覃建兵[1]2002年在《小麦细胞操作与基因工程体研究》文中提出小麦(Triticum aestivum L.)是世界上第一大粮食作物,是我国仅次于水稻的第二大粮食作物,其籽粒中含有65-70%的淀粉、7-22%的蛋白质、2-4%的脂肪,同时还有钾、磷、镁、铁、氟等多种矿质元素和维生素B。因此对小麦的育种研究,特别是以基因工程为重点的品质改良研究,一直是基础生物学和应用研究中最重要的课题之一。本文应用现代组织培养技术和现代分子生物学技术,对6 个小麦主栽品种的组织培养条件进行了系统研究; 对100 个株系的1Dx5 基因转基因小麦的后代遗传特性及表达规律进行了系统分析。研究工作的主要内容和结论如下。1. 优化了小麦组织培养条件,建立了以小麦幼穗切段、幼胚盾片和成熟胚盾片为外植体的高效稳定再生体系。①基因型:对6 个基因型的共4430 个材料个体的组织培养结果表明,总体植株平均再生频率为17.2%,鄂麦12 的再生频率要显着高于其它品种,平均为22.0%,单个组合中最高平均可以达到83%; ②外植体:幼穗、幼胚和成熟胚的平均植株再生频率分别为29.6%、30.1%和5.0%,优化后分别为46.7%、63.3%和13.3%,单个组合中最高分别可达60.0%、83.0%和30.0%,各组培外植体植株再生能力顺序为:幼胚≥幼穗>成熟胚。③激素:2,4-D 与Picloram 诱导愈伤组织的总体植株再生频率分别为27.6%和18.2%; 分化培养基中含0.01mg/l 和0.1mg/l 2,4-D 的植株总体再生频率分别为23.5%和11.9%; 幼穗、幼胚和成熟胚诱导培养基中分别含4.5mg/l 2,4-D、0.5mg/l 2,4-D 和1mg/l Picloram,分化培养基中均含0.01mg/l 2,4-D 为优化后的激素条件; ④继代:愈伤组织继代对植株的再生频率没有显着的影响; ⑤洗涤剂:稀释到10.0%的家用白猫洗洁精(GB9985)和升汞消毒处理后的植株总体再生频率分别为22.1%和25.8%,组织培养的污染率分别仅为8.3%和0.0%; ⑥再生分化指标间的相关分析表明:绿点分化和每团愈伤组织出苗数相互独立; 根的分化与植株再生存在显着负相关,但与绿点分化具极显着正相关; 每团愈伤组织出苗数与植株再生具极显着正相关;2. 分析了外源1Dx5 基因的表达规律。①转基因材料的栽培试验:对140 个单
李雪[2]2008年在《多年生黑麦草基因转化与抗旱性遗传改良研究》文中进行了进一步梳理本研究通过建立多年生黑麦草(Lolium perenne L.)高频再生体系,应用基因枪和农杆菌介导法将DREB1A和BADH-CMO基因导入胚性愈伤组织,获得正常生长的抗性增强的可育转基因植株;通过人工授粉和自由杂交方式获得转基因子代,并研究了其萌发、盆栽和田间生长特性;建立了快速检测多年生黑麦草转基因植株潮霉素(hyg)抗性的方法和抗旱子代筛选体系;综合评价了转基因多年生黑麦草的安全性。通过5年多的研究,在以下几个方面取得了进展:1、选择适宜品种,以胚为外植体,建立多年生黑麦草高频再生体系,使愈伤诱导率达到97.9%,胚性愈伤率达到19.4%,分化率可达90.9%。2、建立起多年生黑麦草遗传转化筛选系统:愈伤培养阶段添加hyg 100mg/L,筛选30d;植株再生阶段50mg/L,筛选至有芽长出后移入不含hyg的生根培养基中。农杆菌介导转化时以头孢霉素(cef)为抑菌剂,愈伤培养阶段添加300mg/L,植株再生阶段250mg/L。3、建立多年生黑麦草基因枪遗传转化体系:以0.5～1mm间的胚性愈伤组织为受体,金粉直径1μm,采用Ca(NO3)2+PEG4000作为DNA沉淀剂,6cm高度下轰击2次。获得转DREB1A基因爱神特转基因株系(ATR)68个,特拉华转基因株系(DTR)7个,尤文图斯转基因株系(JTR)18个;转BADH-CMO基因爱神特转基因株系(ABC)15个,叁个品种的平均抗性绿苗率为11.1%。4、建立多年生黑麦草农杆菌介导遗传转化体系:以预培养5d的胚性愈伤组织为受体,采用OD600=0.1左右的农杆菌菌液侵染10min,期间进行抽真空和晃动处理。去除菌液后,共培养4d,以500mg/L cef清洗后筛选,获得转DREB1A基因爱神特转基因株系(AGR)14个。5、转基因多年生黑麦草在温室和田间均可正常生长,盆栽ATR、AGR和ABC较ACK生长速度减慢,田间ATR、AGR、JTR、DTR与对照植株无明显差异,但ABC的生长受到严重抑制。外源基因的插入不仅使转基因植株的抽穗时间提前,还导致其穗长变短,尤其是BADH-CMO基因显着降低了ABC的穗长。DREB1A基因使转基因植株的抽穗个数略有提高,而BADH-CMO基因则使其显着降低。转基因植株较对照植株具有更高的抗旱、越冬和耐盐性,但抵御病害的能力明显下降,在对抗虫害方面二者无明显差异。除ABC外,转基因植株均能结实。6、采用人工授粉和隔离杂交两种方式获得大量转基因子代,T1代种子具有较高的发芽势和发芽率。以JTR为父母本的种子的发芽势具明显优势,以AGR为母本的种子的平均发芽势最低,以DTR为父本的种子的平均发芽势最低。T1代7天的平均芽长和根长分别为3.9cm和3.2cm。以JTR为父母本的种子,平均芽长最长,而以AGR为父母本种子,平均芽长最短。田间JTR的子代表现最优,以DCK和ATR-12为母本自由杂交的子代出苗势和出苗率均达100%。自由杂交授粉比人工授粉的种子具有更高的田间出苗势、出苗率、苗高和分蘖数,即使同一母本所得种子的萌发能力也不同。7、hyg和PEG对爱神特种子的萌发具有极显着影响,75mg/L hyg将发芽势降至44.8%,但发芽率仍达61.5%,hyg不适合在萌发期筛选转基因子代。15%的PEG只能使极个别种子发芽,20%则完全不能发芽。以15%的PEG筛选转基因T1代种子,推测的外源基因分离规律均低于孟德尔遗传定律。8、建立快速检测多年生黑麦草转基因植株hyg抗性的方法:1mg/L 6-BA+50mg/L hyg可用于多年生黑麦草离体叶片段的筛选,第8天时的褐化情况可作为初步筛选转基因植株的依据。盆栽T1代经干旱筛选后恢复生长的植株进行hyg叶片筛选,经筛选后的植株进行PCR检测全部呈阳性,初步说明外源基因在植物体内能够稳定遗传。9、转DREB1A和转BADH-CMO基因多年生黑麦草属于安全等级为I级的转基因植物,已经国家林业局生物安全处批准进行中间试验。
刘经伟[3]2004年在《植物基因工程的风险评估与安全管理研究》文中进行了进一步梳理植物基因工程技术的迅速发展，在带来巨大利益的同时，也给人类社会和自然界带来风险。虽然在实验室条件下人们可以非常精确地对DNA进行剪接，但一个外源基因导入植物体后，对整个植物基因组的影响人们尚不能完全预测和控制。植物体是一个极其复杂的生命系统，以我们现有的科学知识和技术手段还不能完全控制和支配植物的遗传。基因工程可能导致我们无法预测植物性状改变，有时这种改变在短时期内甚至难以觉察，但却可能给环境、生态系统、人身健康带来巨大的风险。由于植物基因工程的风险及这种风险的长期性、不可预测性，我们必须防患于未然。 当前植物基因工程生产的转基因植物主要应用于农业(含林业)和医药领域。农业领域主要是向植物转入各种有用基因，特别是抗害、抗逆、性状改良基因等。医药领域主要是利用转基因植物作为“植物生物反应器”生产口服疫苗及医用蛋白等。植物基因工程带来的风险主要是对生态环境的潜在威胁和对人体健康的可能危害。其中生态风险主要表现为转基因植物杂草化和基因漂移；抗虫转基因植物对非目标生物的影响；病毒寄主范围扩大与病毒重组；转基因植物的积累和级联效应等。健康风险主要表现为转基因植物及其产品可能含有已知或未知的毒素或过敏源，对人体产生危害；基因工程导致植物的某些营养成分或营养质量发生变化，引起人体的某些症状；标记基因传递可能导致的风险等。 本文探讨了风险及风险分析的基本理论和传统的植物基因工程安全性评价的目的、程序、方法、原则、等级划分及其不足。构建了新的植物基因工程叁维递进风险评估法。即在传统的安全评价方法的基础上，按照基于转基因植物本身的风险评估、基于生态系统的风险评估、基于社会层面的风险评估的叁维风险评估体系对植物基因工程的安全性及其风险进行评价。引入效益—费用分析法和风险补偿率分析法，综合评价植物基因工程项目的风险。 植物基因工程的风险控制与安全管理早己引起各国政府的高度重视。本论文分别考察美国、英国、日本、澳大利亚和我国的植物基因工程安全管理制度。引入植物基因工程项目风险管理最优化控制和总体风险控制机制。构建植物基因工程风险控制因子解释结构模型，用C语言编制计算机计算程序，解矩阵，求得风险控制因子分级递阶结构，并给出科学的风险控制建议。结合我国植物基因工程风险评估与安全管理的不足，提出加强我国植物基因工程风险评估与安全管理的对策。
廖勇[4]2006年在《抗病信号传导基因RAR1在小麦抗病基因工程中的应用》文中提出近年来，小麦白粉病、条锈病、纹枯病等病害已成为影响小麦生产的重要限制因素之一。加强抗病反应机制研究非常重要。目前，我国小麦品种中白粉病、条锈病抗性大多由单基因控制，与病原菌无毒基因之间作用方式大多遵循“基因对基因”的假说。 RAR1编码的蛋白是最早报道的植物防卫信号蛋白。首次是从大麦抗白粉病基因Mla12介导的抗病信号途径中分离的一个重要信号元件。随后的大量研究发现，在大麦中RAR1是许多抗白粉病基因Mla介导抗性所必须的。RAR1编码一个大约25.5kD的锌结合蛋白，包含有一个CCCH结构域，两个由60个氨基酸组成的锌结合域(zine-bindind domains)CHORD-Ⅰ和CHORD-Ⅱ(cysteine and histidine-rich domain)。RAR1在多种植物对真菌、细菌和病毒的抗性中均是必要的信号分子。 为研究RAR1在小麦抗病途径中的作用，本课题组从抗病中间偃麦草(Thinopyrumintermedium)中分离克隆出RAR1基因，将RAR1基因置换质粒pAHC25上的GUS基因，正确构建了单子叶高效表达载体pURAR1，其中RAR1基因受来自玉米的Ubiquitin启动子控制，筛选基因为BAR基因。 采用基因枪法转化小麦推广品种扬麦11、12幼胚愈伤组织3044个，经过2-3次Bialaphos筛选，获得265株再生植株，通过PCR检测获得阳性植株23株，转化率为0.76％。 对T_1代转基因材料进行PCR检测，检测到23株阳性植株，分离比为2.6：1；Southern分析表明RAR1的拷贝数为1-3个，说明RAR1基因已经整合到小麦基因组中；对部分植株进行RT-PCR分析，同时进行抗白粉病鉴定，在转RAR1基因T1代阳性植株中，有14株全生育期对小麦白粉病菌混合小种免疫，说明RAR1基因能够在小麦中遗传、其超量表达赋予受体小麦对白粉病菌的高度抗性。
汪正华[5]2013年在《蛋白质谷氨酰胺酶基因的合成、表达及性质研究》文中研究说明大多数食品蛋白因含丰富的谷氨酰胺残基,而导致其溶解度较低,低溶解度会影响乳化性、发泡性和凝胶性等功能性质,大大限制了在食品工业上的应用。蛋白质的脱酰胺作用被公认为提高溶解度的最有前景的途径,已经成为国内外研究的热点。蛋白质谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase, PG)是引起脱酰胺作用的一种新型水解酶,最早在金黄棒状杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)中发现,该酶可有效改善酪蛋白、小麦蛋白、米谷蛋白等食品蛋白的溶解度,提高乳化性、凝胶性等功能性质,在食品工业中具有十分广泛的应用前景。本课题利用基因工程技术,采用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌两种表达系统,对蛋白质谷氨酰胺酶进行重组表达,得到有生物学活性的PG酶,并对该酶进行性质研究,为今后PG酶的研究和开发提供了参考。本课题研究的主要内容包括以下叁个方面：1、蛋白质谷氨酰胺酶基因的人工合成对PG全长基因序列进行优化,优化后设计成24条相互重迭的寡核苷酸片段,每条片段大约60bp,且重迭部分大约20bp。通过重迭延伸PCR反应将这24条寡核苷酸片段拼接起来,得到一条全长为982bp的PG全长基因。合成后将长片段克隆至pUC19-T载体上,进行序列分析,结果表明由Assembly PCR组装成的长片段基因在第724位碱基处多出一个胸腺嘧啶(T),发生了移码突变。再次设计两对引物,通过重迭延伸PCR对该序列进行定点诱变,经测序分析,获得了序列完全正确的PG全长基因。2、蛋白质谷氨酰胺酶在大肠杆菌表达系统中的表达与活性检测以pUC19-T-PG为模板,PCR扩增出PG成熟肽序列,克隆至原核表达载体pET32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到基因工程菌。通过IPTG和乳糖自诱导两种方式表达重组蛋白,结果表明重组蛋白主要以包涵体形式表达,乳糖自诱导表达途径的蛋白产量是IPTG诱导的5.3倍。通过降低诱导温度和共表达分子伴侣两种策略,以期实现重组蛋白的可溶性表达,结果表明低温对可溶性的提高有一定的作用,而分子伴侣影响甚微。收集包涵体,经变性、复性后获得活性PG,通过Ni离子亲和层析对复性后的PG酶进行纯化。将纯化的PG酶与底物Cbz-Gln-Gly进行孵育反应,结果表明,PG可有效水解Cbz-Gln-Gly谷氨酰胺残基上的氨酰基,释放出氨；酶学性质的研究表明,PG酶的最适反应温度为40℃,最适作用pH为6.0。3、蛋白质谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌表达系统中的表达与活性检测在本章节中,构建了两种新型的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHPW和pCW。利用重迭延伸PCR技术将强启动子p43序列和中性蛋白酶信号肽nprB序列进行无缝连接,得到p43-nprB片段,将其克隆至pHP13中,得到穿梭载体pHPW。以pUC19-T-PG为模板,PCR扩增出PG成熟肽序列,克隆到pHPW中,得到重组表达载体pHPW-PG。再将pHPW-PG转化枯草芽孢杆菌DB403,获得基因工程菌pHPW-PG/DB403。发酵表达并提取PG粗酶,用SDS-PAGE检测PG酶的表达情况,结果表明,穿梭载体pHPW可有效将PG酶分泌于细胞外。用二肽Cbz-Gln-Gly溶液作为反应底物检测PG酶活性,表明PG粗酶可有效脱去二肽中谷氨酰胺残基的氨酰基,释放出氨；用小麦蛋白、酪蛋白和面筋作为酶解底物,结果显示PG粗酶能提高溶解度。本实验构建了另一种新型的穿梭载体——pCW,该载体带有低温诱导型启动子des和中温α淀粉酶信号肽SamyQ。将PG酶成熟肽基因克隆至穿梭载体pCW中,转化DB403,得到基因工程菌pCW-PG/DB403,在25℃环境条件下,发酵表达外源蛋白。经SDS-PAGE验证,得到了较为单一的蛋白条带,说明降低培养温度可抑制DB403自身蛋白的分泌,而启动子des依旧可以启动外源蛋白的分泌表达,证实pCW具有低温诱导的功能。提取PG粗酶,用二肽Cbz-Gln-Gly和酪蛋白溶液作为酶解底物,检测PG酶的活性,结果表明PG粗酶可有效脱去二肽中谷氨酰胺残基的氨酰基,释放出氨；酶解酪蛋白的实验表明PG粗酶可提高酪蛋白的溶解度。以上结果表明,本课题构建的两种新型穿梭载体pHPW和pCW,均具有分泌表达外源基因的功能。通过功能性实验,验证了这两种载体表达的PG酶均具有一定的生物学活性。pHPW和pCW的构建,为外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达提供了新的途径,尤其是低温诱导型载体pCW,更显示出一定的应用前景。本实验构建的两种基因工程菌pHPW-PG/DB403和pCW-PG/DB403,均能表达有活性的PG酶,为今后该酶的研究和开发提供了参考。
宋丽[6]2004年在《基因枪转化Anti-Trxs基因与转基因小麦后代的遗传分析》文中研究说明小麦收获前穗发芽问题不仅影响小麦的产量，而且严重降低品质，给小麦生产造成了严重的经济损失。本研究试图通过转基因技术，获得抗穗发芽小麦新材料。研究以蓝色黑鸭草（phalaris coerulescens）的硫氧还蛋白反义基因（Anti-TrxS）为遗传转化的目的基因，以小麦幼胚为受体材料，进行了以下几方面的研究：1、优良受体基因型的筛选及组织培养条件的优化；2、以优良基因型豫麦18-64等的幼胚及愈伤组织为受体材料，用基因枪法对Anti-TrxS基因和Bar基因（报告基因）进行共转化和幼胚的植株再生培养；3、对转化的再生植株和后代进行了分子鉴定和遗传分析；4、对转基因小麦的α-淀粉酶活性及发芽特性的变化进行了检测。主要试验结果如下：1. 以黄淮麦区大面积推广的14个小麦品种济麦2号、郑9023、漯麦4号、豫麦18、豫麦18-64、温麦6号、偃高1号、内乡188、豫麦34、豫麦47、郑新991、郑新992、95519及00中13的幼胚作为研究材料，通过同一组织培养条件下筛选适合基因枪转化的优良受体基因型。结果表明，小麦幼胚愈伤组织的分化能力在不同品种之间存在显着差异，其中豫麦18-64、00中13、郑新991和郑新992是基因枪转化的理想受体材料。2. 再生体系优化研究中，以豫麦18-64和郑9023为应试材料，在不同浓度维生素B1（盐酸硫胺素）处理下接种两周后统计出愈率、<WP=7>鲜重；分化培养两周后统计愈伤组织绿点数，四周后统计分化率，结果表明，在MS培养基中添加10mg/L维生素B1有利于小麦幼胚胚性愈伤组织的发生，同时能明显提高幼胚愈伤组织的再分化能力。3. 以6个小麦品种豫麦47、豫麦34、郑州9023、济麦2号、郑新991和偃高1号为研究材料，组织培养4周后进行不同时间的干燥处理，结果表明6h和12h干燥处理的分化率都比对照有明显提高，其中12h处理的提高更为显着，郑9023和济麦2号的分化率比对照分别提高了25%和26.8%，说明干燥处理是提高愈伤组织分化率的一个有效措施。4. 再生体系优化的基础上，以筛选出的优良受体豫麦18-64为受体材料，用基因枪法进行了目的基因（Anti-TrxS）和标记基因（Bar）的共转化和再生培养，从接种的2110个幼胚中，获得T0再生植株42株。同时发现，以预培养10天的幼胚愈伤组织作为转化受体，其转化效果较幼胚好；转化时轰击2次可提高转化效率。5. 对T0代11株长势良好的再生植株进行了PCR扩增、PCR-Southern杂交分析，结果有8株是转Anti-TrxS基因阳性植株，说明目的基因整合到了小麦的基因组中。对所得T0代42株再生苗的叶片进行PPT涂沫抗性测定（150mg/L），结果有27株表现抗性，说明Bar也整合到小麦基因组中。6.对本研究所得转基因后代T1、T2和T3代进行了PCR、嵌套PCR以及嵌套PCR产物的酶切消化，结果表明目的基因完整的遗传给了后代。在02TY18的6个T1株系检测中，有3个株系为1：0纯合，一个株系表现3：1分离，另两个株系分别为5：1和1：1的分离比例。对01TY18、01TY70、00TY5和00T89的转基因后代（T1、T2和T3）的分子鉴定和遗传分析表明，不同后代株系分离比例有一定差异，其中<WP=8>有的株系表现为3：1的分离，有的明显低于3：1的分离比例，在所检测的株系中没有发现1：0纯合株系。对00TY5和00T89的T4代8个转基因株系进行了PCR扩增、PCR-Southern杂交结果分析，发现4个1：0纯合株系，另外4个株系分离比例有差异，但阳性植株明显增多；适合性测验结果表明2个株系符合3：1分离比例，另两个株系明显高于3：1分离比例。7. 对转基因T1代种子进行了α-淀粉酶活性及发芽特性的初步测定，结果表明转基因种子中α-淀粉酶活性比未转化种子明显降低；转基因种子的发芽速度在发芽试验的前两天明显偏低，而对种子的最终发芽率影响不大。
闫栋[7]2018年在《农杆菌介导小麦遗传转化体系的优化及盐生草耐盐基因在拟南芥中的功能验证》文中认为小麦(Tritieum aestivum L.)是重要的世界性粮食作物,在保障全球粮食安全中占有重要地位。同时,世界范围内的土壤盐渍化危害程度正在不断加剧,由此引发的小麦产量和品质下降等问题日益突出。因此,利用生物工程技术将耐盐基因导入小麦以提高其耐盐性具有广阔的应用前景,而稳定、高效的小麦再生体系是实现基因工程操作的必要条件。盐生植物盐生草(Halogeton glomeratus)主要分布于我国西北旱区和半干旱地区,具有极强的耐盐抗旱性,是发掘耐盐基因的优质物种。本研究以小麦永春2460成熟胚为外植体,构建了稳定高效的小麦再生体系,同时利用农杆菌介导的方法进行遗传转化,并将盐生草中克隆出的耐盐候选基因在拟南芥中进行功能验证,主要结果如下:(1)永春2460小麦成熟胚诱导愈伤组织的外植体最佳处理方法为将种子用30%NaCl O灭菌20 min,用无菌水冲洗干净后浸泡12 h,将小麦胚完整剥下后用刀片破坏胚芽生长点,再用十字切法将胚切成四份后接种于诱导培养基,其愈伤诱导率较高,并能有效防止胚直接发育成幼苗。(2)选用不同激素配比处理对小麦愈伤组织生长体系进行优化,最终确定了较为适宜的愈伤诱导和分化激素配比:2.5 mg/L的2,4-D有利于愈伤组织的诱导,培养体系为MS基本培养基+CH(0.5 g/L)+Pro(0.5 g/L)+2,4-D(2.5 mg/L)+蔗糖(15 g/L)+麦芽糖(15 g/L)+琼脂(4 g/L),pH值为5.6~6.0;愈伤分化体系为MS基本培养基+KT(3.0 mg/L)+6-BA(2.0 mg/L)+蔗糖(15 g/L)+麦芽糖(15 g/L)+琼脂(4 g/L),pH值为5.6~6.0。(3)确定了适用于小麦愈伤组织的遗传转化条件:菌液浓度OD_(600)=0.6,愈伤侵染情况较好且存活率相对较高;头孢霉素浓度为600 mg/L时农杆菌抑菌效果较好,还发现侵染过程中使用超声波处理和加入乙酰丁香酮对于提高其遗传转化效率具有一定的辅助作用。(4)以转化盐生草CL5527基因的拟南芥T_2代为材料,研究该基因对拟南芥耐盐性的影响。结果发现,CL5527基因能明显提高拟南芥的绿芽率,当NaCl胁迫浓度为30 mmol/L和120 mmol/L时,CL5527转基因株系与野生型株系的耐盐性差异较小,在60~90 mmol/L NaCl胁迫时差异显着(P<0.05)。根系生长方面:随着NaCl胁迫浓度的增加,野生型和转基因株系的主根生长受到抑制,根长逐渐下降,其中野生型株系主根长度下降幅度较大,转基因株系则相对稳定,二者差异显着(P<0.05);同时盐胁迫下拟南芥的侧根数目不断增加,野生型和转基因株系之间差异不显着;表型特征方面:盐胁迫下转基因株系较野生型表现出明显的耐盐优势,在不同NaCl浓度胁迫下转基因株系生长状况均好于野生型;生理生化指标方面:在盐胁迫下转基因株系比野生型的叶片叶绿素含量下降幅度要小,其光合系统破环较轻,对MDA含量及相对电导率等分析发现转基因拟南芥的脂膜受损程度较野生型轻。CL5527基因的表达在一定程度上能够提高拟南芥的耐盐性。
李明浩[8]2010年在《小麦遗传转化体系建立和优化及抗坏血酸过氧化物酶基因（Ta-APX）转化小麦研究》文中研究表明为了建立和优化Alondra's的高效再生及遗传转化体系,为小麦遗传转化提供更多的受体基因型。本研究以Alondra's的幼胚为外植体,研究了培养基种类、不同激素等对其幼胚愈伤组织的诱导及其再生的影响。结果表明,在使用N6培养基时,添加3 mg.L-1的2,4-D并附加1000 mg.L-1的CH对其愈伤的诱导效果较好；添加4 mg.L-1的ZT、不附加IAA对其分化效果最好。通过构建植物表达载体pCAMBIA1301-220.6,利用基因枪法将Hyg基因导入到Alondra's幼胚愈伤组织,以探索Alondra's的高效遗传转化体系。最终在含100 mg.L-1潮霉素选择培养基上筛选、分化,获得了30株抗性植株,经PCR检测,其中5株为阳性转基因植株,转化率为0.5%。Alondra's遗传转化体系的建立丰富了小麦遗传转化的基因型,为小麦品种的转基因改良和在不同背景中研究基因的功能奠定了良好的基础。农杆菌介导遗传转化具有外源基因表达稳定、一般为单拷贝等优点,遗传转化效率低、体系不稳定限制了该转化方法在小麦中的广泛应用。为了优化农杆菌介导的小麦遗传转化条件,本研究以普通小麦品种扬麦15和Alondra's的幼胚产生的愈伤组织为受体材料,通过检测Gus基因的瞬时表达情况,比较了农杆菌介导的主要影响因子的转化效率。结果表明,在相同条件下两个品种农杆菌侵染的最佳条件不尽相同。扬麦15的最佳优化条件为：先在不添加AS的培养基中预培养,然后在菌液浓度为OD600=1.0、AS浓度为100μmol/L条件下侵染10min,最后在25℃共培养Id; Alondra's则在菌液浓度为OD600=0.5、共培养时间为2d时,表现出最佳的Gus基因瞬时表达率。植物在逆境胁迫及病原菌侵染下,体内活性氧会大量积累,从而破坏正常新陈代谢时清除平衡,活性氧的清除系统对于维持植物的正常生理功能及正常的新陈代谢具有重要的意义。因此,通过植物基因工程的方法,将能够清除植物体内活性氧类物质的过氧化物酶基因导入到综合性状优良的小麦品种中,对于提高小麦的抗氧化胁迫能力有着重要的意义。本实验室在扬麦5号及与其回交7代的小麦/簇毛麦6VS/6AL易位系为材料建立的白粉菌诱导的叶片SSH文库中,克隆了一个小麦抗坏血酸过氧化物酶基因(Ta-APX),并发现该基因在白粉菌侵染初期发挥一定作用。为了进一步研究该基因在抗白粉病中的功能及其作用机制,研究其抗氧化能力与白粉菌侵染应答的关系。本研究在构建植物表达载体pAHC-Ta-APX的基础上,利用基因枪法将其导入到小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织。在含除草剂的培养基上经过筛选和分化,最终获得38株抗性再生植株。根据bar基因、ubi启动子及目的基因序列设计引物,对38株再生植株进行PCR鉴定,最终共获得10株含目的基因的阳性植株。为了研究转基因植株的抗氧化胁迫性,分析了PEG6000诱导及白粉菌胁迫下T1代转基因植株内APX酶活性,结果表明,在两种胁迫诱导下转基因株系的APX酶活性均高于对照植株。在大田条件下对T1代转基因植株进行抗白粉病和赤霉病接种鉴定,结果表明,转基因植株的白粉病和赤霉病抗性均有不同程度的提高,推测转基因植株通过过量表达Ta-APX基因提高了其抗氧化胁迫性,进而提高了对植物病原菌侵染的抵御能力。对转基因T1代植株的主要农艺性状调查结果表明,除株高外转基因植株的其它主要农艺性状与对照相比差异不显着。
卢丽丽[9]2008年在《基因枪法导入GUS基因诱导小麦条锈菌毒性突变的研究》文中进行了进一步梳理小麦条锈病是世界各小麦产区最重要的病害之一,种植抗病品种是防治小麦条锈病最经济有效的措施,但是其病原小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp. tritici)毒性变异频繁,可以通过变异产生新的毒性小种,导致小麦品种抗病基因失效,引起小麦条锈病周期性流行危害。一般认为小麦条锈菌毒性变异的主要途径是基因突变和异核作用,其中基因突变是产生新的毒性基因的唯一途径。因此,深入开展小麦条锈菌的致病相关基因的研究,对解决小麦品种抗病性丧失问题有着十分重要的理论和实践意义。本研究采用基因枪转化法以带有β-葡糖醛酸酶(GUS)报告基因的质粒pGUS6L20转化小麦条锈菌,进一步优化条锈菌遗传转化体系,分离和筛选小麦条锈菌毒性突变体,研究突变体的生物学特性。获得如下研究结果:1.优化了小麦条锈菌基因枪法转化体系:为了提高基因枪的转化率,本研究对CYR29遗传转化体系中主要参数进行了优化,得到最优体系为采用PDS-1000/ He基因枪(Bio-Rad),轰击前小麦条锈菌夏孢子在4℃下萌动2～2.5h,每枪夏孢子用量为0.7mg,金粉(直径为0.6μm)用量为350μg,质粒DNA为1μg,最适轰击压力为1100 psi,较适轰击压力为900psi和1350psi,轰击时真空度为2.7×104Pa,爆裂膜与承载膜之间的距离为2.5cm,承载膜与阻挡网之间的距离为0.8cm,阻挡网与靶细胞之间的距离为6cm。2.探索小麦条锈菌夏孢子转GUS基因遗传转化体的分离方法:以从菌种筛选品种上分离转化体法为主,从繁殖品种辉县红上分离转化体法为辅可有效提高转化体的检出率。同时本研究建立了利用透明胶带粘取夏孢子并通过染色分离小麦条锈菌转GUS基因转化体的新方法。3.获得了GUS基因瞬时表达菌株和毒性突变菌株:采用基因枪转化法以带有β-葡糖醛酸酶(GUS)报告基因的质粒pGUS6L20转化小麦条锈菌CYR29,在转化当代条锈菌中得到了GUS瞬时表达的菌株;连续继代转接培养后,在转化后T1和T2代条锈菌中检测到了GUS基因稳定表达的菌株;利用GUS报告基因和毒性标记相结合的方法,经过叁代筛选鉴定在小麦条锈菌中国鉴别寄主尤皮Ⅱ号上获得了MJ-4和MJ-7两个稳定的毒性突变体,在抗引655上获得了MK-2和MK-3两个稳定的毒性突变体;4个突变菌株对筛选品种都发生了毒性突变,MK-2引起的反应型变化为0→3型,MJ-4、MJ-7和MK-3引起的反应型变化为0→4型。经PCR及PCR -southern blot证实外源片段已整合到毒性突变菌株的基因组中。突变菌株经鉴别寄主和近等基因系鉴定,毒性谱均发生了较大变化。研究表明基因枪转化法是获得条锈菌毒性突变体的有效方法。本研究采用基因枪轰击导入外源标记基因,获得了优化的条锈菌遗传转化体系和条锈菌毒性变异的突变体,为条锈菌毒性基因的克隆和阐明条锈菌毒性变异的机理奠定了基础。
张媛媛[10]2004年在《抗除草剂Bar基因导入小麦栽培品种的研究》文中研究说明小麦是重要的粮食作物之一，利用基因工程进行遗传改良的研究一直倍受人们关注。本研究以安徽本地小麦栽培品种为材料，通过建立起良好的再生休系，利用基因枪，将含有抗除草剂Bar基因的植物表达载体，导入安徽优良品种小麦幼胚愈伤组织，并通过GUS瞬时表达情况对基因枪轰击参数进行了优化。用除草剂对轰击后的材料进行分化生根筛选，共获得33株抗性再生苗。通过PCR检测和涂叶检测，初步证明其中有4株已将Bar基因整合到小麦基因组中并且得到表达，平均转化率为0.33%。此外通过回交将抗Basta（主要成分为PPT）除草剂的Bar基因转育到这些小麦品种，通过对转Bar基因小麦人工杂交与回交后代除草剂抗性的连续跟踪鉴定，研究了Bar基因在小麦杂种后代的遗传表现。结果表明：1 小麦再生体系的建立小麦幼胚离体培养中，基因型和培养基是建立良好再生体系的主要因素。从愈伤组织的诱导率、生长质量、分化率和再生率来看，均有扬麦158>安农98005>皖麦33>安农92484。小麦幼胚在MS+2.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L ABA培养基诱导愈伤组织，经过4℃低温处理，转入分化培养基MS+1.0 mg/L KT+0.2 mg/L NAA中， 在1/2 MS+0.4 mg/L NAA+15 mg/L PPT+0.6 mg/L PP333培养基中壮苗生根。在以上再生条件下，幼胚愈伤再生频率显着提高。2 小麦基因枪转化体系的建立并通过GUS基因的瞬时表达优化了转化条件。结果表明：在沉淀剂为50 μl 2.5 mol/L CaCl2+20 μl 0.1 mol/L亚精胺，金粉/DNA用量为250 mg/0.5 μl，轰击距离在9 cm时，GUS基因具有较好的表达效果，受体材料分别在轰击前4 h和轰击后16 h作渗透培养(0.4 mol/L渗透剂)。轰击压力为1100Psi，真空度为91.4×103-94.9×103 Pa，每皿轰击一次。3 转化体的筛选和抗性植株的获得确定了不同筛选阶段的选择压浓度：愈伤组织继代、分化、生根时PPT分别为3 mg/L、5 mg/L和15 mg/L。抗性植株经PCR检测后最终得到了扬麦158和安农98005两个品种的4株转基因植株，最高转化频率为0.66%。对其叶片作除草剂PPT的表型性分析，结果有2株表现完全抗性，2株表现部分抗性，表明Bar基因已在小麦植株中得到表达，转化率在0.33%~0.66之间。转化周期为3~4个月左右。4 杂交育种<WP=4>以含Bar基因的抗除草剂小麦基因遗传工程体为基因供体，与安徽品种进杂交，获得的F1后代均为抗性植株。进行自交获得的F2代中抗除草剂植株与感除草剂植株的分离比基本符合3:1的分离比，与安徽品种进行回交得到的B1F1代中，分离比为1:1。结果表明，抗除草剂转基因小麦杂交与回交后代Bar基因的遗传，符合1对显性基因的分离比例和孟得尔遗传规律。
参考文献：
[1]. 小麦细胞操作与基因工程体研究[D]. 覃建兵. 华中科技大学. 2002
[2]. 多年生黑麦草基因转化与抗旱性遗传改良研究[D]. 李雪. 北京林业大学. 2008
[3]. 植物基因工程的风险评估与安全管理研究[D]. 刘经伟. 东北林业大学. 2004
[4]. 抗病信号传导基因RAR1在小麦抗病基因工程中的应用[D]. 廖勇. 四川农业大学. 2006
[5]. 蛋白质谷氨酰胺酶基因的合成、表达及性质研究[D]. 汪正华. 华东师范大学. 2013
[6]. 基因枪转化Anti-Trxs基因与转基因小麦后代的遗传分析[D]. 宋丽. 河南农业大学. 2004
[7]. 农杆菌介导小麦遗传转化体系的优化及盐生草耐盐基因在拟南芥中的功能验证[D]. 闫栋. 甘肃农业大学. 2018
[8]. 小麦遗传转化体系建立和优化及抗坏血酸过氧化物酶基因（Ta-APX）转化小麦研究[D]. 李明浩. 南京农业大学. 2010
[9]. 基因枪法导入GUS基因诱导小麦条锈菌毒性突变的研究[D]. 卢丽丽. 西北农林科技大学. 2008
[10]. 抗除草剂Bar基因导入小麦栽培品种的研究[D]. 张媛媛. 安徽农业大学. 2004