（河南省医药学校，河南 开封 475000）
摘要：车前子是中药材中的常用药，但在自然界中存在大车前、长叶车前等混伪品，影响了车前子的用药安全性。本文就以ITS2与psdA-trnH序列对细小种子类药材车前子的鉴定能力进行相应的探索研究，并将两者的鉴定结果进行对比分析，以期为更好的对车前子的品质及混伪品进行鉴定提供相应的理论支持。
关键词：车前子；鉴定；ITS2；psdA-trnH；DNA条形码
车前子具有清热利尿、渗湿止泻、明目祛痰等方面的功效，为我国中医药中常用的药材。就目前对其的鉴别研究而言，多从外观形状、显微鉴别以及理化等方面对车前子以及常见的混伪品进行鉴别。但是车前子以及常见的混伪品，像大车前、长叶车前等都属于细小种子类药材，就传统的鉴别方法很难对其进行精确的判断，快速、精确的鉴别方法则成为车前子鉴别的重要需求。
一、基于ITS2与psdA-trnH序列对车前子比较鉴定的研究过程
1、ITS2和psdA序列对车前子进行比较鉴定的依据
在本文中通过ITS2和psdA系列对车前子进行比较鉴定的依据主要为DNA条码技术，该技术不仅具有简便高效的优点，亦不受车前子样品形态的限制，与传统鉴别方法相比，其能对车前子及其混伪品进行更加准确的鉴定。
本比较鉴定研究以车前子及其混伪品为主要的研究对象，以DNA技术为重要的技术依托，来验证ITS2系列以及psbA-trnH系列鉴定的稳定性以及精确性，来达到确保车前子安全用药的研究目的。
2、ITS2和psdA序列对车前子进行比较鉴定的方法
（1）研究对象搜集
为保证该比较鉴定研究的严谨性以及精确性，本研究搜集了41份车前子药材样本（车前为32份，平车前为9份）以及混伪品32份，包括长叶车前、大车前以及青葙子、播娘蒿、独行菜、菟丝子及南方菟丝子。
（2）研究方法
1）DNA提取
也即取一定量的药材或者是经硅胶干燥的叶片，并应用专业的研磨仪对样品进行2分钟的研磨，要确保每分钟的研磨次数为30次，最后通过专业的DNA试剂盒提取样品的总基因。
2）PCR扩增及测序
用于ITS2和psbA-trnH序列的PCR扩增物及相应的反应条件有所不同，在实验研究的过程中，要严格根据《中药DNA条形码分子鉴定》的规定进行选择，并提供特定的反应条件；随后，使用琼脂糖电泳对PCR扩增产物进行检测和提纯，并使用特定测序仪对其进行双向测序。
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3）数据处理
在本研究的数据处理上，主要是采用CodonCode Aligner V3.7.1对经双向测序得到的测序峰图进行相应的校对拼接，并通过该程序将测序峰图中的引物区以及低质量区去除，以便于分别获取ITS2系列以及psbA-TRNh系列的相关数据，并通过相应的软件对其进行序列比对。
二、基于ITS2与psdA-trnH序列对车前子比较鉴定的研究结果及结论
1、基于ITS2与psdA-trnH序列对车前子比较鉴定的研究结果
该比较鉴定研究的结果主要分为两个方面，具体表现如下：
（1）车前子药材及其混伪品的ITS2序列特征
经研究证明，车前的TIS2序列的长度为199bp,G+C的含量为54.7%；平车前的序列长度为200bp，G+C含量为52.9%，且车前的序列种内不存在任何变异点，而平车前的序列种内存在1个变异点；车前子ITS2序列种内的K2P距离均为0，而其混伪品种间的K2P距离则可以从两个方面说明：一是其平均距离为0.5745；二是其最小距离，表现为0.0101.
（2）车前子药材及其混伪品的psdA-trnH序列特征
车前psbA-trnH序列的序列长度为340bp，G+C的质量分为为32.6%；平车前的序列长度为340bp，G+C含量为32.5%；车前序列内均不存在任何的变异位点，序列相似性达到100%，而平车前序列内则存在3个变异点；车前子序列种内的K2P距离均为0，与混为品种间的K2P距离分为两种表示：一是平均距离，为0.2811；最小距离为0.0059。经psbA-trnH系列的种内距离表现，经过该DAN鉴别方法能较好的将车前子与其混伪品进行区分。
2、基于ITS2与psdA-trnH序列对车前子比较鉴定的研究结论
（1）两序列对车前子药材的鉴定
DNA条形码技术的通用性较强，其不受植物形态以及生长环境的影响。在对两种序列进行比较鉴定的研究过程中，笔者采用的是相同的车前子及其混伪品样品，以保证结果的准确性。经研究结果表明，通过ITS2序列分析的车前均不存在变异点，平车前存在1各；而经psdH-trnH系列分析的车前亦均不存在变异点，但平车前存在3个变异点。这意味着,基于IST2序列对对细小种子类药材车前子进行的鉴定具有更好的稳定性。
（2）两序列对车前子药材及其混伪品的鉴定
经ITS2系列鉴定的车前种内的最大距离0小于其与混伪品之间的最小种间距离0.0101；且基于ITS2系列构建出的NJ树表明车前子及其混伪品之间能够被明显的区分开来；而经psdA-trnH系列鉴定的车前种内最大距离0亦小于其与混伪品之间的最小距离0.0059，但基于其构建的NJ图表明，车前子药材只与大车前以外的混伪品进行较为明显的区分。因此在对车前子药材及其混伪品进行区分时，ITS2具有更好的区分效果。
结语
综上所述可知，与传统的鉴定方法相比，psbA-trnH序列与ITS2序列在对细小药材车前子的鉴定上，两者均具有较好的鉴定效果，但是ITS2序列在鉴定中更具有稳定性的优势，且在对车前子及其混伪品进行区分上，具有更好的区分效果。因此，在DNA鉴定技术的选择上，对如车前子般的细小药材可以选择ITS2序列对其品质及混伪品进行鉴定。
参考文献
[1]陈士林,宋经元,姚辉等.药用植物DNA 条形码鉴定策略及关键技术分析［J］.中国天然药物,2009,07(05).
[2]宋明,张雅琴等.基于ITS2序列和psbA-trnH序列对细小种子类药材车前子的鉴定比较[J].中国中药杂志,2014,39（12）.
论文作者:吴妍 郑言 丁方
论文发表刊物:《健康世界》2015年16期
论文发表时间:2015/10/14
标签：车前子论文; 序列论文; 伪品论文; 鉴定论文; 车前论文; 药材论文; 平车论文; 《健康世界》2015年16期论文;