罗艳[1]2003年在《爪蟾卵母细胞人类LDLR基因表达系统的建立及姜黄素的干预作用》文中研究指明目的 ①在爪蟾卵母细胞中建立人类LDLR基因的表达系统及检测方法，作为降脂中药高效筛选的实验平台，在基因水平和受体水平上探讨降脂中药的作用机理及作用靶点。②探讨姜黄素对体外培养的爪蟾卵母细胞存活率的影响。研究姜黄素对人类LDLR基因在爪蟾卵母细胞中表达的影响。 方法 ①以含不同浓度姜黄素HBS培养液培养爪蟾Ⅴ、Ⅵ期卵母细胞，通过孕酮成熟实验以产生GVBD为判断标准来确定姜黄素对爪蟾卵母细胞体外培养存活率的影响。②通过注射台盼蓝的方法，建立爪蟾卵母细胞细胞核显微注射技术。③序列超离心法分离LDL(密度1.019-1.060)，Sepharose 6B凝胶过滤纯化，以改良的Larry法制备DiI-LDL荧光探剂。④用氯化钙法进行感受态的大肠杆菌的制备与转化，碱裂解法提取质粒DNA，进行人类LDLR基因表达质粒(p3.7LDL)的扩增和提取。⑤以PVS沉淀法和荧光免疫检测法，考察爪蟾V、V工期卵母细胞是否有内源性的LDLR。⑥以免疫荧光法及Di工一LDL(配体)荧光法检测p3.7LDL基因的表达，探讨人类LOLR基因是否能在爪蟾V、VI期卵母细胞中表达。⑦以免疫荧光法、Di卜LDL荧光法及免疫胶体金电镜检测人类LDLR基因在爪蟾V、VI期卵母细胞中的表达情况。⑧以ABC法定量测定姜黄素对人类LDLR基因在爪蟾v、v工期卵母细胞中的表达数量的影响。 结果①应用MBS培养液20℃培养3天后，爪蟾V、VI期卵母细胞生长良好，平均存活率达95%;应用MBS培养液20℃培养3天后，经细胞核显微注射的爪蟾V、VI期卵母细胞生长良好，平均存活率达92%;应用姜黄素浓度低于0.O06mg/ml的含姜黄素MBS培养液20℃培养3天后，生长良好，平均存活率达90%。②爪蟾V、VI期卵母细胞的核注射成功率为96%。③自制的荧光探剂Di工一LDL具有良好的LDLR配体活性，可用于爪蟾V、VI期卵母细胞膜上LDLR蛋白表达的检测。④载有人类LDLR基因的表达质粒p3.7LDL，通过核注射法导入爪蟾V、VI期卵母细胞中，2天后可检测到爪蟾细胞膜上表达的人类LDLR。⑤实验未见爪蟾V、VI期卵母细胞膜上有内源性的LDLR。⑥注射了人类LDLR基因的爪蟾卵母细胞膜上有LDLR，说明人类LDLR基因可在爪蟾V、VI期卵母细胞中表达。⑦0.9 pg/m1浓度的姜黄素可显着提高人类LDLR基因在爪蟾卵母细胞人类LDLR基因表达系统中受体蛋白的表达数量。 结论①爪蟾V、VI期卵母细胞未见内源性LDLR，不存在对外源人类LDLR基因表达的干扰作用。通过核注射的方法导入人类LDLR基因，建立的爪蟾卵母细胞人类LDLR基因表达系统，可作为研究筛选降脂中药的实验平台，并从细胞及基因水平上探讨多种降脂中药的作用机理和作用靶点。②降脂中药提取物姜黄素可能通过增加爪蟾卵母细胞LDLR的表达量而起到降脂作用。
窦晓兵[2]2007年在《姜黄素对肝细胞LDLR表达作用的分子机理研究》文中进行了进一步梳理血液中胆固醇特别是LDL-C浓度的升高是引起动脉粥样硬化和冠心病的最主要危险因素，降低血液胆固醇浓度可明显减少冠心病的发病率和死亡率。体内大部分胆固醇结合于LDL，经肝细胞表面的LDLR代谢和清除。LDLR是位于细胞表面的跨膜受体，其表达受到胆固醇和其它许多物质在转录水平或转录后水平的调控，上调肝脏LDLR的表达是降低血液胆固醇浓度的最主要手段。目前临床应用最广泛的能上调肝脏LDLR表达的药物是他汀类，他汀类药物能竞争性抑制HMG-CoA还原酶的活性，使细胞内胆固醇合成减少。总体来讲他汀类具有出色的降胆固醇疗效，但是也有部分患者因不良反应(如肝功能损害等)不能耐受其治疗。因此，筛选新型降胆固醇药物一直是调血脂药物的研究重点。目的：通过对传统中草药物的筛选，我们发现从活血化瘀药姜黄中提取的姜黄素能显着降低血清胆固醇、LDL-C含量的作用，从而起到降血脂和抗动脉粥样硬化的作用。为了研究姜黄素降胆固醇作用的分子机制，我们设计了一系列实验。本课题就是在以往研究的基础上，拟从基因表达水平和细胞信号调控角度探寻姜黄素与信号调控途径中关键蛋白分子以及基因调控元件间的相互作用关系，从而阐明姜黄素对LDLR表达影响的机理。方法：第一部分姜黄素诱导LDLR表达的药效研究首先利用人肝HepG2细胞作为LDLR基因表达检测系统，经姜黄素干预培养后，利用Western-Blot、Rt-PCR、荧光显微镜和流式细胞仪等技术分析肝细胞内源性LDLR蛋白的表达量及其表达活性，确定姜黄素对LDLR基因表达的影响，从受体蛋白水平阐明姜黄素降胆固醇作用的机理。第二部分姜黄素诱导LDLR表达的机理研究：①将绿色荧光蛋白GFP报告基因构建在调控低密度脂蛋白受体基因表达的固醇调控元件SRE-1的下游，经脂质体介导法导入HepG2细胞，建立LDLR基因表达的固醇调控报告系统及其稳定细胞株HepG2／SRE-GFP，通过姜黄素的干预培养，从基因表达调控水平研究姜黄素对启动子SRE-1的影响，探寻姜黄素的作用机理。②利用脂质体介导法将pCMV-Insig2导入HepG2细胞，建立稳定的细胞株HepG2／Insig2，通过姜黄素的干预培养，研究姜黄素对Insig-2的影响，从信号调控通路水平探寻姜黄素降胆固醇作用可能的分子或基因靶点。结果：第一部分研究表明，①姜黄素能够增强HepG2 LDLR对LDL的摄取，具有明显的时间依赖性和剂量依赖性。并且在25μmol／L和作用24小时的时候LDLR的活性最强。②姜黄素能够显着促进HepG2 LDLR的表达量，具有明显的时间依赖性和剂量依赖性。③姜黄素可能通过促进HepG2 LDLR mRNA的转录上调LDLR的表达。第二部分研究结果表明，①姜黄素能够激活启动子调控元件SRE-1上调LDLR表达。②一定浓度的姜黄素能够通过逆转受Insig2抑制的SREBP通路，上调LDLR的表达。结论：综上所述，我们从受体水平、基因表达水平到信号调控通路水平对姜黄素降胆固醇的机理进行了一系列研究。所有证据都证明姜黄素很可能是通过作用于SREBP通路中的某个调节因子，促使LDLR表达起到降胆固醇作用的。但是究竟作用于SCAP还是Insig2或者其它蛋白仍有待进一步研究。
范春雷, 钱颖, 卢德赵, 沃兴德, 高丽萍[3]2005年在《爪蟾卵母细胞固醇调控报告系统的建立及中药降脂作用研究》文中研究说明目的在爪蟾卵母细胞中建立低密度脂蛋白受体基因表达的固醇调控报告系统,通过中药的干预培养,从基因调控水平上阐明中药降脂作用的机理,并为药选提供一个可靠的实验平台．方法将绿色荧光蛋白报告基因构建在调控低密度脂蛋白受体基因表达的固醇调控元件的下游,经显微注射导入爪蟾卵母细胞,在分别用含姜黄素、茶多酚等中药的培养液中培养3天后, 用荧光显微镜及荧光分析仪对绿色荧光蛋白的表达情况进行定性定量分析．结果姜黄素诱导了绿色荧光蛋白的表达．结论 1．姜黄素可以通过影响固醇调控元件的作用上调低密度脂蛋白受体基因的表达;2．建立的固醇调控报告系统可作为降胆固醇药物筛选和作用机理研究的实验平台．
范春雷, 钱颖, 卢德赵, 沃兴德, 高丽萍[4]2006年在《爪蟾卵母细胞固醇调控报告系统的建立及中药调脂作用研究》文中提出目的在爪蟾卵母细胞中建立低密度脂蛋白受体基因表达的固醇调控报告系统,通过中药的干预培养,从基因调控水平上阐明中药调脂作用的机制,并为药物筛选提供一个可靠的实验平台。方法将绿色荧光蛋白报告基因构建在调控低密度脂蛋白受体基因表达的固醇调控元件的下游,经显微注射导入爪蟾卵母细胞,在分别用含姜黄素、茶多酚等中药的培养液中培养3d后,用荧光显微镜及荧光分析仪对绿色荧光蛋白的表达情况进行定性定量分析。结果姜黄素诱导了绿色荧光蛋白的表达。结论①姜黄素可以通过影响固醇调控元件的作用上调低密度脂蛋白受体基因的表达；②建立的固醇调控报告系统可作为降胆固醇药物筛选和作用机制研究的实验平台。
参考文献：
[1]. 爪蟾卵母细胞人类LDLR基因表达系统的建立及姜黄素的干预作用[D]. 罗艳. 浙江中医学院. 2003
[2]. 姜黄素对肝细胞LDLR表达作用的分子机理研究[D]. 窦晓兵. 北京中医药大学. 2007
[3]. 爪蟾卵母细胞固醇调控报告系统的建立及中药降脂作用研究[C]. 范春雷, 钱颖, 卢德赵, 沃兴德, 高丽萍. 浙江省生物化学与分子生物学学术交流会论文集. 2005
[4]. 爪蟾卵母细胞固醇调控报告系统的建立及中药调脂作用研究[J]. 范春雷, 钱颖, 卢德赵, 沃兴德, 高丽萍. 中国药学杂志. 2006