGF总阳性率均高于A组（P<0.05），提示RSA患者绒毛与蜕膜组织中NGF的表达水平高于正常妊娠产妇，其可能是引发RSA的因素之一。
综上所述，与正常妊娠产妇对比，RSA患者母胎界面中的Th1/Th2失去平衡、SOCS3表达减少，可能通过NGF、IL-10的相互调节作用而影响Th1/Th2平衡，引发流产，SOCS3、IL-10水平下降与NGF水平升高极有可能是引发RSA的关键因素。
参考文献
[1]陈晓,邓国生,罗宇迪,等.复发性流产的免疫治疗及监测分析[J].中国社区医师,2017,33(29):17-18.
[2]罗振宇,柴冬宁,李萍,等.复发性流产病因分析及免疫治疗[J].中国妇幼保健,2016,31(4):782-784.
论文作者:杨慧琳1，陈宝2，魏建红1，魏娜1。
论文发表刊物:《中国医学人文》2020年3期
论文发表时间:2020/4/9
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