浙江大学医学院附属第二医院干部保健科 浙江 杭州 310009
摘要 目的: 研究CaMKⅡ激酶在KIF5B-RET阳性肺癌细胞中的作用。方法: 通过生长曲线、western blot、抑制剂实验等探索 KIF5B-RET蛋白与CaMKⅡ激酶的相互作用。结果: CaMKII激酶在KIF5B-RET阳性细胞中存在持续活化，下调 CaMKII活性明显抑制阳性细胞增殖能力。结论: CaMKII激酶是KIF5B-RET基因促增殖过程中的关键调控点。
一、前言 目前肺癌的发病率和死亡率在全球范围内位居各类恶性肿瘤之首。RET（rearranged during transfection）融合基因是新发现的肺腺癌驱动基因，已成为新的肺癌分子亚型[1]。但是KIF5B-RET的致癌相关的机制尚未得到明确，靶向药物治疗效果欠佳，所以进一步探讨相关机制十分重要。CaMKⅡ(Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinaseⅡ)属丝苏氨酸蛋白激酶CaMK家族，是一种多功能的蛋白激酶，在细胞周期和细胞增殖等过程中起着重要作用[2]。临床研究表明在多种肿瘤中存在CaMKⅡ高表达，提示了CaMKⅡ激酶可能在肿瘤细胞生长中发挥重要作用。目前还没有文献报道CaMKⅡ与肺癌RET融合基因相关，因此我们探究CaMKII激酶在KIF5B-RET阳性肺癌细胞生长的调控作用。
二、材料和方法
1.材料 DMSO、KN93购自Sigma; A549 细胞购自中国科学院上海细胞所; MTT 购于碧云天生物公司; GAPDH、RET及p-RET、CaMKⅡ及p- CaMKⅡ抗体购自美国 CST。
2.细胞培养 A549 细胞用10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液，于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。每3d传代1次，取对数期细胞进行实验。
3.生长曲线试验 收集细胞调整细胞浓度5×104/ml，每孔100ul, 接种于六孔板培养。每 24 h 取 1 板进行细胞计数，共7天。
4.蛋白免疫印迹检测 离心收集细胞，加入含有蛋白酶抑制剂的蛋白提取液，提取后测定蛋白浓度。蛋白经sds-page 凝胶分离，半干转于NC 膜上，封闭后4度一抗孵育过夜，TBST 洗膜三次，二抗室温孵育1小时，洗膜三次，pierce 发光液反应3分钟，胶片成像。
5.统计学处理 每组实验均重复3次。数据表达采用均数±标准差 (x ± s), 组间比较采用配对t检验。SPSS19.0 软件进行统计学分析, P＜0.05 表示差异有统计学意义。
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三、结果
1. KIF5B-RET 融合蛋白持续活化促进肺癌细胞增殖 在人肺癌细胞A549 上外源性表达 KIF5B-RET, Western分析发现在无血清和配体 GDNF 刺激下存在明显RET磷酸化水平，而 RET及对照则不明显，表明 KIF5B 和 RET 融合能使 RET 异常活化(图1)。为进一步进行了体外细胞增殖实验，细胞生长曲线显示稳定表达 KIF5B-RET 融合蛋白的 A549 的细胞数明显高于表达RET及空载体组 (图2)。上述结果显示 KIF5B-RET 融合蛋白异常活化，促进阳性肺癌细胞增殖生长。
2. CaMKII激酶在KIF5B-RET阳性细胞中存在持续活化 KIF5B-RET 融合蛋白促进细胞增殖，也有研究表明CaMKII激酶与肺癌增殖以及肺癌干细胞有相关作用。我们通过Western检测阳性细胞中CaMKII激酶活化水平。与对照相比，稳定表达KIF5B-RET肺癌细胞上CaMKII的磷酸化水平有明显增高(图3)，上述结果表明 CaMKII激酶在KIF5B-RET阳性细胞中存在持续活化，可能在 KIF5B-RET 融合蛋白促进肺癌细胞增殖生长过程中起到重要作用。
3.下调 CaMKII激酶活性明显抑制KIF5B-RET阳性细胞增殖能力 KN93，一种特异的CaMKII激酶抑制剂，用不同浓度的KN93处理 KIF5B-RET阳性 A549细胞后测定细胞存活率。结果显示，随着药物浓度增加，KIF5B-RET 阳性细胞的生长能力明显下降（图4）。结果提示抑制CaMKII激酶活性能阻断RET融合蛋白促增殖作用。
四、讨论 肺癌治疗进入基于分子标志物的“个体化”医学时代，分子靶向药物治疗已成为肺癌治疗研究的热点，尤其是肺癌中驱动基因的研究。RET 融合基因是近年来在非小细胞肺癌中发现的新的融合基因[1]。我们的研究也显示KIF5B 与 RET 融合后会使激酶更易活化，对肺癌细胞的增殖和生长起到了促进作用。
本次研究中我们发现 CaMKII激酶在 KIF5B-RET 诱导的肺癌细胞增殖过程中起重要作用。KIF5B-RET蛋白能显著活化CaMKII激酶从而调控细胞增殖过程，而用特异性抑制剂下调CaMKII激酶活化水平能显著降低KIF5B-RET阳性肺癌细胞的增殖能力。目前在 KIF5B-RET 阳性的患者的治疗上，酪氨酸激抑制剂 Vandetanib，Cabozantinib等多个药物已开始进入临床实验，但与安慰组相比未表现出更好的生存获益，而且酪氨酸激酶抑制剂在临床应用中存在易产生耐药性和个体治疗反应差异大等问题。我们的研究证实了 KIF5B-RET 融合基因在肺癌发生发展过程中起了重要作用，CaMKII激酶是其中关键调控点。抑制CaMKII激酶能明显减弱KIF5B-RET 的促进肿瘤的作用。目前有CaMKⅡ的抑制剂家族成员有KN-62，KN-92，KN-93等，还有研究显示表明天然植物提取的小分子药物小檗胺对CaMKII激酶有明显抑制作用[3]。这也为进一步开发靶向药物或药物联用提供了思路和理论基础。
参考文献：
1.Kohno, T., et al., KIF5B-RET fusions in lung adenocarcinoma. Nat Med, 2012. 18(3): p. 375-7.
2.Braun, A.P. and H. Schulman, The multifunctional calcium/calmodulin-dependent protein kinase: from form to function. Annu Rev Physiol, 1995. 57: p. 417-45.
3.Xu, R., et al., Berbamine: a novel inhibitor of bcr/abl fusion gene with potent anti-leukemia activity. Leuk Res, 2006. 30(1): p. 17-23.
论文作者:钱盈盈
论文发表刊物:《医师在线》2017年8月上第15期
论文发表时间:2017/11/8
标签：激酶论文; 细胞论文; 肺癌论文; 阳性论文; 蛋白论文; 抑制剂论文; 基因论文; 《医师在线》2017年8月上第15期论文;