2. 柳州市妇幼保健院医学遗传科，柳州市出生缺陷预防与控制重点实验室，广西 柳州 545001
基金项目: 广西壮族自治区卫生厅科研基金(Z2013608)、柳州市科学研究与技术开发计划项目研究成果资助（2014G020404）
摘要：目的：探索ADRB2基因、IL13基因IL13Rα1基因在哮喘致病过程中的作用。方法：采用病例对照研究，纳入哮喘组儿童101人，无哮喘及其他过敏性疾病对照组117人，采集全部研究对象外周血，提取DNA后，利用SNaPshot技术对ADRB2基因的rs1042713及IL13基因的rs20541、rs1800925和IL13Rα1基因rs2495636等4个位点进行基因分型。结果：哮喘组儿童体内的ADRB2- rs1042713 基因型AA及等位基因A的频率分布均高于对照组，两者比较其差异具有统计学意义（分别为P=0.028及0.008）。ADRB2基因的rs1042713、IL13基因的rs20541和rs1800925、IL13Rα1基因rs2495636等4个SNP位点的交互作用促进了哮喘疾病的发生，其发病危险性分别是对照组的1.55、1.75、1.45、1.57、1.42及1.46倍（P值均<0.001）。结论：ADRB2-rs1042713位点变异增加了哮喘发病的危险性。ADRB2-rs1042713与IL13基因常见的2个基因位点（rs20541、rs1800925）和IL13Rα1基因rs2495636位点有交互作用，表明基因-基因的交互作用显著促进了哮喘的发病。
关键词： 哮喘；细胞因子；基因多态性
哮喘是一种严重危害儿童身体健康的常见慢性呼吸道疾病，多在冬、春季发病，初次发病多在0-5岁。其发病率高，常表现为反复发作的慢性病程，严重影响了患儿的学习、生活及活动，影响儿童青少年的生长发育，也给患儿家庭带来沉重负担。哮喘的发生与发展由环境因素和遗传因素共同作用所致，哮喘的遗传度高达75％[1]。但目前尚未见有在柳州地区对儿童群体进行炎症基因ADRB2、IL13和IL13Rα1基因位点多态性的调查研究。本课题组利用SNaPshot技术对上述3个基因的rs1042713、rs20541、rs1800925、rs2495636等4个多态性位点进行了检测，现报道如下：
1 方法与人群
1.1研究人群 选择在柳州地区出生及居住的婴幼儿及儿童作为研究对象。病例组的纳入按照哮喘的诊断标准[1]纳入。对照组为无哮喘及其他过敏性疾病的儿童。
1.2研究方法 采用传统的酚氯仿法抽提外周血DNA，保存于-20℃冰箱备用。基因多态性检测采用SNaPshot技术，在ABI Dx3500DNA序列检测平台上，使用GeneMapper4.1软件对炎症基因的4个基因多态性位点进行检测，检测使用的PCR扩增的正、反向引物及SNaPshot反应过程需要用到的延伸引物序列见表1。PCR扩增体系为20μl，其中加入10倍缓冲液2 μl，镁离子0.8 μl，dNTP0.5 μl，Platinum酶0.2 μl，双蒸水14.5 μl，正反向引物各0.5 μl，最后加入1 μl DNA模板。PCR扩增条件为95℃预变性 2min，95℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸5min，PCR扩增结束后，用虾碱酶的方法对PCR产物进行纯化，使用SNaPshot技术进行延伸反应，采用GeneMapper4.1软件分析结果。
1.3统计分析 采用IBM SPSS23.0软件进行统计分析，SNP基因型及等位基因频率的组间比较均使用χ2检验，计量资料采用 表示，基因-基因的交互作用使用logistic回归分析进行，结果采用OR(95%CI)标示，以P<0.05为检验具有统计学意义。
表1 PCR扩增引物序列及SnaPshot技术延伸引物序列
2 结果
2.1 一般人口学特征 共纳入研究对象218例，其中哮喘儿童101例，无哮喘及其他过敏性疾病儿童117例，基本人口学特征分析见表2，两组在性别、年龄的分布上无显著性差异（P>0.05），表明两组纳入具有均一性。
表2 哮喘组及对照组人口学特征分析
2.23个炎症基因的4个SNPs位点分型结果图
样品#65和#42的ABI 3500Dx测序结果经GeneMapper4.1软件处理后3个炎症基因的4个SNPs位点的SNaPshot图像见图1。其中ADRB2基因rs1042713从反向（R）进行扫板，其他3个SNPs位点从正向（F）进行扫板。
图1样品#65和#42的 3个炎症基因的4个SNPs位点的峰型和基因型
A：样品#65的ADRB2基因rs1042713、IL-13基因rs20541、IL-13基因rs1800925、IL-13Rα1基因rs2495636分别为TC（正向为AG）、CC、CC、GG；B：样品#42的ADRB2基因rs1042713、IL-13基因rs20541、IL-13基因rs1800925、IL-13Rα1基因rs2495636分别为CC（正向为GG）、CT、CT、GG。
注：碱基C（黑色峰）；T（红色峰）；A（绿色峰）； G（蓝色峰）。
2.3 纳入的4个SNPs位点基因型频率分布
对ADRB2基因的rs1042713、IL13基因的rs20541和rs1800925、IL13Rα1基因rs2495636等4个SNP位点的基因型进行分析，其频率分布见表3，其中ADRB2基因rs1042713位点AA基因型频率分布高于对照组，两组比较存在显著性差异（P=0.028）。
表3 rs1042713、rs20541、rs1800925、rs2495636多态性位点基因型频率分布情况（例，%）
2.4 纳入的4个SNPs位点等位基因频率分布
对ADRB2基因的rs1042713、IL13基因的rs20541和rs1800925、IL13Rα1基因rs2495636等4个SNP位点的等位基因进行分析，其频率分布见表4，其中ADRB2的rs1042713位点等位基因A频率分布高于对照组，两组比较存在显著性差异（P=0.008）。
表4 rs1042713、rs20541、rs1800925、rs2495636多态性位点等位基因频率分布情况（例，%）
2.5 三个基因4个SNPs位点交互作用对哮喘发病的影响
以突变纯合基因赋值为1，杂合子及野生型基因赋值为2，利用logistic回归分析基因-基因的交互作用，结果表明，ADRB2基因的rs1042713、IL13基因的rs20541和rs1800925、IL13Rα1基因rs2495636等4个SNP位点的交互作用促进了哮喘疾病的发生，其发病危险性分别是对照组的1.55、1.75、1.45、1.57、1.42及1.46倍（P值均<0.001），见表5。
表5 rs1042713、rs20541、rs1800925、rs2495636 交互作用对哮喘发病的影响
3 讨论
哮喘是儿童时期最常见的呼吸道慢性过敏性疾病，近年来已成为全球公共卫生问题[1]。哮喘是一种多基因疾病，以支气管高反应性和气道炎症为特征，其发病受遗传、宿主免疫力和环境因素共同决定。由于大多数儿童期哮喘与特应性反应相关， 我们选择了ADRB2、IL13和IL13Rα1基因这三种关键过敏性炎症基因，探讨基因位点突变及基因-基因交互作用对儿童哮喘性疾病的发病影响。
β2肾上腺素能受体（β2AR）是在呼吸道上皮细胞，气道平滑肌和淋巴细胞中发现的G蛋白偶联受体。编码该受体的ADRB2基因被定位到染色体5q31-33，被认为具有特应性、易感性或支气管高反应性位点[2]。重要的是，β2受体激动剂是哮喘相关急性支气管痉挛的主要治疗药物，但对这些药物的反应存在个体差异，这些差异可能与遗传有关。
本研究结果证实ADRB2-rs1042713的基因位点突变增加了哮喘发病的危险性，研究结果与Hua等[3]在中国儿童群体的数据一致，该研究结果认为rs1042713等位基因AA的突变导致儿童哮喘的发病危险性增高。
1型和2型免疫反应的不平衡是发生哮喘的主要原因。Th2细胞主要分泌细胞因子IL-4，IL-5和IL-13，刺激2型免疫诱导免疫反应[4-5]。 IL-13是哮喘急性加重的主要介质之一。 IL-13导向疗法的临床试验数据显示直接针对IL-13的药物对减轻哮喘恶化有强烈的作用，暗示IL-13是哮喘炎症的介质[6]。此外，许多实验结果表明IL-13可能直接导致气道炎症增加，并参与哮喘气道重塑。将外源性IL-13导入小鼠气道导致嗜酸性粒细胞和淋巴细胞增加，气道肌肉收缩和气道高反应性[7]。此外，体内单独抑制IL-13可防止和逆转已建立的粘液细胞改变，表明IL-13在粘液过度生成中起重要作用[8]。IL13Rα1是一种65-70kDa的糖基化蛋白，与IL13以及IL4Rα结合，启动信号转导，导致粘蛋白分泌，气道高反应性，纤维化和上调几丁质酶，从而增加哮喘风险[9]。这些累积结果表明IL-13和IL13Rα1是哮喘恶化的主要效应物。
本研究结果针对IL13基因常见的2个多态性位点（rs20541、rs1800925）和IL13Rα1基因（rs2495636）与哮喘发病相关性进行研究，虽未发现IL13的SNP位点与哮喘发病显著相关，但ADRB2-rs1042713与上述2个IL13基因和IL13Rα1基因SNP位点有交互作用，表明基因-基因的交互作用显著促进了哮喘的发病，与Hua等[3]在中国儿童群体的数据一致。
哮喘患者未满足的主要临床需求之一是缺乏临床上可用的生物标志物指导治疗。有人提出，高达80％哮喘患者接受治疗后的个体肺功能反应差异是由遗传变异引起的[10]。尽管本研究确定的遗传变异表明ADRB2、IL13和IL13Rα1基因对哮喘的发病有一定的影响，但由于目前大多数药物遗传学研究的能力不足，尚且需要共同努力来进行大规模药物基因组学研究和大规模荟萃分析来确定是否能针对人体的遗传变异来开发有效的治疗哮喘药物，从而达到降低哮喘发病率及恶化情况的目的。
参考文献：
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论文作者:余宾1,,严提珍2, 龙易勤1
论文发表刊物:《医师在线》2018年2月上第3期
论文发表时间:2018/5/7
标签：基因论文; 哮喘论文; 位点论文; 多态性论文; 炎症论文; 作用论文; 儿童论文; 《医师在线》2018年2月上第3期论文;