关键词: 玉米粉；脑血管病阿尔茨海默氏病；淀粉样蛋白；豚鼠
阿尔茨海默氏病Alzheimer's disease,AD)是以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变,主要病理特征是在大脑皮层和海马出现淀粉样蛋白（Ap）聚集形成的老年斑(SP)[1]。近年来发现,淀粉样变性脑血管病变CAA也是AD的主要病理学特征,甚至在AD的发病过程中扮演着主要角色,但其发生机制仍不明确，制约了AD的临床诊断和治疗。探明CAA的病理机制具有重要意义,有助于疾病的早期诊断和找到新的治疗靶点[2]。本课题组采用颈总动脉内注射玉米粉导致微血管栓塞,微血管渗漏及早期神经轴突病变或淀粉蛋白沉着制备AD动物模型,探讨淀粉样蛋白在脑组织内沉积的规律,并观察CAA的动态变化特点。
1材料和方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物及分组 清洁级健康雄性SD豚鼠40只,体质量200?250g,由长沙医学院基础医学院实验动物中心提供。豚鼠随机分为实验组和对照组, 每组分为4 个亚组：1、2、4、12周,每个亚组各5只。。
1.1.2主要仪器 10Ml微量注射器（Hamilton),冰冻切片机LEICACM1850),各种规格可调加样器(Eppendorf,小动物行为记录分析系统TSE systems),荧光显微镜(Olympus DP71),图像分析软件Olympus DP Managed,-80X低温冰箱(Thermo Scientific)
1.1.3主要试剂 玉米粉(上海星城生物有限公司),多聚甲醒(广州化学试剂厂），刚果红（上海试剂三厂），AntiAmyloid beta A4 protein (Milliporo),anti-a-actin（Miliiporo),GoatAnti chicken (Jackson Immuno Research), Goat Anti Rabbit、Goat Anti Mouse （nvitroger),山羊血清工作液（上海金桥），抗荧光衰减封片剂(北京普利莱基因)。
1.2方法
1.2.1 玉米粉的制备 将玉米粉末溶于灭菌PBS溶液中,配制成浓度为5%的悬液,将配好的玉米粉置于37℃恒温水浴摇床中,振荡水浴7d备用。
1.2.2动物模型的制作 40只豚鼠用戊巴比妥钠(50 mg/kg）麻醉动物后，颈部皮肤消毒，旁正中切口暴露颈总动脉。用22号头皮针（带蝶翼，尾部连接铁弗龙taflon 导管）从尾侧向头侧方插入颈总动脉，用缝线将针管部分固定于周围组织，铁弗龙导管的另一端连3ml 的注射针筒。针筒安装入定速微量灌流仪。针筒内盛装新鲜配制的5%玉米粉生理盐水稀释液，按具体实验预设定的速度灌流，玉米粉稀释或生理盐水（对照组）。颈总动脉灌流完成后，动物或存活至预设定的存活点。 Morris水迷宫试验各组豚鼠的4周和12周亚组在造模前和造模4周后进行水迷宫试验,1周和2周组造模时间过短不进行水迷宫试验。按参考参文献方法：学习训练海只豚鼠依次从4个象限投入水中,记录动物找到水下平台的时间。每次训练4个象限,每只动物每天训练4次,连续训练5d；定位航行试验在学习训练结束后第5天进行,将豚鼠从某一固定象限投入水池中,记录找到平台的时间,为"逃避潜伏时间”，120s内找不到平台者记为120s,连续测试4d；空间探索试验在定位航行试验后进行,撤走安全平台,将豚鼠从某一固定象限投入水中,记录豚鼠120s内平台探索次数。
1.2.4脑组织取材 各组豚鼠分别于术后1、2、4、12周用冰冻生理盐水及4%冰冻多聚甲醛溶液经心脏灌注,随后断头取脑,再用4%多聚甲醛固定24h。梯度蔗糖溶液脱水,液氮速冻,；冰冻切片机行连续切片,片厚6Mm。1.2.5HE染色常规HE染色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。
1.2.6刚果红染色苏木素染色1min,自来水冲洗1min,1%醋酸酒精分化数秒，自来水冲洗1min,60t自来水返蓝30min,甲醇刚果红染色25min,0.1%碱性酒精分化数秒,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。
1.2.7免疫荧光染色切片经0.01mol/LPBS漂洗后，经山羊血清封闭液封闭后,加入Anti Amyloid beta A4 protein(nillionpore 1:200)及anti-a-actin(millipore 1:1000),4t孵育过夜,PBS漂洗,加入稀释后的二抗（1：1000），37℃孵育1h,PBS漂洗,然后缓冲甘油封片,荧光显微镜下观察。
1.2.8统计分析 Morris水迷宫测试结果以均数±标准差表示,豚鼠逃避潜伏期统计方法采用重复测量方差分析,穿越平台次数统计方法采用单因素方差分析。采用SPSS21.0软件进行统计分析,P<0.05为显著性差异。
2结果
2.1Morris水迷宫试验结果
经过4d的训练,各亚组豚鼠的逃避潜伏期时间均逐渐缩短。分别对比4周及12周亚组豚鼠可见,实验组豚鼠每天的逃避潜伏期均较对照组长（P<0.05）；对比总的逃避潜伏期,实验组豚鼠的逃避潜伏期与对照组时间之间存在显著性差异（P<0.001）,（表1）。对比豚鼠穿越平台次数的变化,4周及12周亚组豚鼠,实验组豚鼠穿越平台次数较对照组要显著减少。
表1水迷宫实验中大鼠逃避潜伏期的变化(均值±标准差,n=5)
2.2脑组织HE染色
经HE染色后,实验组豚鼠脑组织切片可见海马区颗粒细胞减少,细胞变性,胶质细胞增生,海马内小血管壁变性大脑皮层处可见神经细胞肿胀、变性、坏死,可见吞噬细胞吞噬现象。随着时间推移,上述病理表现逐渐增多,对照组HE染色未见明显病理改变（图1）。
图1 脑组织HE染色
2.3脑组织刚果红染色
经甲醇刚果红染色后,显微镜下观察可见实验组豚鼠脑组织内及血管壁上可见橘红色均一无结构的淀粉样物质沉积,偏振光显微镜下可观察到呈现苹果绿色双折光现象，见图2箭头所示）；对照组刚果红染色未见类似病理改变。
图2 实验组刚果红染色
刚果红染色显示,实验1周组未见明显淀粉样蛋白沉积,实验2周组可见淀粉样蛋白在海马小血管周围脑组织中聚集,实验4周组可见小血管周围有淀粉样蛋白沉积膜型12周组可见大量淀粉样蛋白沉积在小血管壁,管壁增厚,小血管狭窄或闭塞，图3箭头所示。对照组术后各亚组均未见明显淀粉样蛋白沉积，见图4。
图3 实验组刚果红染色 图4 对照组刚果红染色
2.4免疫荧光染色
双重染色标记Ap和a-actin后在荧光显微镜下观察可见实验1周组及2周组海马内有少量Ap纤维沉积,但小动脉周围未见Ap纤维沉积，图5、6。实验4周组可见少量Ap纤维分布在小动脉（a-actin染色阳性的血管周围）（图7）；实验12周海马内聚集在小动脉周围的Aβ纤维较实验4周组明显增多（图8）。
图5 实验1 w组免疫荧光染色 图6 实验2 w组免疫荧光染色
图7 实验4 w组免疫荧光染色 图8 实验12 w组免疫荧光染色
3讨论
我们采用采用豚鼠颈总动脉内注射玉米粉成功制备了豚鼠AD动物模型。术后4周及12周亚组进行的Moms水迷宫实验显示实验组豚鼠的高级认知功能发生了明显损害,而对照组未提示豚鼠高级认知功能损害,HE染色可见实验组豚鼠颗粒细胞减少,细胞变性,胶质细胞增生。刚果红染色可见实验组豚鼠脑组织内和血管壁上有淀粉样蛋白沉积,免疫荧光染色显示淀粉样蛋白在动物脑内存在动态迁移过程,实验组可见淀粉样蛋白从动物脑组织内逐渐向小动脉迁移,逐渐附着于小动脉壁,导致小动脉狭窄或闭塞,可导致脑血流量下降,造成CAA的发生。
AD的主要病理学特征包括Ap聚集形成的SP、Tau蛋白异常聚集形成的神经元纤维缠结、突触减少和神经元丢失[3-4]。近年来越来越多研究发现[5-7],CAA也是AD的主要病理学特征,据文献报道,约90%?96%的AD患者脑内毛细血管壁上可见Ap纤维沉积而形成CAA的病理改变,而无AD的老龄人中,CAA患病率仅为10%?40%s,这表明，CAA与AD之间存在着密切的联系。有散发性AD患者脑组织内存在广泛的Ap纤维沉积导致的CAA和严重的血管周围神经元纤维缠结,却没有发现典型的SP,提示AD与CAA和血管周围病理变化有关,而与SP无关。CAA是Ap纤维在脑组织及血管壁中沉积导致的脑组织局限性炎性病变,使小血管与毛细血管的通透性发生改变,最终形成脑血管壁纤维蛋白样坏死、扩张或狭窄，脑血流量降低,导致痴呆的发生[8]。
一般认为[9],CAA属于蛋白质清除障碍性动脉病(protein-elimination-failure arteri-opathy,PEFA,是脑实质内Ap清除障碍所致。大量研究表明[10-11],Ap的生成和清除失衡可造成Ap在血管周围沉积从而导致CAA,由此提出了"Ap清除障碍假说"。该假说认为Ap在特定脑区内聚集引发相应的神经毒性作用,造成突触损伤,神经元死亡,从而导致了AD的发生。Ap是一个含有39?43个氨基酸(约为42000)的可溶性多肽,病理状态下,Ap多肽能够以多肽链间的p-片状折叠形式聚集形成不溶性Ap纤维,极易在脑组织中沉积形成淀粉样斑块,这可能是导致AD发生的主要原因，不溶性Ap纤维等大分子物质主要通过脑淋巴循环途径清除。目前研究表明[12],虽然脑内缺乏传统意义上的淋巴管,但脑内的血管周围间隙(VRS)成为脑内淋巴引流的主要途径。不溶性Ap纤维在通过VRS引流清除的过程中极易沉积在皮层内和软脑膜下小动脉周围(主要是血管壁和星形胶质细胞胶质界膜,逐渐在局部形成淀粉样斑块,并侵入动脉壁内，导致CAA。脑动脉的搏动是Ap在VRS中清除的动力，而AD患者脑动脉壁上形成的淀粉样斑块将使脑动脉的搏动减弱,必然会导致Ap清除障碍加重,促进Ap纤维在脑动脉壁上的沉积。此外,淀粉样斑块形成后还可阻塞VRS,导致脑淋巴循环障碍,也会促进Ap纤维在脑动脉壁上的沉积,导致恶性循环[13]。
本研究通过豚鼠颈总动脉内注射玉米粉制备AD动物模型，明确了CAA是AD的主要病理学变化。但CAA的发生机制目前仍不清楚,需要进一步从细胞及分子水平进行研究。
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论文作者:刘利
论文发表刊物:《医师在线》2019年20期
论文发表时间:2019/12/5
标签：豚鼠论文; 淀粉论文; 刚果论文; 实验组论文; 动脉论文; 血管论文; 蛋白论文; 《医师在线》2019年20期论文;