冉夫来[1]2000年在《利用原生质体技术选育碱性几丁质酶高产菌株》文中研究说明灰褐链霉菌(S. griseofuscus)S1001可以产生碱性几丁质酶。 本论文分为两部分：第一部分主要通过原生质体的制备率、泄露率、再生率研究了灰褐链霉菌S1001原生质体制备、再生的条件：菌丝生长的对数期后期(41小时)是制备原生质体的最佳材料；甘氨酸对溶菌酶的脱壁作用没有辅助作用；溶菌酶的浓度为10mg/ml；酶解时间1小时；酶解温度25℃；能够有效地的形成和保持原生质体的高渗p溶液中含25mM MgCl_2、10mM CaCl_2。第二部分通过紫外线、MNNG对灰褐链霉菌原生质体诱变、筛选，选出了突变株M13，其产碱性几丁质酶的能力为15.2U/ml，比出发菌株提高了近6倍，研究还表明，与对照试验相比，原生质体技术诱变所用剂量均远远小于菌体诱变所用剂量，但是诱变结果却具有突变率高、正变幅度大等优点，是一种简便、实用、高效的诱变技术。
徐春花[2]2007年在《绿粘帚霉产几丁质酶的条件优化及其酶学性质研究》文中提出绿粘帚霉(Gliocladium virens)对多种病原菌都具有拮抗活性，是一种潜力巨大的生防菌，在林木病虫害的生物防治中起着重要作用。国内有关绿粘帚霉产几丁质酶及其生防特性的研究较少，大多为对绿粘帚霉的重寄生、竞争作用以及抗菌代谢产物胶霉毒素的研究。就此，本研究以绿粘帚霉F051菌株为对象，研究绿粘帚霉F051产几丁质酶的最佳碳、氮源以及最优培养条件；分离纯化几丁质酶并对几丁质酶学性质及其对三种病原真菌交链孢、镰刀菌和立枯丝核菌菌丝细胞壁的降解作用进行研究。研究结果如下：还原糖法测定，绿粘帚霉F051发酵上清液与胶态几丁质混合，再与DNS反应后，产生棕红色物质，说明有几丁质酶的存在，即绿粘帚霉F051可产生几丁质酶。绿粘帚霉F051只有在含有几丁质诱导物的培养基中发酵才能产生几丁质酶，说明绿粘帚霉F051产生的几丁质酶是一种诱导酶。在葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，乳糖四种碳源，(NH_4)_2SO_4，NH_4NO_3，蛋白胨，酵母粉四种氮源中，经测定，麦芽糖和酵母粉分别为碳源和氮源时，绿粘帚霉所产几丁质酶活最大，即麦芽糖和酵母粉为产几丁质酶的最佳碳、氮源。绿粘帚霉F051产几丁质酶的条件优化，通过正交试验测定了温度、pH值、瓶装量、接种量、碳源和氮源的量对产酶的影响。研究表明碳源的量对绿粘帚霉F051产几丁质酶的影响最大，其次是温度，再次是瓶装量；当温度为28℃，pH值等于7，100mL的瓶装量，接种1mL孢悬液且碳源和氮源的量分别为1.5％和0.2％时几丁质酶活力最大，为产酶的最佳条件。通过60％硫酸铵沉淀分离，再经High Q阳离子交换柱层析纯化几丁质酶，经SDS—PAGE测定，该几丁质酶分子量约为40KD。对几丁质酶酶学性质的研究表明，在20～80℃范围内，几丁质酶的最适反应温度为50℃，随后温度升高几丁质酶活迅速下降；该酶在20～40℃水浴中保温1h后，酶活基本稳定，超过这个温度酶活逐渐下降，80℃保温1h酶活完全丧失。当pH=4时酶活最大；在pH2～8的不同缓冲液中预处理1h，几丁质酶在pH3～8范围内基本保持稳定。金属离子中Ba~(2+)、Mn~(2+)、Sn~(2+)对几丁质酶有激活作用Sn~(2+)作用最强；Na~+、K~+、Mg~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)对几丁质酶有抑制作用，Fe~(2+)完全抑制几丁质酶活。不同浓度的有机溶剂处理几丁质酶，5％和20％的丙酮，5％的乙二醇和正丙醇对几丁质酶有激活作用，其余有机溶剂均对该酶有抑制作用。几丁质粗酶对三种病原真菌菌丝细胞壁的降解作用显示，几丁质酶可使交链孢和镰刀菌菌丝细胞壁变薄、溶解、质壁分离、原生质膨大；丝核菌原生质体分布不均匀、空泡化、细胞壁变薄并出现断裂现象。试验中未发现几丁质粗酶对交链孢和镰刀菌孢子生长有影响。
李然[3]2008年在《枯草芽孢杆菌胞外蛋白酶突变株的筛选及其拮抗作用》文中认为芽孢杆菌(Bacillus spp.)是土壤和植物微生态系统中的优势微生物种群,具有很强的抗逆能力和抗病作用,其生防机制主要包括竞争作用、拮抗作用和诱导植物抗病性等方面。其产生的细胞壁降解酶(如蛋白酶、几丁质酶、β-1.3-葡聚糖酶等)是重要的拮抗物质之一。已有研究表明,几丁质酶(Chitinase)和β-1.3-葡聚糖酶(β-1.3-glucanase)在生防中的作用与真菌细胞壁结构有关。真菌细胞壁成分较复杂,除了几丁质、β-1.3-葡聚糖以外,还含有多种蛋白质。生防芽孢杆菌产生的胞外蛋白酶可能在协同几丁质酶、β-1.3-葡聚糖酶降解真菌细胞壁、拮抗病原真菌中起到重要作用。本研究首先从真菌细胞壁蛋白质含量入手,对引起山东省主要作物病害的7种病原真菌细胞壁蛋白质含量进行分析,研究了7株生防芽孢杆菌对不同病原真菌的生物防治效果与其3种主要细胞壁降解酶活力的相关性,并进一步利用紫外线(UV)、硫酸二乙酯(DES)及微波(Microwave)对一株具有广谱抗菌活性且产蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T2进行诱变,以蛋白酶活力变化为筛选指标,研究突变株和出发菌株对病原真菌拮抗作用的变化及粗酶液对菌丝和孢子萌发的影响,以期探明芽孢杆菌胞外蛋白酶在生防中的地位和作用,为优良拮抗芽孢杆菌的直接利用和菌株的遗传改良提供依据。具体结果如下: 1.采用Bradford法测定真菌细胞壁蛋白质含量。结果显示:供试7种病原真菌细胞壁交联蛋白含量均高于未交联蛋白,不同病菌菌丝细胞壁中总蛋白含量存在差异,其中以棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum)含量最高,达到7.411 mg/g;西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp. niveum)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum),小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)含量相当,其次为烟草赤星病菌(Alternaria alternata)和小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum),番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)含量较少,为2.626 mg/g。2.生防芽孢杆菌的防治效果与菌株细胞壁降解酶活力的相关性研究,是建立芽孢杆菌菌株筛选模型和菌株改良的基础。根据供试7株生防芽孢杆菌的防效和细胞壁降解酶活力,计算相关系数。结果显示:细胞壁降解酶中影响其防效的主要因素是菌株的蛋白酶水平,同β-1.3-葡聚糖酶水平、几丁质酶水平也有一定关系。以细胞壁蛋白含量最高的棉花枯萎病菌(F. oxysporum f.sp. vasinfectum)为靶标时,蛋白酶水平相关系数达0.915,其余相关系数分别为β-1.3-葡聚糖酶0.811,几丁质酶0.572,对黄瓜枯萎病菌(F. oxysporum f.sp. cucumerinum)、小麦赤霉病菌(F. graminearum)及烟草赤星病菌(A. alternata)的研究也得到相同结论;以西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f.sp. niveum)为靶标时,菌株几丁质酶水平与其生防效果相关性较好,相关系数为0.824,其余相关系数分别为蛋白酶0.623,β-1.3-葡聚糖酶0.497。3.利用紫外线(UV)、硫酸二乙酯(DES)和微波(Microwave)对枯草芽孢杆菌B. subtilis T2进行诱变,获得了具有良好遗传稳定性的蛋白酶正负突变株。酶活力测定结果显示:与出发菌株相比,培养48 h的正突变株T2-18胞外蛋白酶活力提高108.5%,负突变株T2-2蛋白酶活力降低81.1%,而二者的几丁质酶和β-1.3-葡聚糖酶活力均无显著变化。4.为明确芽孢杆菌胞外蛋白酶在生防作用中的地位及作用,本研究对突变株拮抗性能的变化进行了研究。结果显示:正突变株对棉花枯萎病菌(F. oxysporum f.sp. vasinfectum)的平板拮抗作用增强,其粗酶液可使该菌菌丝变形膨大成珠状、原生质浓缩,萌发的孢子芽管短且畸形膨大;负突变株对该菌的平板拮抗作用显著降低,粗酶液对该菌菌丝和孢子的形态无明显作用。盆栽实验显示:突变株对黄瓜枯萎病的防效存在差异,正突变株T2-18浸种处理的黄瓜苗死亡率仅为40.0%,T2处理组死亡率为54.3%,低于负突变株79.6%和对照处理组80.1%。表明提高生防芽孢杆菌胞外蛋白酶的活力可增强其拮抗病原真菌的能力。5.将突变株在平板上连续传20代,考察其遗传稳定性。结果显示:突变株产酶能力以及对病原真菌的拮抗作用均无明显变化,表明获得的突变株具有良好的遗传稳定性,这对于其在各种生态环境中长期稳定地发挥作用具有重要意义。
关峰[4]2012年在《几丁质酶基因（Tch）转化水稻抗病新材料的研究》文中提出水稻是最主要的粮食作物之一,在全世界广泛种植。全球有80%的人口以水稻作为主粮。在我国,水稻更是第一大粮食作物,对国民经济发展起着重要的支撑作用。也是粮食安全的重要保障。近年来,随着植物遗传转化技术的迅猛发展,各国育种学家愈来愈广泛地把基因工程等现代技术手段应用于育种研究中,试图将一些控制优良性状的外源基因导入水稻,以培育优质、高产、抗逆性强的水稻新品种。由于水稻品种繁多,而且植株再生和遗传转化的复杂性和随机性很大,针对某一个特定的水稻品种建立高效、稳定的再生体系和转化系统非常必要,而提高愈伤组织的再生能力一直是水稻组织培养技术需要突破的技术关键。由于不同水稻品种愈伤组织分化、再生的频率不同,这种状况严重地制约了以水稻组织培养为基础的植物遗传转化工程的发展。因此针对特定品种建立一套适合其高效遗传转化的体系,对创制新的水稻种质资源以及培育优良水稻品种具有重要意义。本研究以吉林省主栽水稻品种吉农大808为研究对象,建立了针对农大808的高频再生体系,优化了遗传转化系统,用农杆菌介导法和基因枪转化法等不同手段将Tch基因导入吉林省主栽水稻品种中,经过含有10mg/L除草剂的培养基中筛选后,获得了转基因抗性植株。吉林省主栽水稻品种的组织培养体系的建立和优化,对今后东北地区水稻规模化遗传转化以及水稻转基因研究提供了有利技术支撑。本试验获得的结果如下：1.针对水稻品种吉农大808,建立了高频再生体系并优化了遗传转化系统。(1)继代培养基中外源激素添加量为NAA1mg/L+KT0.5mg/L+2.4-D1mg/L时有利于水稻愈伤组织的分化,愈伤组织的生长速度虽有减缓,但质地紧密、呈颗粒状、圆形、分散性好的胚性愈伤组织数量明显增加,后期绿苗分化率也随之提高。优化后的体系应该是每20天继代一次,连续继代三次以上,此时愈伤状态最佳,可用作转化受体材料。(2)利用吉农大808水稻成熟胚诱导的愈伤组织,如果在分化前干燥处理4h,可引发愈伤组织细胞产生一些生理生化反应,可以显著提高愈伤组织的分化能力。但干燥处理时间不能超过8h,否则愈伤组织失水严重,其分化能力将明显降低。2.通过农杆菌介导法和基因枪转化法,将位于同一表达载体上的抗病相关目的基因Tch和抗除草剂筛选基因bar导入吉农大808中,筛选后共获得了105株抗性再生植株。PCR检测得到24株Tch和bar共转化的阳性材料,经Basta试纸条和浓度为1g/L的除草剂涂抹试验鉴定,其中2株材料经试纸条检测呈阳性,并表现出明显的Basta抗性,表明筛选基因bar已经整合到水稻基因组中并稳定表达。由于目的基因Tch和筛选基因位于同一个表达载体中,可以间接推测目的基因Tch可能具有相应的较高表达水平,进一步的验证工作正在进行中。
吴晓金[5]2008年在《食用菌栽培相关木霉的调查和分析》文中研究说明从木霉污染的食用菌菌筒和子实体中分离纯化了49株木霉菌株。采用形态学方法以及ITS/5.8S测序分析,对这些木霉进行了分类鉴定。结果表明,中国福建、浙江等省食用菌栽培相关木霉以哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和长枝木霉(T.longibrachiaturn)为主,少量为深绿木霉(T.atroviride)和棘孢木霉(T.asperellure);木霉的种类与采集地点、受污染食用菌的种类有一定相关,如在浙江庆元香菇菌筒中分离的木霉主要是哈茨木霉,在广州刺芹侧耳(杏孢菇)菌筒中分离的木霉主要是棘孢木霉,而从福建浦城香菇菌筒中分离的木霉主要是深绿木霉。哈茨木霉、长枝木霉、深绿木霉和棘孢木霉的ITS总长分别为:575 bp-578 bp、579 bp-583 bp、565 bp -567 bp、和560 bp -561 bp,GC含量分别为:55.6%-56.7%、57.2%-58%、55.6%-56.1%和55.8%-55.9%,充分体现了木霉属ITS的长度多态性;ITS1序列总长分别为:221bp-233bp、248 bp-255 bp、214 bp-216 bp和213 bp-214 bp,GC含量分别为:55.4%-57.4%、57.5%-58.7%、55.4%-55.6%和55.6%-55.9%;ITS2序列总长分别为:185bp-188 bp、168 bp-183bp、189 bp-192 bp和188 bp,GC含量分别为:63.1%-65.6%、66.1%-67.9%、62.9%-64.7%和63.8%;所有木霉5.8S完全相同,总长为:159 bp,GC含量为:46.5%。ITS序列最适合用作分类鉴定标记,ITS1不适合用作长枝木霉的分类鉴定,ITS2则种间差异较小的木霉不能得到很好的区分。不同菌株的木霉其RAPD条带,生长最适温度、pH值、培养基含水量都有所不同,显示了食用菌栽培相关木霉具有多样性。木霉对5种食用菌栽培常用消毒剂敏感性测定,显示在同等条件下多菌灵和甲基托布津对木霉抑制效果最好,百菌清效果次之,之后是大生,甲霜灵不太适宜在食用菌栽培中当作防霉剂使用。本文还研究了49株木霉对食用菌菌丝的侵染能力,发现不同木霉的侵染能力不同,同时还发现,对食用菌侵染能力强的木霉对植物病原真菌的侵染能力并不一定强,表现出木霉对真菌侵染的特异性。本文还探讨了木霉侵染食用菌的机理,结果显示,木霉可通过溶壁、缠绕等方式作用于食用菌菌丝细胞壁,木霉发酵液对食用菌和植物病原菌都有很好的抑制作用。木霉几丁质酶活性与侵染性没有直接关联:木霉侵染性强的菌株几丁质酶活性不一定高,产酶活性高的菌株侵染能并不一定强。几丁质酶活性、几丁质酶基因序列及氨基酸序列均与木霉的种类无关,如:同为深绿木霉的66和69,几丁质酶活性分别为:0.0204U/mL.min和0.0044U/mL.min,前者约是后者的5倍;不同种类的木霉可以有相似的几丁质酶序列。几丁质酶活性与侵染性无关,如木霉52无论在植物病原菌还是在食用菌中侵染性都很强,但其几丁质酶活性最弱。木霉几丁质酶基因序列和氨基酸序列与侵染性有一定关系,侵染性强的棘孢木霉29和深绿木霉52同为一类;侵染能力弱的棘孢木霉30和长枝木霉33同聚一类;侵染能力中的哈茨木霉45单独聚为一类;深绿木霉66侵染能力强也单独聚为一类。木霉纤维素酶活性与侵染性没有直接关联。侵染性强的菌株有木霉4、29、52和66,侵染性中的菌株有木霉19、38、63和69,侵染性弱的菌株有木霉28、30、37和70,但产纤维素酶活性强的菌株有木霉29和63,产酶活性中等的菌株有木霉19、28、30、37、38、52、66、69和70,产酶活性弱的菌株有木霉4号。纤维素酶活性、纤维素酶基因序列和氨基酸序列均与木霉的种类无关。克隆得到的5个木霉纤维素酶基因序列中,4株为哈茨木霉,一株为长枝木霉,其基因、cDNA和氨基酸序列同源性均很高,在97.3%～100%之间。木霉纤维素酶基因序列和氨基酸序列与侵染性无关。侵染性弱的哈茨木霉20与侵染性中的哈茨木霉90同源性最近,聚为一类;同一侵染能力的木霉44、47、65和90没有聚在一起。
李莉[6]2005年在《转木霉几丁质酶基因棉花的抗病性检测及鉴定》文中提出棉花是我国的主要经济作物,在国民经济中占有重要地位。新疆地处中国的西北边缘,其独特的气候为棉花生长提供了天然的条件与保障。上世纪80 年代,棉花黄萎病在新疆开始零星发生且日趋严重。1999 年的初步调查,北疆棉区40%以上棉田都有黄萎病发生,其中重病田面积大约占播种面积的8%,有些棉田发病率已达30%以上,严重影响了棉花的产量和品质,已成为新疆棉花生产的一大障碍(姚源松,2004)。因此,如何创造抗病棉花新品种或种质材料,是当前棉花生产和棉花育种急需解决的问题之一,尤其是对棉花黄萎病,至今尚无有效的防治措施,主要原因就是缺乏可利用的抗源。利用基因工程技术将外源抗真菌病基因导入棉花,为抗性育种提供了新途径。本实验通过利用花粉管通道法将构建在植物表达载体pART27 上的抗黄萎病基因木霉几丁质酶(Trichoderma chitinase)基因导入新疆4 个陆地棉品种(系)中,并对转基因植株进行了检测。试验结果如下:1.木霉几丁质酶基因的转化 利用花粉管通道法将木霉几丁质酶基因导入新疆陆地棉系9、新陆中15 号、新陆中19 号和T4中,导入花数分别为581 朵、2067 朵、808 朵、238 朵。收获铃数分别为41 个、328 个、47 个、39个。成铃率分别为7%、15.9%、5.8%、16.4%、12.3%。2.田间卡那霉素检测 将收获的T0和T1代种子1.64kg 全部种于病圃中。出苗4012 株,出苗率为75.2%。2-3 片真叶时,对转导不同标记基因的棉株,分别点涂卡那霉素。卡那霉素溶液浓度为500ppm,点涂3 次后,T2代未变色呈阳性反应的植株共50 株。3.转基因植株的检测经酯酶同工酶电泳检测:转木霉几丁质酶(Trichoderma chitinase)基因植株比对照多一条谱带,表明转化植株与对照相比酯酶同工酶发生改变。对转基因棉花材料进行PCR 分子生物学检测, 证明卡那霉素抗性植株中外源木霉几丁质酶基因可能已整合到受体植株的基因组中。取转基因植株的叶片制备粗酶液,通过抑菌效果试验显示:转基因植株抑菌效果比非转基因植株抑菌效果要明显,表明外源基因已在转基因植株中进行表达。将转基因棉花材料的T2代陆地棉新陆中15 号T、系9T、和感病的新陆中15 号、系9,种植于发病均匀的黄萎病病圃中。进行抗黄萎病性能的鉴定筛选,以收获期剖杆鉴定的维管束的变色程度来计算病情指数,获得T2代具有较高的抗病性植株23 株。转木霉几丁质酶(Trichoderma chitinase)基因棉花的1 个株系对黄萎病抗性明显提高,为获得抗黄萎病的棉花品种奠定了基础。
李秀珍[7]2007年在《植酸梅高产菌株的选育及酶的分离纯化和性质研究》文中指出本文从实验室保存的6株黑曲霉、1株米曲霉和采集的30多份土样出发,利用透明圈法,经过初筛、复筛得到一株产植酸酶的黑曲霉,并将其命名为黑曲霉QY。通过条件优化确定了制备黑曲霉QY原生质体的最佳条件:在液体培养条件下培养9 h的菌丝;用蜗牛酶:纤维素酶=7:3的混合酶处理菌丝;在37℃酶解2.5 h;酶液pH值为6;用0.7 mo1/L的氯化钠作为渗透压稳定剂。通过原生质体紫外诱变、化学诱变,得到了一株产植酸酶较高的菌株:黑曲霉QY-17,在30℃、220 r/min条件下发酵培养3 d,植酸酶发酵液的酶活力达到389.4 U/mL,是原始菌株酶活的5.17倍。通过发酵培养基和发酵条件优化,得到黑曲霉QY-17最佳产酶培养基是以葡萄糖为碳源,其添加量为3 g/100 mL;玉米浆+NH4NO3为氮源,其添加量为1.5+0.25 g/100 mL;MgSO4·7H2O的最适添加量为0.07 g/100 mL。最佳产酶条件为:31℃、220 r/min,250 mL三角瓶装液量为40 mL,接种量为10%,培养基起始pH 6,发酵培养72 h。在最适条件下培养黑曲霉QY-17,酶活可达到579.8 U/mL,是初始产酶条件下的1.49倍,是原始出发菌株酶活的7.7倍。考虑到植酸酶的应用,本文对黑曲霉QY-17植酸酶经7000 r/min、20 min离心的粗酶液的酶学性质进行了研究。发现37℃时黑曲霉QY-17植酸酶在pH 2.5和pH 5.5时都有酶活高峰。该植酸酶在pH 2-8之间的稳定性很好,活性>70%,当pH>8时,酶迅速失活。这说明该酶在酸性和中性环境下稳定性比较好,在碱性环境中,容易失活。黑曲霉QY-17植酸酶最适反应温度为55℃,在37℃-60℃都具有较高的酶活性,超过60℃后酶活迅速下降。黑曲霉QY-17植酸酶具有较好的耐热性,在60℃保温10 min后酶活保留在80%左右,在70℃保温10 min后酶活仍能保留在60%左右。该酶对胃蛋白酶具有弱敏感性,在37℃、pH 2.5下用1 mg/mL胃蛋白酶处理植酸酶2 h,植酸酶的酶活力仍能保留87.9%,说明黑曲霉QY-17对胃蛋白酶具有较强的抗性,这对于它们在单胃动物消化道内保持活性具有非常重要的意义。K+、Na+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)在高浓度时对黑曲霉QY-17植酸酶有抑制作用;Zn~(2+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)在高浓度和低浓度下几乎没有什么抑制作用。黑曲霉QY-17植酸酶在pH 2.5、37℃时对植酸钠的Km值为0.5 mmol/L,Vmax为500 nmol/mL·min;在pH 2.5、55℃时对植酸钠的Km值为0.6 mmol/L,Vmax为1000 nmol/mL·min,这说明该植酸酶在pH 2.5、37℃时对植酸钠有更大的亲和力。对黑曲霉QY-17植酸酶进行了分离纯化,植酸酶发酵液经过7000 r/min、20 min离心、沉淀浓缩、DEAE FF离子交换柱、SuperdexTM75凝胶柱得到了植酸酶的两种同工酶:酶Ⅰ和酶Ⅱ,SDS-PAGE电泳呈单一条带,分子量分别为41 kD和68 kD,总回收率达到4.16%。
胡晓[8]2010年在《枯草芽孢杆菌防治玉米纹枯病的研究》文中研究指明玉米纹枯病是玉米主产区内普遍发生的一类严重土传性病害,是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani),玉蜀黍丝核菌(Rhizoctonia zeae)和禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的一类真菌性病害。从患有玉米纹枯病的土壤中分离出的一株枯草芽孢杆菌,对玉米纹枯病有很好的拮抗作用,具有很大的研究价值。、从玉米叶鞘和玉米根际土壤中分别分离出玉米纹枯病原菌和123株土壤细菌菌株。经鉴定病原菌属于半知菌纲丝核菌属的立枯丝核菌AG-1-IA菌丝融合群。经过对峙培养筛选出26株拮抗菌株,测定拮抗菌株对环境的抗逆性,抗逆指标有培养温度,培养时间,培养Ph值,培养基成分；测定细菌菌株的几丁质酶含量,分别使用几丁质平板法和几丁质酶测定法,最终筛选出4株含有较高几丁质酶活性并对丝核菌有较好拮抗作用的细菌为芽孢杆菌,经鉴定得知1株为环状芽孢杆菌,另3株为枯草芽孢杆菌。其中抗逆性最强,几丁质酶活力最高,拮抗玉米纹枯病拮抗圈最大的为515。采用PDA液体培养基对立枯丝核菌菌丝块进行培养,观察几丁质酶对立枯丝核菌菌丝生长的影响,将几丁质酶浓度稀释为0.4U/ml,0.8gU/ml,1.6U/ml,分别加入三角瓶中,在三角瓶中放入五块同等大小玉米纹枯菌丝块,做3个重复,分别培养24h,48h,72h,96h,称菌丝干重,结果表明1.6U／ml的几丁质酶浓度对立枯丝核菌的菌丝生长拮抗作用最大,菌丝生长量与培养时间有关,培养时间越长,菌丝的干重越重。使用硫酸铵对拮抗细菌菌株的拮抗蛋白进行提取,浓度分别为10%,30%,45%,60%,75%,90%,以45%硫酸铵浓度提取的初酶液几丁质酶活力最高,对玉米纹枯病也有较强的拮抗作用,拮抗圈达到了0.8 cm,但拮抗蛋白里的几丁质酶不纯,需进一步分析。采用物理化学诱变的方法,对拮抗菌株进行复合诱变处理,以期从中筛选出几丁质酶活力高且遗传性能良好的菌株。以枯草芽孢杆菌515为出发菌,采用物理诱变方法,其紫外光的照射时间分别为150s,200s,250s,300s,化学诱变方法使用氯化锂和硫酸二乙酯,氯化锂的浓度为0.3%,0.6%,0.9%,1.2%,1.5%,硫酸二乙酯的培养时间分别为20,40,60,80min。试验结果表明紫外线最佳诱变时间为200s, LiCL的终处理浓度为0.9%,DES最佳诱变时间为60min,诱变最终得到几丁质酶活力较出发菌提高了2.09倍的菌株515-126,对诱变菌株进行连续10代的遗传稳定性测定,结果表明遗传性能良好。采用正交试验设计改进了培养基主要碳氮源、无机盐的配比及发酵条件,产酶培养基的最佳配比为：胶体几丁质1.0%,牛肉膏0.4%,蛋白胨0.4%, KH2PO40.04%, MgSO4.7H2O0.06%。优化发酵的条件为：温度35℃,发酵时间为18h,起始PH为6.5,接种量为7%,通气量为50ml/250ml。变异菌株产酶活力又有进一步提高,酶活达到了1.53U／ml。对诱变菌株进行利福平标记,研究其在玉米植株的根际土壤、根表和玉米叶鞘的定殖能力及对玉米纹枯病的防治作用。结果表明,菌株在根际土壤、根表有很好的定殖力,在叶鞘的定殖力较差；在灭菌土中的定殖力要强于大田里的定殖力；其病情指数低于对照高于井冈霉素的处理,为26.67%,防效作用低于井冈霉素,为49.17%,具有一定的防治效果。
辛文慧[9]2016年在《转哈茨木霉双几丁质酶基因（Ech42+Nag70）提高棉花黄萎病抗性的研究》文中研究表明棉花黄萎病(V. Wilt)是化学药剂难以防治的土传病害之一,爆发时会严重影响棉花的纤维品质和产量。我国是棉花生产大国,主要以种植陆地棉为主。而黄萎病高抗材料主要存在于野生棉和少数海岛棉中,陆地棉中几乎没有,因此常规育种技术难以有效培育抗黄萎病的陆地棉品种。转基因技术的发展为棉花抗黄萎病育种提供了一条有效的途径。本研究拟将来源于哈茨木霉的内切几丁质酶基因Ech42和外切几丁质酶Nag70,通过农杆菌活体转化技术转入中棉所49中,获得转基因植株,研究其对黄萎病病原菌的抗性。同时,为提高田间筛选的效率,选用抗草铵膦基因bar作为筛选基因,创制同时含有抗黄萎病基因和抗草胺磷基因的棉花新种质。获得的主要结果如下：1.利用原载体pBIN (Ech42+Nag70)构建出含有内切几丁质酶基因Ech42和外切几丁质酶基因Nag70的双价植物表达载体载体pCAMBIA (Ech42+Nag70)。2.利用农杆菌活体转化技术将植物表达载体pCAMBIA (Ech42+Nag70)导入棉花中,获得了种子T0。用10 mg/L的草铵膦对T0的幼苗进行筛选,获得了转基因候选植株,并通过对候选植株进行PCR和Southern blot检测验证,最终获得了转Ech42和Nag70基因的种质系.3.用大丽轮枝菌孢子悬浮液的接种试验表明,转基因植株的抗病性明显高于对照植株；同时对转基因棉花的外源胞壁降解酶活性的测定表明,转基因棉花的内、外几丁质酶的活性高于非转基因植株。4.获得的转Ech42和Nag70基因棉花抗黄萎病能力有明显提升,为棉花抗黄萎病育种提供了抗性种质。
任文彬[10]2007年在《淡紫拟青霉E2-4生防效果分析及其根癌农杆菌介导的遗传转化》文中提出目前随着化学农药的过度施用,给环境和人类健康带来极大的危害,因此开展生物防治的研究和应用,正受到世界各国的广泛重视。在开发的众多生防微生物中,生防真菌在生物防治,特别是植物病原物防治方面,起着十分重要的作用。生防真菌因其对环境和人、畜无毒等优点,有着化学农药不可取代的优势。淡紫拟青霉不仅是一类具有极大生防潜力的线虫寄生真菌,同时也是一种有效的昆虫病原真菌。为了充分的利用淡紫拟青霉这一生防资源,本实验通过遗传工程,对淡紫拟青霉E2-4进行了改良,获得了毒力效果有显著提高的工程菌株。具体的实验内容如下:以本实验室筛选和保存的淡紫拟青霉E2-4为原始出发菌株,首先对其进行了一系列的毒力试验。本文通过测定不同浓度的淡紫拟青霉E2-4孢子悬浮液对线虫卵囊孵化的影响发现,低浓度的孢子悬浮液(10~4个/mL)处理线虫卵囊后,线虫的孵出数还高于对照在清水的条件下所孵出的线虫数;随着孢子悬浮液浓度的增加,线虫卵囊孵化的线虫数开始有明显的减少趋势,孢子悬浮液浓度为10~5、10~6、10~7、10~8个/mL时对线虫卵囊的相对抑制率分别为21.72%、42.21%、49.19%和54.95%;孢子浓度为10~6、10~7、10~8个/mL时对线虫卵囊孵化的抑制作用与对照处理相比存在极显著差异。在体式显微镜下观察10~7个/mL孢子液处理的卵囊,可见在卵囊表面萌发出大量菌丝,将卵囊层层裹住,抑制了线虫的孵化。本研究采用液固两级发酵法,以大豆粉为液体培养基,以大米为主要固体基质制备了淡紫拟青霉E2-4的固体菌剂;并在此固体发酵的基础上研究了加入诱导物后对E2-4产孢量的影响;结果显示在大米中加入几丁质和壳聚糖这两种诱导物后孢子产量分别可增至4.15×10~9和2.37×10~9个/mL,均有利于提高E2-4的产孢量,使用制备的E2-4固体菌剂对番茄根结线虫病进行小量盆栽试验,发现E2-4对番茄根结线虫防治效果较好,与对照相比:长势明显优于对照,茎和叶变褐、枯萎等症状较少,且根部根结极少。同时,本实验还测试了E2-4对蚜虫的毒力,结果表明:不同孢子浓度对蚜虫的致死率存在一定的差异;孢子悬浮液浓度为10~4个/mL时对蚜虫的毒力不明显,与对照差别不大;孢子悬浮液浓度达到10~5、10~6、10~7和10~8个/mL后,毒力效果明显增强,尤其是高于10~5个/mL后的浓度,不但致死率高,而且死虫褐化程度也明显高于对照;从体式显微镜下观察死亡的虫体,可见用孢子悬浮液处理过的蚜虫体表长着一层绒毛状的菌丝。从光学显微镜下观察,触角等结节处可见有孢子和菌丝粘附在上面。通过研究试验表明:淡紫拟青霉E2-4对根结线虫和蚜虫均具有一定的生防能力。为进一步提高E2-4的毒力,使其更有效的应用于生防工作中,对其进行了农杆菌介导的遗传转化的改良。首先构建了含几丁质酶基因(chi)和GFP的淡紫拟青霉的表达载体。载体构建的方法为:在表达载体pCAMBIA 1302的基础上构建适合于淡紫拟青霉遗传转化的表达载体,先对pCAMBIA 1302的选择标记基因及其启动子进行第一步改造,构建pTBAR载体,然后再在这个载体的基础上插入外源基因(绿僵菌几丁质酶基因),构成pTBTCHI表达载体。构建的结果如下:通过PCR方法从pC30RG载体中扩增得到Trpc启动子,将适用于真菌表达的启动子Trpc替换pCAMBIA 1302中靠近左边界位于选择标记潮霉素基因上游的Camv 35S启动子;再根据设计的保守引物通过PCR方法从pBHt2载体中扩增获得bar基因替换选择标记潮霉素基因,构成载体pTBAR;然后从绿僵菌HN1中扩增chi基因的开放阅读框,利用套叠PCR的方法将Trpc启动子与chi基因连接起来,组成一表达元件trpc-chi;利用BamH ?和HindШ酶切位点插入载体pTBAR中,构建成功pTBTCHI表达载体。通过电击转化将pTBTCHI表达载体导入根癌农杆菌GV3103中,并成功转化了淡紫拟青霉,对转化效率进行了优化。结果表明:在AS加入量为200μg/mL,淡紫拟青霉E2-4孢子浓度为106个/mL的转化条件下,在根癌农杆菌生长浓度OD_(600)为0.2-0.3左右时,在抗性筛选培养基上所出现的抗性转化子个数最多。根癌农杆菌浓度过低(OD_(600)≤0.1)和过高(OD_(600)≥0.3)时,转化出的转化子数较少;将共培养条件设定为乙酰丁香酮(AS) 200μg/mL,根癌农杆菌生长浓度OD_(600)值为0.2;孢子浓度除10~6个/mL浓度外其它的浓度均没有得到抗性转化子。浓度为10~4个/mL和10~5个/mL的条件下,共培养6天后仍没有抗性转化子长出;而浓度达10~7个/mL和10~8个/mL时,抗性选择培养基上的卫星菌落多,生长背景杂;将根癌农杆菌生长浓度OD600值定为0.2;孢子浓度定为10~6个/mL条件下,加了AS的处理在选择培养平皿上长出的转化子个数较为稳定,平均在40个左右。而在没有加AS的处理中,只有少量的转化子长出或没有转化子,且PCR检测均为假阳性。本实验共获得含chi基因的抗性转化子53个,转化子中绝大部分菌落型态与原始菌相似,只有少数与之有稍微的差别。从中随机选取抗性转化子11个进行bar基因的PCR检测,其中有6个扩增得到目的片段。通过荧光显微镜检测,阳性转化子可发出绿色荧光。对抗性转化子进行的Southern blotting检测也证明含chi基因的T-DNA已插入淡紫拟青霉中。随机选取10个阳性转化子,分析其几丁质酶活力。经Duncan多重比较分析:阳性转化子tchi001、tchi002、tchi007、tchi009、tchi021和tchi030的几丁质酶活表达水平与E2-4存在差异极显著;此6个阳性转化子测得的总蛋白含量与E2-4之间的差异也很显著(a=0.05)。再对其中两个几丁质酶表达活力相对较高的抗性转化子进行毒力测试,结果表明: tchi001抑制线虫卵孵化的速度明显快于E2-4与tchi007,抑制线虫卵孵化的能力也强于E2-4和tchi007,相对抑制率可达62.11%;而tchi007抑制线虫卵囊孵化的能力虽高于原始菌株,但不存在显著差异。对线虫的致死率试验结果显示:这三个菌株与对照处理间存在极显著差异。分析还表明阳性转化子tchi001和tchi007之间的毒力分析没有显著差异。但是阳性转化子tchi001和tchi007的总体毒力均明显高于原E2-4菌株,它们对线虫的校正致死率都超过了60%,分别为75.67%和65.67%。
参考文献：
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[2]. 绿粘帚霉产几丁质酶的条件优化及其酶学性质研究[D]. 徐春花. 四川农业大学. 2007
[3]. 枯草芽孢杆菌胞外蛋白酶突变株的筛选及其拮抗作用[D]. 李然. 山东师范大学. 2008
[4]. 几丁质酶基因（Tch）转化水稻抗病新材料的研究[D]. 关峰. 吉林农业大学. 2012
[5]. 食用菌栽培相关木霉的调查和分析[D]. 吴晓金. 福建农林大学. 2008
[6]. 转木霉几丁质酶基因棉花的抗病性检测及鉴定[D]. 李莉. 新疆农业大学. 2005
[7]. 植酸梅高产菌株的选育及酶的分离纯化和性质研究[D]. 李秀珍. 山东轻工业学院. 2007
[8]. 枯草芽孢杆菌防治玉米纹枯病的研究[D]. 胡晓. 四川农业大学. 2010
[9]. 转哈茨木霉双几丁质酶基因（Ech42+Nag70）提高棉花黄萎病抗性的研究[D]. 辛文慧. 浙江大学. 2016
[10]. 淡紫拟青霉E2-4生防效果分析及其根癌农杆菌介导的遗传转化[D]. 任文彬. 华南热带农业大学. 2007