(1湖南省永州市中心医院南院麻醉科 湖南 永州 425001)
(2南华大学医学院生理学教研室 湖南 衡阳 421001)
(3 Neurim Pharmaceuticals Ltd 以色列 特拉维夫 69710)
【摘要】 目的：在本研究中，我们评估了一种新型褪黑素受体激动剂Neu-P12对坐骨神经慢性结扎(CCI)模型大鼠神经性疼痛的改善作用。方法：SD大鼠坐骨神经慢性结扎手术后第12天行机械性痛阈测定，检测指标大鼠缩足反应阈值(PWT),分别于溶媒、吗啡(10mg/kg)或Neu-P12(30,100或300mg/kg)注射前0分钟(基础值)及注射后30、60、90、120及180分钟时行PWT检测。结果：与假手术组比较，CCI模型组大鼠PWT值显著性降低；与CCI模型组比较，吗啡处理组、100及300mg/kg Neu-P12组大鼠PWT值显著性升高。此外，100及300mg/kg Neu-P12组大鼠PWT值显著性高于30mg/kg Neu-P12组大鼠；300mg/kg Neu-P12组大鼠PWT值显著性高于100mg/kg Neu-P12组大鼠。结论：新型褪黑素受体激动剂Neu-P12剂量依赖地改善坐骨神经慢性结扎模型大鼠神经性疼痛。
【关键词】 Neu-P12；褪黑素；镇痛作用；CCI模型；大鼠
【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）21-0017-03
Antinociceptive effects of a novel melatonin receptor agonist Neu-P12 in the chronic constriction injury model of neuropathic pain in rats Deng Yan-ling1, Tian Shao-wen2，Laudon Moshe3
1:Department of Anesthesiology, Central Hospital of Hunan Yongzhou, Yongzhou,425001, Hunan, PR China. 2:Department of Physiology, Medical School, University of South China, Hengyang, 421001, Hunan, PR China. 3 :Neurim Pharmaceuticals Ltd.，Tel-Aviv，69710，Israel
Corresponding Author: Deng Yang-ling E-mail:1258727398@qq.com
【Abstract】 Objective In the present study, we assessed the potential antinociceptive effects of a novel melatonin receptor agonist Neu-P12 in the neuropathic pain induced by chronic constriction injury (CCI) in rats. Methods Twelve days after surgery, mechanical hyperalgesia was assessed before and 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min after vehicle, morphine (10 mg/kg) or Neu-P12 (30, 100 and 300 mg/kg) administration. Results Compared with the sham rats, the CCI rats showed less levels of the paw withdrawal threshold (PWT). Compared with the CCI rats, rats with morphine at 10 mg/kg showed more levels of the PWT. Neu-P12 increased dose-dependently the levels of the PWT. Conclusion The novel melatonin receptor agonist Neu-P12, like morphine, exert antinociceptive activities in the CCI model in rats.
【Keywords】 Neu-P12;Melatonin;Antinociceptive effects;CCI model;Rats
褪黑素是一种由松果体及某些外周器官如胃肠道、骨髓等合成和分泌的一种神经内分泌激素；褪黑素受体(MT1与MT2)广泛分布于多个神经系统部位如丘脑、下丘脑、垂体前叶及脊髓背角等。褪黑素及其受体系统在昼夜节律及胃肠道运动中起着重要的调节作用。近年来，动物实验结果表明褪黑素受体可通过与5-HT、多巴胺、肾上腺素及阿片信号通路相互协同发挥镇痛作用[1]；临床研究也表明褪黑素可有效改善肠易激综合征及纤维肌痛综合征病人疼痛状况[2,3]。
尽管较多的研究提示褪黑素可应用于多种疾病如肿瘤、心血管疾病、抑郁与失眠等的临床治疗，但褪黑素本身较易降解及短半衰期的特征限制了褪黑素的潜在临床应用。Neu-P11是一种用于治疗失眠的新型褪黑素受体激动剂，具有较长的半衰期、高褪黑素受体亲和力及增强γ-氨基丁酸能神经传递的特性[4]。我们最近研究结果表明，Neu-P11具有促进睡眠[4]及抗抑郁与抗焦虑的功能[5]；此外，Neu-P11亦能改善AD模型大鼠认知功能损伤[6]。Neu-P12为新近合成的Neu-P11的结构类似物，最近实验结果表明在小鼠腹痛模型中Neu-P11与Neu-P12均具有显著性镇痛活性[7]。本研究基于大鼠坐骨神经慢性结扎(CCI)模型进一步检测了Neu-P12对神经性疼痛的改善作用。
1.材料与方法
1.1 实验动物 实验动物为成年雄性SD大鼠,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。大鼠单笼饲养于温度（25±2℃）、湿度恒定的环境中，自由取食和饮水。动物处于“12小时明-12小时暗”的周期中，每天早上七点钟开启照明装置。实验开始前，小鼠熟悉实验环境一周，实验者每天接触每只大鼠5～6分钟以使其熟悉实验者以减少应激。实验操作遵照美国国立卫生研究院的《国家实验动物健康与管理条例》进行。
1.2 药品 Neu-P12由以色列Neurim Pharmaceuticals Ltd.提供；Neu-P12溶解于一滴Tween-80，然后用含有1% DMSO的无菌生理盐水稀释到最终浓度，于注射前现配。盐酸吗啡溶液购自于沈阳第一制药厂。
1.3 大鼠坐骨神经慢性结扎(CCI)模型建立与机械性痛阈测定 大鼠CCI模型制备参考已有的文献报道完成[8]，大鼠在麻醉状态下暴露左后肢坐骨神经干，用4-0铬制羊绒线轻度结扎坐骨神经干，共结扎4道，结扎间距为1mm,结扎强度以引起小腿肌肉轻度颤动为宜。假手术组大鼠操作相同，但无结扎处理。手术后第12天行机械性痛觉异常测定，检测装置为济南天一科技有限公司生产的自动电子压力测试仪(型号：YLS-3E)。最大压力刺激强度设定为150g以避免组织损伤。每个检测时间点进行3次大鼠缩足反应阈值(paw withdrawal threshold, PWT)测量，取其均值进行统计分析。
1.4 动物分组与药物处理 大鼠随机分为6组(每组n=8)：①假手术组(Sham+Vehicle)：给予溶媒处理；②模型组(CCI+Vehicle)：给予溶媒处理；③吗啡阳性对照组(CCI+Morphine)：给予10 mg/kg吗啡处理；④3个Neu-P12处理组(CCI+ Neu-P12)：分别给予30、100与300mg/kg Neu-P12处理。溶媒或药物处理均采用腹腔给药方式。分别于注射前0分钟(基础值)及注射后30、60、90、120及180分钟时行PWT检测。
1.5 统计分析 以假手术组大鼠基础值为基准将其它组大鼠PWT值进行标准化处理，采用双因素(处理×时间)重复测量方差分析方法进行统计分析，Post-hoc分析采用Tukey HSD方法。在使用的统计分析软件为Sigma Stat 3.2。实验数据均以均数±标准差(x-±s)表示，P<0.05判断差异有无显著性。300mg/kg Neu-P12组一只大鼠在注射Neu-P12后死亡，未纳入统计。
2.结果
Neu-P12对大鼠PWT的影响见图1。双因素重复测量方差分析表明各组大鼠PWT值有显著性处理效应(F (5,41)=15.368, p<0.001)、时间效应(F (5,205)=20.404, p<0.001)及处理与时间交互效应(F(25,205)=4.816, p<0.001)。Post-hoc分析表明，与假手术组比较CCI模型组大鼠PWT值显著性降低(p<0.001)；与CCI模型组比较，吗啡处理组、100及300mg/kg Neu-P12组大鼠PWT值显著性升高(各自p<0.001，p<0.001及p<0.01)。此外，100及300mg/kg Neu-P12组大鼠PWT值显著性高于30mg/kg Neu-P12组大鼠(各自p<0.001与p<0.05)；300mg/kg Neu-P12组大鼠PWT值显著性高于100mg/kg Neu-P12组大鼠(p<0.01)。
图1各组大鼠机械性痛阈测定中缩足反应阈值(PWT)的比较。括号内数值表示给药剂量，单位为mg/kg；Veh,Vehicle; Mor, Morphine；P12,Neu-P12。
3.讨论
CCI模型是以成年大鼠坐骨神经主干四道轻度结扎来模拟临床中的神经病理性异常疼痛。CCI模型大鼠异常疼痛行为在手术后的第二天即可出现，7～14天表现最为明显，其症状可持续约2个月之久，其异常疼痛行为主要包括自发痛、痛觉异常和痛觉过敏。正是由于CCI模型大鼠的这些异常疼痛行为与人体由于某些病因引起的外周神经损伤所诱发的神经慢性病理性疼痛的症状和行为极其相似，因此CCI模型常被用来进行慢性疼痛的发生机制及药物治疗等方面的基础研究。本研究基于CCI模型检测了一种新近合成的新型褪黑素受体激动剂Neu-P12的镇痛效应；与基于小鼠腹痛模型实验结果一致[7]，Neu-P12可显著性改善CCI模型大鼠神经性疼痛。
褪黑素发挥镇痛作用的神经机制目前并不十分清楚。褪黑素受体广泛分布于多个神经系统部位及胃肠道。脊髓背角神经元也有丰富的褪黑素受体表达；褪黑素能够抑制脊髓神经元突触易化过程[9]，提示褪黑素的镇痛效应可能是直接作用于脊髓神经元产生的；但近来研究却不支持这种可能性。Mickle等人的研究结果表明[10]，在脊髓离断的大鼠褪黑素并不能影响脊髓神经元的活动，表明褪黑素对脊髓神经元突触易化的抑制作用依赖于脊髓上位中枢的调节。侧脑室微量注射褪黑素受体拮抗剂[11]或脑池注射纳洛酮[12]均能阻断褪黑素镇痛作用，进一步表明脊髓上位中枢在褪黑素发挥镇痛作用中起着重要的作用。
研究表明，褪黑素及其受体与阿片肽及其受体的相互作用可能在褪黑素发挥镇痛效应过程中起着重要的作用。目前并没有证据表明褪黑素可通过直接与阿片受体结合发挥镇痛效应。早期受体结合实验证实松果体细胞膜上存在阿片受体[13]，脑啡肽或吗啡能够增强松果体对褪黑素的合成与释放[14,15]。另一方面，给予外源性褪黑素能促进内源性阿片肽的释放[16]。褪黑素能够干扰阿片肽对镇痛的耐受发展过程[17]，也能通过调制阿片受体的表达水平参与痛阈调节[18]。此外，褪黑素受体与阿片受体的共激活也能显著性延长脑啡肽的镇痛作用时间[19]。
Neu-P12是新近合成的Neu-P11结构类似物，我们未公开发表的实验结果显示Neu-P12也具有高褪黑素受体亲和力及增强γ-氨基丁酸能神经传递的特性。本实验基于大鼠坐骨神经慢性结扎模型进一步表明了Neu-P12能够发挥镇痛作用，其机制可能与激活褪黑素受体密切相关。在下一步工作中，一方面，我们拟采用其它的动物模型进一步检测Neu-P12的镇痛作用；另一方面，进一步阐明Neu-P12发挥镇痛作用的神经机制。
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基金项目：国家自然科学基金(81171281)、湖南省自然科学基金重点项目(10JJ2009)与以色列Neurim Pharmaceuticals公司研究基金。
论文作者:邓艳玲（通讯作者）1,田绍文2,Laudon Moshe
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第21期供稿
论文发表时间:2015/10/9
标签：大鼠论文; 受体论文; 褪黑素论文; 模型论文; 坐骨神经论文; 阿片论文; 脊髓论文; 《医药前沿》2015年第21期供稿论文;