（四川大学华西第二医院出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室 四川 成都 610000）
【摘要】目的：分析探讨地塞米松通过miR-15b诱导急性 T 淋巴细胞白血病细胞耐药研究。方法：体外培养人急性 T 淋巴细胞白血病细胞株CEM-C7，给予不同浓度、作用时长培养后获得耐药细胞株CEM-C7R。采用Annexin V-FITC/PI双染凋亡试剂盒检测两种细胞株在传代培养1、2、4、6个月时的细胞凋亡率，荧光定量 RT-PCR检测miR-15b表达情况。结果：停用地塞米松诱导后，检测两组细胞的GC敏感性。传代培养4、8、16、24 周时，CEM-C7R 细胞组的细胞存活率均高于CEM-C7细胞组，差异显著，有统计学意义（P<0.05）。另外，RT-PCR检测显示相对于CEM-C7细胞中miR-15b的相对表达水平，CEM-C7R细胞中miR-15b的相对表达水平明显降低，差异显著，有统计学意义（P<0.05）。结论：CEM-C7 经长期低剂量地塞米松处理后可获得GC耐药性，其机制可能与miR-15b有关。
【关键词】地塞米松；miR-15b；急性 T 淋巴细胞白血病细胞；耐药
【中图分类号】R733.71 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）07-0254-02
急性淋巴细胞白血病（acute lymphocyte leukemia，ALL）是临床常见的血液恶性肿瘤，多发于幼儿群体，具有病情发展迅速、死亡率高等特点[1]。糖皮质激素（glucocorticoid，GC）是ALL的主要治疗手段之一，能特异性地调控细胞周期相关基因表达，阻滞恶性淋巴细胞增殖和促进其凋亡。但临床数据[2]显示，目前有超过1/4的儿童ALL患者在治疗过程中出现GC耐药性，影响其治疗。微小RNA（microRNA,miRNA）是近年来肿瘤研究的热点，被证实与肿瘤的发生发展密切相关。本研究以人急性T淋巴细胞白血病细胞株CEM-C7为研究对象，分析地塞米松诱导急性T淋巴细胞白血病细胞耐药性和miR-15b之间的关系。现具体报告如下。
1.材料与方法
1.1 材料
CEM-C7为人急性T淋巴细胞白血病GC敏感细胞株，由美国E.Brad Thompson教授（University of Texas Medical Branch）提供，胎牛血清购自Hyclon公司、RPMI-1640培养基购自Gibco公司、Trizol购自Invitrogen公司、SYBR Green荧光定量qPCR试剂盒购自日本Takara公司，地塞米松购自美国Sigma公司，Annexin V-FITC/PI双染凋亡试剂盒购自南京凯基公司，逆转录试剂盒购自日本Takara公司。
1.2 方法
取含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在5%CO2、37℃、饱和湿度条件下常规培养、传代CEM-C7细胞。取适量对数生长期细胞，调整成2×105/ml的细胞悬液20ml。将细胞悬液充分混匀后随机分为10ml每培养瓶两组，1组加入10nmol/L地塞米松，诱导72h后获得CEM-C7耐药性细胞株CEM-C7R。另一组加入等体积无水乙醇，常规培养72h。
之后，CEM-C7R细胞株停用地塞米松，CEM-C7细胞株继续使用无水乙醇，两组细胞株均传代培养4、8、16、24周。之后均给与10nmol/L地塞米松处理，采用流式细胞仪检测凋亡情况，比较两组细胞系的相对存活率。并于培养72h后采用荧光定量RT-PCR检测微小基因miR-15在两组细胞系中的相对表达量。
1.3 统计学处理
采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x-±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 两组细胞系的耐药性检测
停用地塞米松诱导后，检测两组细胞的GC敏感性。传代培养1、2、4、6个月时， CEM-C7R 细胞组的细胞存活率均高于CEM-C7细胞组，差异显著，有统计学意义（P<0.05）。见表1。
图1 两组细胞系中miR-15b的相对表达水平
3.讨论
GC是目前临床治疗ALL肿瘤一线药物，具有疗效显著、安全性高等特点。但实际应用中，部分ALL患者可能出现GC耐药性，影响治疗效果。本研究中，以CEM-C7细胞株为样本，给予10nmol/L地塞米松诱导72h处理，获得CEM-C7耐药性细胞株CEM-C7R。之后对两组细胞株进行去地塞米松培养1、2、4、8个月。显示传代培养1、2、4、6个月时，CEM-C7R细胞组的细胞存活率均高于CEM-C7细胞组（P<0.05）。可知经地塞米松处理后，研究获得耐药性细胞株CEM-C7R，CEM-C7R细胞株对地塞米松不敏感。
MiRNA是近年来肿瘤治疗的研究热点，可感染RNA的表达和转录，进而参与细胞的生命活动，参与肿瘤的发生、发展、耐药、转移等等[3]。miR-15作为近年来被广泛研究的MiRNA，属于miR-15/16家族，主要影响细胞的增殖、凋亡以及侵袭等活动。Liang[4]的研究中发现，miR-15/16参与调节ALL患者的GC敏感性。本研究中，分析两组细胞株中miR-15的相对表达量。结果显示CEM-C7R细胞中miR-15b的相对表达水平与CEM-C7相比明显降低（P<0.05），证实miR-15b可能参与了急性T淋巴细胞白血病细胞GC耐药的获得，但具体机制尚需进一步研究。
综上所述，CEM-C7 经长期低剂量地塞米松处理后可获得GC耐药性，其机制可能与miR-15b有关。
【参考文献】
[1]王慧敏，欧阳涓，滕军旗，等.地塞米松诱导急性T淋巴细胞白血病细胞耐药及对miR-15b表达的影响[J].热带医学杂志，2016，16(6):695-698.
[2]王秀月，党学娟，汪湄，等.微小RNA在白血病细胞耐药中的调控作用研究进展[J].山东医药，2016，56(43):111-114.
[3]张金燕，张桔顺，许贞书，等.Notch基因在慢性淋巴细胞白血病细胞的表达和介导抗凋亡、耐药机制的研究[J].中国实验血液学杂志，2015，23(4):919-924.
[4] Liangju C,Ming Y,Yan C,et al.Roles of miR-15b in endothelialcell function and their relevance to vascular diseases[J].YiChuan,2015,37(2):121-127.
论文作者:张妍乐,顾玲,马志贵
论文发表刊物:《医药前沿》2018年3月第7期
论文发表时间:2018/3/26
标签：细胞株论文; 细胞论文; 淋巴细胞论文; 白血病论文; 耐药性论文; 两组论文; 诱导论文; 《医药前沿》2018年3月第7期论文;