上海交通大学附属第一人民医院，神经内科 上海 200080
摘要：目的：本实验旨在研究结合免疫球蛋白蛋白（BIP）对原代海马神经元缺糖缺氧/恢复后细胞凋亡的影响。方法：首先建立原代海马神经元OGD损伤模型，然后分别诱导和抑制BIP的表达，应用RT-PCR和免疫杂交印记（western blot）鉴定10mM 2－脱氧葡萄糖对BIP的诱导作用以及设计合成的BIP siRNA封闭其表达作用，CCK8鉴定毒性。TUNEL法比较诱导及抑制BIP表达对OGD后神经元凋亡率的影响。结果：10mM 2-DG孵育细胞24h后BIP的mRNA和蛋白质水平分别为对照组的3倍以上，无细胞毒性。而设计合成的BIP siRNA可以抑制BIP表达，RNAi后24h时BIP的mRNA和蛋白质水平分别比对照组显著下降，而HSP70的表达无影响。诱导BIP表达，使2hOGD后24h时细胞凋亡率降低。RNAi抑制BIP表达，使2h OGD后24h时细胞凋亡率升高。结论：BIP具有保护缺血损伤神经元、抵抗凋亡的作用。ERS是原代海马神经元缺糖缺氧损伤的病理机制之一。
关键词：BIP，海马细胞，缺糖缺氧模型，凋亡
Abstract Objective：This study aims to investigate the roles of BIP in apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress（ERS）. Methods：Firstly，we established OGD model of hippocampal neurons，then，BIP was induced or inhibited using 2-GD or siRNA. RT-PCR and western blot were applied to examine the induction effect of 2-deoxy-D-glucose and blocking effects of BIP siRNA on BIP expression. The role of BIP on the consequent apoptosis was determined by TUNEL assay. Results：After 24h incubation with 2DG，the mRNA levels of BIP respectively increased to 3.35 fold and 3.17 fold higher than the control group. The designed BIPsiRNA inhibited the expression of BIP，which decreased to 37.28%（mRNA）and 42.48%（protein）. The block of BIP by RNAi caused an increase of apoptosis to 78.36% at 24h time point. Conclusion：The chaperone BIP has a countering effect against ischemic neuronal loss and apoptosis.
Keywords：BIP；Hippocampal neuron；OGD，apoptosis
缺血性脑血管病是临床常见病、多发病，其发病率、病死率高[1]。细胞凋亡与缺血性神经元损伤密切相关，因此脑缺血引起神经元凋亡的机制及途径研究是神经科学研究的重点[2]。近来研究发现内质网功能紊乱引发的内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）反应可以导致特异性细胞凋亡[3]，被认为是线粒体和细胞膜死亡受体之外的第三条细胞凋亡途径。各种影响内质网微环境和功能的刺激可以引发内质网应激，启动未折叠蛋白质反应，促进细胞恢复常状，但过强过久的刺激将导致细胞凋亡。目前对ERS凋亡途径研究了解不多，其中结合免疫球蛋白蛋白（Binding immunoglobulin protein，BIP）是内质网中最重要的分子伴侣之一[4]，作为一种应激反应蛋白，在辅助蛋白质折叠、稳定ER中Ca2＋水平、调节ERS跨膜信号感受器活性方面具有重要作用，显示出潜在的细胞保护作用，但是目前还缺乏BIP细胞保护作用尤其是抵抗ERS所致凋亡方面的直接证据和机制研究。
本研究将采用模拟脑缺血病理生理改变的原代海马神经元缺糖缺氧（Oxygen-Glucose Deprivation，OGD）损伤模型作为缺血性神经元损伤ERS途径研究的基础，应用2脱氧葡萄糖诱导BIP表达结合RNAi封闭BIP表达，提供BIP神经元保护作用的直接证据，试图为临床缺血性神经元损伤的保护性治疗提供新的靶点。
材 料 与 方 法
1、原代海马神经元培养：
大鼠原代海马神经细胞的分离、培养，以及OGD模型的建立按照文献[5]所示方法进行。
2、2-DG诱导BIP表达
将培养10d的海马神经元更换培养液后随机分为对照组和给药组，分别给予2-DG终浓度0mM及10mM。培养24h后检测细胞活力、BIP的mRNA水平和蛋白质水平。每组6个样本，重复3次实验。
3、RNA干扰沉默BIP基因表达
3.1分组：接种于24孔板培养10d的海马神经元，随机分为正常对照组、RNAi组、RNAi阴性对照组、RNAi阳性对照组。正常对照组不进行RNAi，RNAi组转染设计合成针对大鼠BIP的有效siRNA沉默BIP的表达；阴性对照组转染与任何基因无同源性的siRNA；阳性对照组转染已证明有效的GAPDH siRNA。每次实验每组6个样本，重复3次实验。
3.2siRNA序列：
a）BIP（NM_013083）：正义5′→3′GGAAUGAAUUFFAAAFCUATT
反义5′→3′UAGCUUUCCAAUUCAUUCCTT
b.GAPDH（NM_017008）：正义5′→3′GUGGACAUUGUUGCCAUCATT
反义5′→3′UGAUGGCAACAAUGUCCACTT
c.阴性对照siRNA：正义5′→3′UUCUCCGAACGUGUCACGUTT
反义5′→3′ACGUGACACGUUCGGAGAATT
3.3用Lipofectamine2000转染siRNA
于转染前1天更新培养液，每孔500μl，不含抗生素及Ara-C。取75μl、20μM的siRNA母液，与1.25ml Opti-MEM混和配制成siRNA工作液。将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，取25μl Lipofectamine2000试剂与1.25ml Opti-MEM混和，形成Lipofectamine2000工作液，在室温下温育5min。将siRNA工作液与Lipofectamine2000工作液在稀释配制好30min内进行混和，轻轻的颠倒混匀，室温下温20min，以便形成siRNA与Lipofectamine2000转染复合物。24孔板每孔加入siRNA与Lipofectamine2000复合物54μl，轻柔前后推摇培养板以混匀液体。细胞放入培养箱继续培养2h，然后置换培养液常规培养，于转染siRNA后24h，检测细胞活力，目的基因的RNA水平和蛋白质水平，评价RNAi效果。
4、RT-PCR检测目的基因RNA水平
用Trizol法[6]提取细胞总RNA，经凝胶电泳分析显示纯度较高无降解。按文献[7]方法逆转录合成cDNA。BIP基因、GAPDH基因和β-actin基因引物序列从文献[8]中获得并在Genebank中进行核对，由上海赛百盛生物技术有限公司合成，各自引物序列见表1：
表1 引物序列和PCR产物长度
目标基因引物序列产物长度（bp）
BIP上游：5’-TCTGGTTGGCGGATCTACTC-3’
下游：5’-TCTTTTGTCAGGGGTCGTTC-3’345bp
GAPDH上游：5’-TCGAGTCTACTGGCGTCTT-3’
下游：5’-ATGAGCCCTTCCACGAT-3’238bp
HSP70上游：5’- TGC TGA CCA AGA TGA AG-3’
下游：5’-AGAGTCGATCTCCAGGC-3’490bp
β-actin上游：5’-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’
下游：5’-TCA TGA GGT AGT CTG TCA GGT-3’620bp
5、Western blot 检测目的基因的蛋白质水平
PBS清洗细胞两次后，加入细胞裂解液，用细胞刮刮下细胞，收集到Eppendorf管中。冰上放置30min充分裂解细胞，4℃、12000g离心10min收集上清。SDS-PAGE按文献[9]方法进行，兔抗大鼠BIP多克隆抗体购自Stressgene公司，按照1：5000稀释后使用。
6、OGD/再恢复损伤
分组：培养10d的原代海马神经元，随机分为正常对照组、2DG组、RNAi组、OGD组、2DG&OGD组和RNAi&OGD组。正常对照组细胞常规培养12d；2-DG组细胞在培养11d后给予10mM 2-DG培养24h；RNAi组细胞在培养11d后给予BIP siRNA转染24h；OGD组细胞在培养11d后后接受2h OGD，恢复24h；2DG&OGD组细胞在培养10d后给予10mM 2-DG培养24h后接受2h OGD，恢复24h；RNAi&OGD组细胞在培养10d后给予BIP siRNA转染24h后接受2h OGD，恢复24h。
结 果
1、2-DG诱导原代海马神经元BIP表达及细胞毒性分析
10mM 2-DG预处理10d原代海马神经元24后，BIP的mRNA及蛋白质相对水平（与内参相比）分别为对照组的3.35±0.62倍和3.17±0.46倍（见图1），细胞活力分析显示，两组无明显差别（p<0.01）。
讨 论
近来研究认为细胞受到刺激产生ERS时BIP表达升高可能是细胞的一种重要的防御机制[10]，该机制对细胞有保护作用，从而延长在各种不利因素刺激下细胞的生存期[11]。在神经细胞的研究中也发现，BIP水平上调是对各种损伤刺激的一种保护性反应。体外研究发现抑制BIP可以增加神经元对β淀粉样蛋白及谷氨酰胺诱导的细胞凋亡的易感性[12]，而提高BIP表达则可以保护海马神经元，减轻β淀粉样蛋白、谷氨酰胺或H2O2造成的细胞损伤和死亡[13]。这些实验证据提示了BIP在神经元抵抗兴奋性、氧化性和凋亡诱导性损伤中可能具有重要作用。
本研究应用与BIP同源的化学合成的siRNA，通过脂质体转染原代海马神经元，可以抑制BIP表达达65%以上。所用的siRNA经GeneBank检测，与其它基因无同源性。检测结果也显示，siRNA可以特异性高效性的抑制BIP表达，而对HSP70基因表达无影响。研究发现，转染siRNA后24h，细胞OGD/再恢复后迟发性神经元凋亡增多，同时BIP表达水平明显较对照组降低，显示缺乏BIP，神经细胞更易发生OGD/再恢复后迟发性凋亡，也从反面说明了BIP在抗凋亡中的重要作用。结合前述上调BIP的实验结果，本实验为BIP在缺血/再灌注后迟发性神经元凋亡中的抗凋亡作用提供了直接的实验证据，可以肯定BIP在缺血性神经损伤中的保护作用，并且可以将其作为一种脑缺血疾病中的治疗新靶点，通过各种诱导BIP表达的手段提高其表达水平来减轻脑缺血后的神经损伤。本实验中证明可以诱导BIP表达并且在一定的浓度范围中无明显毒性的2-DG具有临床应用作为神经保护剂的前途。
综上所述，在本部分实验中，我们证实在神经元OGD/再恢复的迟发性凋亡过程中，以BIP水平为标志的ERS参与其中，并且，BIP作为一种ERS中的保护性因子有明确的抗缺血再灌注后迟发性神经元凋亡的作用。
参考文献：
[1]Ohwaki，K.，et al.，Hypercholesterolemia is associated with a lower risk of cerebral ischemic small vessel disease detected on brain checkups. Clin Neurol Neurosurg，2013. 115（6）：p. 669-72.
[2]Zhang，Y.，et al.，Paeoniflorin，a Monoterpene Glycoside，Protects the Brain from Cerebral Ischemic Injury via Inhibition of Apoptosis. Am J Chin Med，2015. 43（3）：p. 543-57.
[3]Heazlewood，C.K.，et al.，Aberrant mucin assembly in mice causes endoplasmic reticulum stress and spontaneous inflammation resembling ulcerative colitis. PLoS Med，2008. 5（3）：p. e54.
[4]Hayakawa，K.，et al.，Blunted activation of NF-kappaB and NF-kappaB-dependent gene expression by geranylgeranylacetone：involvement of unfolded protein response. Biochem Biophys Res Commun，2008. 365（1）：p. 47-53.
[5]Chung，H.，et al.，IGF-I inhibition of apoptosis is associated with decreased expression of prostate apoptosis response-4. J Endocrinol，2007. 194（1）：p. 77-85.
[6]Liu，Y.，et al.，[Amplification and sequencing of the gene coding for mucin-like protein from Schistosoma japonicum]. Zhongguo Ji Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi，2004. 22（3）：p. 167-9.
[7]Penning，M.，M. Beld，and J. Goudsmit，Peripheral blood mononuclear cells of HIV- and HCV-antibody-positive individuals contain HCV RNA but No HCV DNA despite evidence for reverse transcription of HIV RNA into DNA. Virology，2000. 268（1）：p. 12-6.
[8]Abcouwer，S.F.，et al.，Response of VEGF expression to amino acid deprivation and inducers of endoplasmic reticulum stress. Invest Ophthalmol Vis Sci，2002. 43（8）：p. 2791-8.
[9]Zhu，L.，J.A. Werner，and R. Mandic，Implications of tropomyosin-related kinase B（TrkB）in head and neck cancer. Anticancer Res，2007. 27（5A）：p. 3121-6.
[10]Lin，D. and D.J. Takemoto，Protection from ataxia-linked apoptosis by gap junction inhibitors. Biochem Biophys Res Commun，2007. 362（4）：p. 982-7.
[11]White，L.D.，et al.，New and evolving concepts in the neurotoxicology of lead. Toxicol Appl Pharmacol，2007. 225（1）：p. 1-27.
[12]Bai，Y.，et al.，The in vivo brain interactome of the amyloid precursor protein. Mol Cell Proteomics，2008. 7（1）：p. 15-34.
[13]Rodella，L.F.，et al.，Aluminium exposure induces Alzheimer's disease-like histopathological alterations in mouse brain. Histol Histopathol，2008. 23（4）：p. 433-9.
基金项目：国家自然科学基金青年基金（81200976）。
论文作者:周晓琳（通讯作者）,赵永波
论文发表刊物:《健康世界》2015年第14期供稿
论文发表时间:2015/11/19
标签：神经元论文; 细胞论文; 转染论文; 凋亡论文; 损伤论文; 对照组论文; 诱导论文; 《健康世界》2015年第14期供稿论文;