刘海燕[1]2002年在《固定化木瓜蛋白酶及其动力学性质的研究》文中提出固定化酶是二十世纪七十年代迅速发展起来的一个新的科技领域。它的产生和发展不仅打破了生物化学的传统概念，也给工业革命带来了强大的动力。本文工作旨在用两种不同的方法对木瓜蛋白酶进行固定化，同时以酪蛋白为底物，研究了固定化条件对酶活力回收的影响，并比较了固定化酶和溶液酶的动力学性质。 首先，以硅胶为载体，γ-环氧丙基氧丙基叁甲氧基硅烷为偶联剂，对木瓜蛋白酶进行了固定化。最适固定化条件如下：温度为25℃，pH为8.0，时间为18 h，酶量为每克环氧化硅胶固定化240mg酶。同时以酪蛋白为底物，研究了固定化条件对酶活力回收的影响，并比较了固定化酶和溶液酶的动力学性质，结果表明：固定化酶的最适pH值和最适温度都比溶液酶有所提高，且有较好的操作稳定性。 重氮化法是固定化酶的一种重要方法，在用多孔玻璃等无机载体时，一般是先用γ-氨丙基叁乙氧基硅烷与多孔玻璃等载体反应，生成烷基胺玻璃，然后与对硝基苯酰氯反应，产物经还原，转变为带有芳胺的衍生物，再进行重氮化。本文以硅胶为载体，与γ-氨丙基叁乙氧基硅烷反应后，再和对氨基苯甲酸反应，直接生成芳胺的衍生物，通过在新合成的载体上对木瓜蛋白酶进行固定化，研究了固定化条件对酶活力回收的影响，最适固定化条件如下：pH为7.0，时间为6h，酶量为每克载体固定化288mg酶，并比较了固定化酶和溶液酶的有关性质，考察了固定化酶的操作稳定性。结果表明，用这种方法合成的载体固定化酶，其对热稳定性、操作稳定性及产率都比较理想。
曹诗林[2]2016年在《磁性纤维素纳米晶固定化酶的制备及应用研究》文中研究说明酶是高效的生物催化剂,在许多的工业领域都具有巨大的应用前景。然而,由于游离酶存在价格昂贵、操作稳定性低等缺点,其在工业上的应用受到了一定的限制。使用新型的酶载体和新的固定化方法对酶进行固定化是解决上述问题的有效途径。纤维素纳米晶(NCC)是近年来兴起的天然高分子纳米材料,具有作为酶载体的潜力,由于其在水溶液中稳定分散,难以从反应体系中快速分离。因此,研发制备均一稳定磁性纤维素纳米晶(MNCC)的方法,并将其作为酶载体通过新型酶固定化技术制备高催化活性、高稳定性的固定化酶催化剂具有重要的意义。二肽是一类重要的生物活性肽,在医药、食品、化妆品等领域有重要的应用。在众多二肽合成方法中,酶法是一种绿色环保的方法。但是,酶法制备存在以下问题:水相反应副产物多产率低、有机相反应对酶有不同程度的失活作用,酶操作稳定性差。因此,研究新型绿色介质——深度共熔溶剂中的固定化酶催化二肽合成反应是一个很有意义的课题。本文的主要研究成果如下:本研究通过共沉淀-静电自组装法以及共沉淀-交联法制备了两个系列的磁性纤维素纳米晶(分别为MNCC-A和MNCC-B)。结果表明,MNCC呈现棒状形貌,Fe3O4 MNP较均匀地分布在MNCC表面。MNCC同时具有NCC和Fe3O4的特征衍射峰,但Fe3O4的峰强度明显减弱。与MNCC-A相比,通过共沉淀-交联法制备的MNCC-B使用环氧氯丙烷替代叁聚磷酸钠作为分子间交联剂,使MNCC-B的最高磁饱和强度比MNCC-A有所提高(10.1 emu/g v.s 6.9 emu/g)。在制备过程中增加铁盐的量或者减少壳聚糖的量可有效提高材料的磁饱和强度。通过机理分析表明:(1)Fe3O4与壳聚糖之间、壳聚糖与NCC之间的静电相互作用是共沉淀-静电自组装法制备MNCC-A的驱动力;(2)NCC与壳聚糖之间的静电相互作用以及环氧氯丙烷对NCC和壳聚糖的交联作用是共沉淀-交联法制备MNCC-B的两个阶段的主要驱动力。结果表明,两种制备MNCC的方法是可行的。为了考察MNCC酶载体对酶固定化的效果,本研究通过传统活化交联法将木瓜蛋白酶固定化在MNCC-B-3表面得到PA-c-MNCC。在最优条件下得到的固定化酶相对酶活回收率为74.5%,MNCC蛋白负载量为8.9 mg/g。PA-c-MNCC的最适pH为7.0(游离酶为6.0),最适温度为60 oC(与游离酶一致)。PA-c-MNCC的反应表观活化能(Ea)与游离酶相比有所降低,最适底物浓度比游离酶显着降低。PA-c-MNCC的pH稳定性、热稳定性、储存稳定性、有机溶剂耐受性等均优于游离酶。为了进一步提高酶在mncc载体的负载量以及酶活回收率,本研究通过沉淀-交联法将一种国产木瓜蛋白酶固定化在mncc-b-3表面得到pa@mncc。沉淀-交联法的最优的固定化条件为:4oc下将4.5mgmncc分散在0.5mlph7.0pbs中,向其中加入1.5mg木瓜蛋白酶。在搅拌下加入7.5ml乙醇,随后加入1.9wt%戊二醛在-10oc下交联2h,所得pa@mncc的酶载量为333mg/gmncc载体,酶活回收率约为80.1%。pa@mncc的最适ph为7.0(游离酶为6.5),最适温度为75oc(比游离酶提高5oc)。pa@mncc具有较游离酶低的温度敏感性以及较高的底物亲和性。此外,pa@mncc的ph稳定性、温度稳定性、储存稳定性、有机溶剂耐受性相比游离酶均有显着提高。通过固定化酶与游离酶的二级结构含量对比研究表明,酶在经过沉淀-交联法固定化在mncc载体后,酶结构中-螺旋含量增加、无规卷曲含量减少,-折迭和-转角结构无明显变化。因此,固定化酶稳定性的增加可能固定化后-螺旋含量的增加所导致的结构刚性增加。利用沉淀-交联法对5种常见的酶进行固定化,结果表明沉淀-交联法固定化酶具有一定的普适性。结果表明,沉淀-交联法是一种有效、可行的酶固定化方法。利用gromacs分子动力学模拟软件,对叁种磁性纤维素纳米晶的典型片段与木瓜蛋白酶相互作用进行分子动力学模拟。结果表明,酶与mncc之间存在相互作用,使得体系势能下降、体系越稳定,酶与mncc间的平均距离减小。此外,pa与cellulose-so4片段以及cellulose-chitosan片段以静电作用为主,pa与cellulose片段以氢键作用为主。pa-mncc相互作用过程酶结构稳定性的增加可能由于:(1)mncc与木瓜蛋白酶分子之间形成的氢键部分替代了木瓜蛋白酶与水分子之间形成的氢键;(2)木瓜蛋白酶活性中心中his159-asn175氨基酸残基对的距离显着减小。此外,研究了pa-mncc模拟相互作用前后酶二级结构含量的变化,结果表明,相互作用后α-螺旋含量增加,无规卷曲减少。本文首次报道了含氯化胆碱/尿素des介质中游离及固定化木瓜蛋白酶催化苄氧羰基-丙谷二肽(z-ala-gln)合成反应。结果表明,固定化酶pa@mncc催化z-ala-gln的最优条件为:含水量16.6%,反应温度50oc,亲核试剂gln与酰基供体z-ala-ome摩尔比2.5-3,tea浓度560mm,在该条件下z-ala-gln产率为71.5%;此外,固定化酶在进行10次操作循环后仍然有80%左右的剩余酶活。以上述反应体系为基础,研究了苄氧羰基-肌肽(z-ala-his)在氯化胆碱/尿素des介质中的酶促合成反应。研究表明,在最优反应条件下z-ala-his的产率约为68.4%;此外,本研究对比了不同氢键供体的氯化胆碱类des中酶催化z-ala-his的产率。结果表明,对比叁种醇类des中的Z-Ala-His合成产率可知,在粘度大的DES中,酶催化Z-Ala-His的产率较低。基于PA@MNCC酶催化剂和深度共熔溶剂新型反应介质的酶促二肽合成方法是可行的。本研究不仅丰富了固定化酶相关领域的理论知识,还提供了酶法制备二肽的行之有效的新途径。
肖宁[3]2005年在《介孔分子筛MCM-41固定化酶的研究》文中认为本文以具有较高的比表面、较大孔径及表面富含弱酸性羟基的介孔分子筛MCM—41为载体,戊二醛为交联剂,采用共价交联法固定化木瓜蛋白酶和胰蛋白酶。 首先筛选出木瓜蛋白酶的最适固定化方法,通过对影响固定化木瓜蛋白酶效果的两个因素的研究,筛选出具有最适孔径的载体。以此载体固定化木瓜蛋白酶,优化了固定化条件,结果表明:当每g载体的给酶量为20mg,固定化温度10～20℃,固定化时间2h,pH7.0,戊二醛体积分数0.75%时,木瓜蛋白酶的固定化效果最好,此时平均酶活性回收率达55%左右。 其次,比较了游离酶及固定化酶的催化特性。结果表明:固定化酶的最适pH值为7.5,最适反应温度为75℃;固定化酶对尿素和有机溶剂的稳定性、pH稳定性、热稳定性、贮藏稳定性等与游离酶相比都有显着的提高。并对固定化木瓜蛋白酶的简单动力学常数和固定化酶反应器做了初步探讨,结果表明:固定化酶和游离酶的米氏常数值分别为游离酶3.017g/L,固定化酶0.898g/L;尝试了固定化木瓜蛋白酶填充床反应器,测得固定化酶的操作半衰期为26天。 最后以MCM-41为载体固定化胰蛋白酶,优化了固定化条件,并研究了固定化酶部分催化特性。结果表明:当每g载体的给酶量为30mg,固定化温度15℃,固定化时间3h,pH8.0,戊二醛体积分数0.4%时,胰蛋白酶的固定化效果最好,此时平均酶活性回收率达60%左右。固定化酶的热稳定性、对盐酸胍的稳定性、pH值稳定性与游离酶相比都有了显着的提高,并且固定化酶具有较好的间歇操作稳定性,连续反应10批后,酶剩余活性仍保持在80%以上。
吴文兵[4]2007年在《氨基磁性微球制备及其固定化木瓜蛋白酶应用研究》文中提出磁性微球(Magnetic Microspheres)是以磁性Fe_3O_4等物质为核，高分子化合物为壳的一种新型复合功能材料。微球兼具超顺磁性及尺寸小、偶联容量大、扩散速度快和悬浮稳定性高等优点，逐渐成为生物学等领域的重要研究共具。本文就氨基磁性微球的制备、表征、固定化木瓜蛋白酶及其在改良啤酒品质上的应用进行了研究。1．油酸包被纳米磁性Fe_3O_4的制备采用化学共沉淀法制备得到了平均粒径5-10nm，饱和磁化强度55emu／g，具有立方晶系结构的油酸包覆的超顺磁性Fe_3O_4。该合成方法简单快速，产物剩磁和矫顽力都接近0，且粒度比较均匀。油酸包被的Fe_3O_4用作磁性微球的磁核。2．氨基磁性微球的制备采用分散聚合法制得了粒径约40nm，饱和磁化强度50emu／g的环氧基团修饰的磁性微球，并经进一步氨化处理得到了氨基磁性微球。线性电位滴定法计算表明该微球的氨基含量为486μmol／g。3．氨基磁性微球固定化木瓜蛋白酶及其应用研究磁性氨基微球用于木瓜蛋白酶的固定化研究，探索了酶的最佳固定化条件，比较了固定化酶和溶液酶性质的异同。结果表明，酶浓度1.2mg／ml、戊二醛浓度5％、固定化反应时间4h时酶的催化活性最高；固定化酶与底物结合能力是溶液酶的7倍，最适反应pH分别为6.8和7.2，最适反应温度分别为77℃和67℃。4℃保存30天后，固定化酶和溶液酶的活力分别为初始酶活力的98％和91％。经5次回收利用后，固定化酶的活力依然可保持在初始酶活力的97％。固定化木瓜蛋白酶用于啤酒中蛋白质的降解研究，以提高其色泽和透明度，改善啤酒品质。结果表明啤酒的浑浊度降低了0.013个单位，啤酒中各种游离氨基酸的量有不同程度的增加。磁性固定化木瓜蛋白酶水解啤酒中的蛋白质，具有高效、快速、可实现酶与啤酒分离等优点。
李丽[5]2011年在《纳米二氧化硅介入对酶活性、酪蛋白磷酸肽制备以及活性保护的影响》文中进行了进一步梳理天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用。虽然用传统的微米级载体对酶进行固定化能提高酶的稳定性,但是,酶在大载体表面变性程度比较大,会使固定化酶活力很低。采用纳米颗粒和酶技术结合制备新型的固定化酶,在提高酶稳定性的情况下可最大限度的保持原有酶活。这种方法简化了工艺、降低了成本、减少了污染,对工业化生产有着极大的意义。本课题研究了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和α-淀粉酶以不同粒径二氧化硅颗粒为载体制备固定化酶时,pH、酶/载体质量比、载体粒径等对固定化酶性质的影响;之后以胰蛋白酶为模型酶,从动力学角度深入研究固定化后酶生物活性的变化;采用固定化胰蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白磷酸肽(CPPs),比较特殊条件下和游离胰蛋白酶制备CPPs得率的差异;同时,将这种纳米颗粒吸附对酶分子的保护作用应用到对活性肽CPPs的保护,分析纳米颗粒吸附对CPPs生物活性的影响。主要研究结果如下:(1)酶在二氧化硅颗粒表面的吸附量受pH和载体粒径的影响。在酶和载体等电点之间的pH,吸附量比较高。本研究确定的酶和载体的吸附条件分别是:酶/载体(w/w)=1:1,室温吸附3 h,胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和α-淀粉酶的最佳吸附pH分别是7.8,6.0和6.0,在该pH下在20 nm二氧化硅颗粒表面对应的吸附量分别是69.0 mg/100mg SiO2,87.3 mg/100mg SiO_2和76.9 mg/100mg SiO_2。同样条件下,载体粒径越小,酶在其表面的吸附量越高。(2)载体二氧化硅颗粒的粒径对固定化酶的相对活力有显着的影响。固定化酶的相对活力随载体粒径的增加而降低。胰蛋白酶在与微米,300 nm,100 nm和20 nm二氧化硅吸附后相对活力分别是40.7%,46.7%,56.3%和61.4%。木瓜蛋白酶在与微米,300 nm,100 nm和20 nm二氧化硅颗粒吸附后相对活力分别是47.5%,54.1%,58.8%和73.3%。α-淀粉酶在与微米,300 nm,100 nm和20 nm二氧化硅颗粒吸附后相对活力分别是57.5%,61.7%,66.0%和68.1%。除此之外,3种酶固定化后酶的pH和热稳定性也得到了不同程度的提高。pH和热稳定性提高幅度和载体粒径密切相关,同样条件下表现为载体粒径越小,固定化酶pH和热稳定性越强。在90℃处理1 h后,微米二氧化硅和20 nm二氧化硅颗粒固定的胰蛋白酶活力较游离酶分别提高了19.3%和41.6%。在pH 2.0的强酸环境下处理1 h后,微米二氧化硅和20 nm二氧化硅颗粒固定的α-淀粉酶较游离酶分别提高了2倍和2.8倍。(3)固定化后胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和α-淀粉酶表面疏水性发生了不同程度的变化。并且同等吸附时间时,微米固定化酶表面疏水性要高于纳米固定化酶。吸附3 h后,微米二氧化硅固定化胰蛋白酶和20 nm二氧化硅固定化胰蛋白酶的H0值较游离酶分别提高了25.5%和15.5%;对于木瓜蛋白酶对应的值7.2%和4.2%;α-淀粉酶对应的值18.7%和10.8%。叁种酶中,在20 nm二氧化硅表面吸附后,酶活保持率最高的是木瓜蛋白酶,而这种酶表面疏水性的变化幅度也是最小的。表面疏水性的变化幅度和酶活保持率是成负相关的。(4)分别用游离胰蛋白酶和固定化胰蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白磷酸肽(CPPs)。在较强的酸性(pH 2.0~5.0)、较强的碱性(pH 11.0~12.0)和高温(60℃~ 80℃)条件下,固定化胰蛋白酶制备CPPs的得率要明显高于游离胰蛋白酶。并且同样条件下,纳米载体固定化胰蛋白酶制备CPPs的得率高于微米载体。在pH 2.0时,微米二氧化硅和20 nm二氧化硅颗粒固定化胰蛋白酶制备CPPs的得率较游离酶分别提高了2.9倍和5.5倍;80℃时,提高的百分比分别是62.9%和35.0%。(5)吸附作用对胰蛋白酶的动力学常数有显着的影响。从动力学的角度可以看出,在极端不良的反应条件下(pH<5.0或温度高于50℃时),固定化酶开始表现出优势。由于吸附作用尤其是纳米颗粒吸附对酶分子结构的稳定作用,高温和极酸条件下纳米颗粒吸附的酶仍然对底物有较高的亲和能力,保持着较高的反应速度。在80℃,pH 7.8时,微米二氧化硅固定化酶Vm较游离酶提高了13.35%,Km降低了8.81%,而20 nm二氧化硅固定化酶Vm较游离酶提高了23.61%,Km降低了13.09%。在pH 2.0,37℃时,微米二氧化硅固定化酶Vm较游离酶提高了32.76%,Km降低了32.26%,而纳米二氧化硅固定化酶Vm较游离酶提高了47.82%。(6)纳米颗粒的保护作用不仅能作用于酶分子,对活性肽的保护发挥出同样的优势。以CPPs阻止磷酸钙沉淀能力为检验指标,游离CPPs、纳米颗粒吸附CPPs和微米颗粒吸附CPPs分别经过强酸或高温处理后,其阻止磷酸钙沉淀能力表现为:纳米颗粒吸附CPPs>微米颗粒吸附CPPs>游离CPPs。经过pH 3.5的酸处理3 h后,微米二氧化硅和20 nm二氧化硅颗粒吸附的CPPs较游离CPPs阻止磷酸钙沉淀时间分别提高了14.2%和36.8%。而100℃处理1 h后,提高的百分比分别是8.5%和34.2%。这说明二氧化硅颗粒吸附作用能保护CPPs构象的稳定,使CPPs对酸和高温的稳定性大大提高。而且这种保护作用与二氧化硅颗粒的粒径大小有很大关系,在本课题研究的粒径范围内,二氧化硅颗粒越小这种效果也显着。
高波[6]2005年在《介孔材料组装酶蛋白的研究》文中研究表明本论文对介孔材料组装酶蛋白进行了较为系统的研究,首先合成了不同孔径的介孔材料并进行了表面修饰,以介孔材料为载体进行了多种酶的组装的研究。对固定方法,酶蛋白固定量、催化活性、固定化酶的性质和稳定性进行了深入的研究。其中,首次用冷冻-真空吸附法对酶蛋白进行了成功组装,为介孔分子筛组装酶蛋白提供了一种新的实验方法,该方法在控制合适真空度的情况下,在保持酶活性的同时,组装量巨大,远远高于浸渍法及其它常见方法。首次运用能谱手段对酶蛋白在介孔材料上的固定位置进行表征,结果表明透射电镜能谱和扫描电镜能谱联合进行固定化酶活性定位这一手段完全可行,解决了由于杂蛋白、杂质进入孔道而造成的酶蛋白用普通手段,如N2吸附、UV 光谱等手段无法表征的难题。对在工业上应用较大的青霉素酰化酶、脂肪酶进行了固定,尤其在稳定性方面进行了深入研究,研究发现固定化酶的稳定性与介孔材料的孔径关系较大,当介孔材料的孔径与酶分子的大小接近时,稳定性较高。通过对介孔材料的修饰,用交联法固定时,固定化酶的操作稳定性好,可多次反复应用,显示了较好的工业应用前景。利用介孔材料固定化酶稳定性高的优点,本论文最后进行了非水催化的研究,首次在有机介质中成功进行了肽合成,并发现介孔材料的孔道表面性质对合成影响巨大。通过介孔材料固定辣根过氧化物酶成功进行了高分子聚合物聚苯胺(PANI)的合成,得到结构特殊的邻位聚苯胺纳米棒和管。
夏葵[7]2009年在《尼龙6膜固定化生物催化剂及其应用》文中认为尼龙6 (PA 6)膜为耐水、有机溶剂和溶胀的高分子聚酰胺膜,具有良好孔径分布及机械强度,来源广,价格便宜。由于其末端氨基较少,对蛋白质有强烈的非特异性吸附,成为非常有前途的细胞和酶固定化载体。壳聚糖是甲壳素经脱乙酰化反应而得到的一种生物高分子,由于其无毒、可生物降解和良好的生物相溶性等优良特性。已在功能材料包括生物材料等方面得到广泛应用。但由于壳聚糖只能溶于酸性水溶液,难溶于水,在很大程度上限制了它的应用。所以水溶性壳聚糖衍生物的研制正成为一个新的研究方向。手性2-辛醇常被用于精细有机合成、香料和某些特种材料。它是制备高性能液晶和液晶器件的重要手性材料同时它也是合成类固醇、维生素E和昆虫性外激素(生物杀虫剂)等许多光学活性药物和农药的重要中间体。论文考察了在浸润条件下,戊二醛交联的PA 6膜固定化木瓜蛋白酶。对固定化条件进行了优化。结果表明,4℃、pH 6.0条件下,将膜载体浸润于2 mg/mL酶液中5 h,固定化酶活为303.4 U/g。固定化酶最适反应pH和反应温度分别为6.0~7.0和65℃。其pH稳定性、热稳定性均高于游离酶。从热力学和动力学角度探讨了吸附机理,其等温吸附过程符合Freundlich和Langmuir模型,288 K、pH 6.0时,PA 6膜对木瓜蛋白酶的饱和吸附量为1.692 mg/g。动力学吸附过程符合准二级动力学方程。以PA 6膜固定化木瓜蛋白酶降解壳聚糖。探讨了温度、pH、底物浓度和时间对酶降解壳聚糖的影响,2.5 h时即可得到分子量小于4万的壳寡糖。该酶降解的最适温度、pH和底物浓度分别为50℃、pH 5.0和0.1 g/mL。同时研究了辐照剂量对壳聚糖降解的影响,并对辐照前后壳聚糖的结构进行了表征。UV、FTIR分析表明,辐照后除壳聚糖分子生成羰基外,壳聚糖主链结构未见变化,脱乙酰度也没有显着改变,显示出辐射降解是一种有效的控制壳聚糖分子量方法。选用2-辛酮为模型底物,用PA 6膜吸附法对增殖培养的面包酵母进行了固定化。研究表明:蔗糖是最佳辅助底物,二氯甲烷是最佳有机相,当采用300 mmol/L的Tris-HCl缓冲液、60 mmoL/L的蔗糖、二氯甲烷与缓冲液体积比5/30,2-辛酮转化率>80%,e.e.值为97%。
贾倩[8]2013年在《新型柔性树脂载体的合成及对木瓜蛋白酶的固定化研究》文中研究说明固定化酶不仅能保持游离酶高效、专一、温和的催化反应特性,还具有稳定性高、易分离回收、可重复使用、工艺简便、操作连续可控等优点,成为生物技术研究中最活跃的领域之一。而现有的酶固定化技术存在一定的不足,因此,合理选择和设计性能优良的固定化载体和简单有效的固定化方法对固定化酶的应用具有重要意义。本论文在综述了国内外传统酶固定化方法和固定化载体研究进展的基础上,总结出共价结合法是目前研究最为活跃的固定化方法之一,但该方法所得到的固定化酶活回收率偏低,本文在前人研究基础上采用酶的柔性共价结合固定法。这样可以减少酶在固定化过程中因刚性碰撞造成的酶活损失,同时又可最大限度地保留酶游离态的均相催化活性。从而解决共价结合法固定化酶活力回收率偏低的问题。因此本文选择具有比表面积大、稳定性高、机械强度高、表面含大量活泼氰基(C≡N)的大孔交联聚丙烯腈树脂微球(RAN)为研究对象,通过化学改性的方法,分别接枝具有亲水性的四乙烯五胺(TEPA)和氨基葡萄糖(GA)功能基,合成两种新型柔性树脂载体：PAN-TEPA和PAN-GA,用于木瓜蛋白酶的柔性固定化研究。本课题对柔性树脂载体的合成条件、酶固定化过程中的主要影响因素以及固定化酶和游离酶的一些酶学性质进行了研究,并得到了较好的结果,主要研究内容如下：1.以聚丙烯腈树脂微球为母体,四乙烯五胺和氨基葡萄糖作为柔性功能基,通过化学改性的方法,合成了两种具有不同功能基的新型柔性树脂载体(PAN-TEPA和PAN-GA)。探讨了反应溶剂、反应温度、反应物质量比和反应时间对树脂增重率的影响,确定了合成反应的最佳工艺条件。应用元素分析(EA)、红外光谱(FT-IR)、热重(TGA)等分析手段,对合成树脂结构进行了表征。推断柔性树脂载体的合成路径为柔性功能基中的氨基通过与聚丙烯腈微球中的氰基发生亲核加成反应而接枝到聚丙烯腈母体上,该反应原子利用率高,较好的体现了绿色化学的特征。2.以合成的两种新型柔性树脂(PAN-TEPA和PAN-GA)为载体,木瓜蛋白酶为模拟生物蛋白分子,进行固定化工艺条件的探索。通过单因素试验,研究了载体活化条件、固定化pH、给酶量、固定化温度以及固定化时间对木瓜蛋白酶固定化效果的影响。在单因素基础上,采用响应面分析法(RSM)对酶固定化工艺条件进行了进一步的优化,得到固定化酶制备的最佳工艺。PAN-TEPA载体：固定化pH6.7,加酶量1.0mg/10.0mg,固定化温度31℃；PAN-GA载体：固定化pH7.3,加酶量1.47mg/10.0mg,固定化温度31℃。在最佳优化条件下,PAN-TEPA、PAN-GA固定化酶活力分别为4.745U/mg和5.855U/mg,酶蛋白固载量分别为56.7mg/g和72.9mg/g,酶活力回收率达到了71.3%和80.6%。说明PAN-TEPA、PAN-GA作为酶的固定化载体具有潜在的应用价值。3.以酪蛋白为催化反应底物,通过游离酶和固定化酶的酶学性质实验,考察了木瓜蛋白酶经载体固定化后对酶催化活性的影响,为实际应用提供一些理论依据。结果表明：两种载体(PAN-TEPA和PAN-GA)固定化木瓜蛋白酶后,酶最适反应温度由50℃提高到60℃,且固定化酶在50℃～80℃范围内都保持了较高的酶活力。游离酶和固定化酶的最适pH值分别为6.5和7,且酶活最适pH范围从pH6-7延伸为pH5-9,增加了酶催化反应pH的波动范围。固定化酶的动力学米氏常数Km值有所减小,说明木瓜蛋白酶经载体固定化后对底物酪蛋白的亲和力增加。酶在固定化后的失活半衰期t1/2显着延长,从4.9d(游离酶)延长到28.4d (PAN-TEPA):和26.7d (PAN-GA).固定化酶的热稳定性、贮藏稳定性和对有机溶剂的耐受性都明显高于游离酶。固定化酶还具有重复使用稳定性,在循环使用8次后,仍能保持60%以上的活性。本课题采用的新型柔性树脂载体和固定化方法为木瓜蛋白酶提供了一种友好的微环境,能够较好的保持酶蛋白分子的生物活性及催化活性,具有一定的应用价值。
刘瑶[9]2007年在《葡聚糖磁性微球的制备及固定化木瓜蛋白酶的研究》文中进行了进一步梳理天然高分子磁性微球是近20多年发展起来的一种新型多功能材料，并已在生物化工、细胞学、生物医学工程等领域得到了广泛应用。其中，葡聚糖磁性微球由于其优良的生物相容性和生物可溶性，骨架材料性质稳定，强度较高和无毒副作用等优点而受到越来越多的关注。高分子葡聚糖上的活性基团经过表面修饰可以负载多种功能分子(酶、抗体、肽、DNA及RNA)，从而可制备多功能磁性复合物，作为新型的功能材料在酶的固定化、靶向药物、细胞分离和免疫测定等领域得到了广泛应用。(1)采用反相悬浮包埋技术，以纳米铁粉作磁核、环氧氯丙烷为交联剂制备了葡聚糖磁性微球。用透射电镜、原子力显微镜、激光粒度分布仪和红外光谱仪等对其进行形貌观察和结构表征，并测定了表面活性基团的数量和对蛋白的吸附量。结果表明，制备的微球比表面积大，粒径分布均匀，稳定性和磁响应性好，大小两种粒径的磁性微球(615nm和193nm)的表面活性基团数分别为9.23μmol／g(5.56×10~(15)个—OH／mg)和11.32μmol／g(6.81×10~(15)个—OH／mg)，吸附蛋白量为36.02mg／g(3.19×10~(14)个／mg)和53.62mg／g(4.75×10~(14)个／mg)，活性基团数从理论上完全能满足检测要求，可用于细胞分离和免疫分析。(2)以木瓜蛋白酶为模拟生物蛋白分子，利用共价结合法固定化木瓜蛋白酶，通过对比溶液酶和固定化酶的酶学性质，考察了固定化过程对酶蛋白结构和活性上的影响，为实际应用提供参数。结果表明大小两种粒径的磁性微球(615nm和193nm)固定化酶后，酶蛋白载量分别为21.3mg／g和23.5mg／g，表观米氏常数K_m~(app)分别为0.16mg／mL和0.12mg／mL，磁性固定化酶的最适温度、热稳定性和贮存稳定性等都明显优于溶液酶，溶液酶经固定化后可连续重复使用提高利用效率，稳定性得到提高。实验证明，木瓜蛋白酶固定在葡聚糖磁性微球上后，其活性中心没有受到明显影响，仍具有催化活性，对变性剂的抵抗能力大为提高，我们认为固定化能保持酶蛋白分子的生物活性，葡聚糖磁性微球可作为一种优良的磁性载体材料用于细胞分离和免疫分析。
郭锐[10]2009年在《固定化纤维素酶的制备及其性质研究》文中研究指明纤维素是地球上最丰富的可再生资源，纤维素酶是降解纤维素的一组酶系的总称，主要用于医药、纺织、日用化工、造纸、食品发酵、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理及饲料等领域。纤维素酶及其作用的底物非常复杂，影响因素繁多，水解速度缓慢，酶解效率不高，酶的利用率低，所以实际应用还存在许多困难。酶的固定化技术是现代生物技术及其工业化环节中的一个核心技术，固定化酶在工业、医学、分析与分离技术以及化学合成等领域有着广泛的用途。固定化酶催化反应技术具有能回收、易分离、反复多次使用等优点，为提高纤维素酶的使用效率、降低生产成本提供了可能性，因此纤维素酶的固定化研究长期以来备受关注。本文从固定化酶的载体、固定化纤维素酶的制备方法和性质等方面进行了相关研究。分别选择球状壳聚糖和球状壳聚糖-聚乙二醇共混物为载体，以戊二醛为载体活化剂，采用共价结合法固定化纤维素酶。实验以固定化酶活力、比活力、蛋白载量和固定化率为指标，探讨了戊二醛浓度、反应时间、pH、给酶量、壳聚糖与聚乙二醇共混比等因素对固定化纤维素酶的影响。通过游离纤维素酶和两种固定化纤维素酶性质的比较，系统研究了固定化纤维素酶的酶学性质，包括最适温度、最适pH、米氏常数、热稳定性、重复使用稳定性和贮藏稳定性等方面，研究表明：采用球状壳聚糖为载体的固定化纤维素酶的最适反应温度为50℃，而采用球状壳聚糖-聚乙二醇共混物为载体的固定化纤维素酶为60℃，两种固定化纤维素酶的最适反应pH均为3.8，采用球状壳聚糖为载体的固定化纤维素酶的Km为2.8272g/L，而采用球状壳聚糖-聚乙二醇共混物为载体的固定化纤维素酶的Km为0.9693g/L，固定化纤维素酶的热稳定性、重复使用稳定性和贮藏稳定性都有很大的提高。
参考文献：
[1]. 固定化木瓜蛋白酶及其动力学性质的研究[D]. 刘海燕. 河北大学. 2002
[2]. 磁性纤维素纳米晶固定化酶的制备及应用研究[D]. 曹诗林. 华南理工大学. 2016
[3]. 介孔分子筛MCM-41固定化酶的研究[D]. 肖宁. 北京化工大学. 2005
[4]. 氨基磁性微球制备及其固定化木瓜蛋白酶应用研究[D]. 吴文兵. 四川农业大学. 2007
[5]. 纳米二氧化硅介入对酶活性、酪蛋白磷酸肽制备以及活性保护的影响[D]. 李丽. 东北农业大学. 2011
[6]. 介孔材料组装酶蛋白的研究[D]. 高波. 吉林大学. 2005
[7]. 尼龙6膜固定化生物催化剂及其应用[D]. 夏葵. 湘潭大学. 2009
[8]. 新型柔性树脂载体的合成及对木瓜蛋白酶的固定化研究[D]. 贾倩. 浙江工商大学. 2013
[9]. 葡聚糖磁性微球的制备及固定化木瓜蛋白酶的研究[D]. 刘瑶. 华中师范大学. 2007
[10]. 固定化纤维素酶的制备及其性质研究[D]. 郭锐. 天津大学. 2009