叶秀娣[1]2001年在《重组人VEGF基因对大鼠TRAM皮瓣成活的影响》文中进行了进一步梳理研究背景和目的 横行腹直肌皮瓣（TRAM皮瓣）广泛应用于软组织的修复再造中，尤其在乳房再造方面起重要作用。缺血所致皮瓣部分坏死高发生率是有待解决的难题。许多学者通过各种手术方法、物理方法及药物提高TRAM皮瓣的血供以减少坏死发生。治疗性的血管生成在许多缺血性疾病中研究的较多，其中VEGF促血管生成作用的研究是最令人关注的项目。基因治疗是一种非常有前景的治疗手段，已经证明在动物的心肌缺血和下肢缺血模型中VEGF基因可促进血管形成，改善血流动力学，增加缺血区血供。在皮瓣移植实验中也证明将人VEGF基因注射到皮瓣的供血血管内，结果使皮瓣成活面积增大。但总的来说，基因治疗在缺血皮瓣方面的研究仍较少。 本研究的目的：（一）建立稳定的大鼠缺血TRAM皮瓣模型。（二）研究重组人VEGF基因直接皮下注射对TRAM皮瓣成活及皮下微血管密度的影响，为缺血皮瓣的基因治疗提供实验依据。（叁）研究重组人VEGF基因直接皮下注射后，VEGF表达水平与皮瓣成活及皮下微血管密度的相关性。研究方法2001年浙江大学硕士学位论文1、质粒抽提：将转染目的质粒的细菌扩增后，碱法大量抽提。2、TRAM皮瓣模型：采用单侧腹壁下动脉为蒂的下位横行腹直肌皮瓣。3、给药方式：32只动物随机分4组，每组8只，药物分四点注射于皮瓣区腹直肌蒂两侧。实验组术前5天给药每只500tyPCDNAVEGF；阳性对照组术时给药每只100ngVEGF 空白对照组术前5天给药每只lml生理盐水；阴性对照组术前5天给药每只500ngCDNA。术后一周荧光素钠测试皮瓣血运，照相输入电脑，用计算机图象处理软件AUt。CAD计算成活面积。4、PcDNAVEGF注射前，注射后卜3、5、7、9天的血清标本，用ELLISA试剂盒测定血中VEGF水平。5、PCDNAVEGF下腹部注射后5天的注射区皮肤切片，采用链霉卵白素——过氧化物酶复合物（SP）免疫组化法测定VEGF表达。6、微血管计数：各组皮瓣 HE染色的切片皮下组织中每 mm’的微血管数结果1、TRAM皮瓣模型成活面积：3．61士 1刀6cm‘。2、各组皮瓣成活面积：生理盐水组皮瓣成活面积 4＊ 士1．77 Cm’，PcDNA组皮瓣成活面积4．22士1．80Cffi’，pCDNAVEGF组皮瓣成活面积7．gS士2．64 Cm’，VEGF组皮瓣成活面积 7．31士1．22 cm‘。PcDNAVEGF组皮瓣成活面积显着高于生理盐水组 （P＜0．01）及PCDNA组（P＜0．01），VEGF组皮瓣成活面积显着高于生理盐水组 （P＜0．05）。3、血中VEGF水平：注射PCDNAVEGF前、注射后1、3、5、7、9大的血中VEGF浓度无显着差异。4、切片微血管密度：生理盐水组 44．56i7．S7根／mm‘，PcDNA组 37．49i3．34根／mm‘，pCDNAVEGF组58．71士8．ZS根／mm’，VEGF组65．61士14．29根／mm‘。12001年浙江大学硕土学位论文D PCDNAVEGF组及 VEGF组微血管密度显着高于生理盐水组（P＜0．05），PCDNAVEGFl 组微血管密度也显着高于PcDNA组。15、兔疫组化：PcDNAVEGF注射区皮肤中，棕褐色的抗原抗体复合物沉积在小血D 管内皮细胞浆及淋巳管内皮细胞浆内，有时可呈带状围绕血管腔，在未注射区D 未发现类似的情况。J、直接下腹部皮下注射的 PCDNAVEGF可在大鼠下腹部皮肤内表达具生物活性的IVEGF。12、直接皮下注射 PCDNAVEGF可促进皮下微血管形成。13、直接皮下注射 PCDNAVEGF可提高缺血 TRAM皮瓣成活面积，在缺血皮瓣的预D 防性治疗方面起到一定的积极作用。
虞渝生, 叶秀娣, 寿林[2]2003年在《重组人VEGF基因治疗大鼠缺血TRAM皮瓣的观察》文中提出目的 研究重组人VEGF基因对大鼠缺血TRAM皮瓣成活的影响 ,探讨基因治疗缺血皮瓣的可能性及疗效。方法 动物实验分 4组 ,实验组每只皮下注射PcDNA3 1VEGF 5 0 0 μg ;阳性对照组每只注射VEGF 10 0ng;空白对照组每只注射生理盐水 1ml;阴性对照组每只注射PcDNA3 15 0 0μg。用ELLSA法及免疫组化法测定VEGF基因表达水平 ,测定皮瓣成活面积及皮下组织中微血管密度 ,观察该基因对皮瓣成活的影响。结果 实验组皮瓣成活面积及切片微血管密度显着高于阴性对照组及空白对照组 (P <0 0 5 ) ,与阳性对照组差异无显着性意义 (P >0 0 5 )。免疫组化显示实验组中有大量棕褐色抗原抗体复合物沉积在小血管内皮细胞胞浆内。结论 直接皮下注射PcDNA3 1VEGF ,可在注射部位表达具生物活性的VEGF ,促进皮下微血管形成 ,提高缺血TRAM皮瓣的成活面积。
冯锐[3]2008年在《巨噬细胞及GM-CSF对大鼠DIEP皮瓣成活影响的实验研究》文中指出腹壁下动脉穿支(DIEP)皮瓣作为穿支皮瓣的代表,在最近的十几年中得到了广泛的临床应用。目前,DIEP皮瓣已经超过TRAM皮瓣成为自体组织乳房再造的首选术式。DIEP皮瓣再造乳房的优点是拥有充足的组织量,腹壁皮肤的色泽、质地与受区十分相似,再造的乳房外观、颜色与手感均较满意;皮瓣血管蒂较长,十分有利于皮瓣塑形,且腹壁下动脉的口径与胸廓内动脉及胸背动脉的口径相当,利于血管吻合;DIEP皮瓣乳房再造的最大优势体现在供区的并发症发生率下降,该技术保留了腹直肌前鞘及大部分腹直肌,减少了术后腹壁疼痛、薄弱、腹壁膨出和腹壁疝的发生率,最大程度地保护了供区,使患者获得外形美观效果的同时保留了供区的功能,此外手术恢复时间亦缩短。但DIEP皮瓣乳房再造仍然存在并发症,人们享有其优势的代价是不仅增加了手术的复杂性,而且因为人为减少了腹直肌肌皮穿支的数量,从而减少了皮瓣的血供,理论上增加了皮瓣部分坏死和脂肪液化的几率。如何提高乳房再造中DIEP皮瓣的成活率,是整形外科和肿瘤外科面临的一道难题。当前促进皮瓣成活的研究聚集在以血管内皮生长因子(VEGF)为代表的各种细胞因子的研究上。目前普遍认为VEGF是一种最重要的血管生成因子,在治疗性血管生成中具有重要意义。但是,以VEGF为代表的多种生长因子在病理性血管生成中同样发挥着重要作用。肿瘤学研究表明VEGF是目前所知作用最强、选择性最高的内皮细胞丝裂原,是肿瘤血管生成中的重要调节因子,在许多实体肿瘤的生长、转移中起着极为重要的作用。我们认为,通过基因治疗的方法将具有潜在的促进肿瘤生长与转移的VGEF用于乳癌术后乳房再造的患者以促进再造乳房皮瓣成活是不合适的。重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)已应用于临床多年,是乳腺癌病人辅助化疗时的常规用药。在乳腺癌治疗的临床工作中我们发现,因化疗造成的白细胞低于正常的患者在接受rhGM-CSF治疗后术区原本愈合不良的创面会很快愈合,所以我们设想是否单核/巨噬细胞抑或GM-CSF存在促进皮瓣血管生成的作用?文献显示:近几年研究GM-CSF促进创面愈合的报道比较多,而且绝大部分获得了积极的结果。但将GM-CSF直接应用于皮瓣,观察其对皮瓣成活影响的研究很少。因此我们将GM-CSF及过继巨噬细胞用于乳房再造常规应用的DIEP皮瓣模型中,研究其对皮瓣成活的影响,具有特殊的临床意义。本实验的第一部分研究了大鼠腹部皮瓣的结构特点,并改进了rat-DIEP皮瓣的制作过程,不解剖腹直肌,仅在腹直肌前鞘层面选择穿支血管并切断其它血供,形成DIEP皮瓣,在手术时间缩短的同时,使模型具有更好的稳定性和可重复性。第一部分实验中我们成功建立了稳定的rat-DIEP模型,并形成了相对简单、容易推广的操作流程。使rat-DIEP可以作为常规模型进行皮瓣成活的实验研究。模型形成后,我们通过大体观察及HE染色后的组织学检查记录了皮瓣成活的进程。通过免疫组化以VWF作为血管内皮的识别标志,检测皮瓣各个时点的微血管密度(MVD)的变化,应用苦味酸天狼猩红染色及偏振光显微图像定量分析技术检测皮瓣内胶原含量,并描绘出在无干预情况下rat-DIEP皮瓣形成过程中MVD及胶原含量与各时点之间的变化关系。第二部分实验的目的是研究GM-CSF以及巨噬细胞(Mφ))对大鼠皮瓣成活的影响。我们应用大鼠腹腔直接灌洗的方法,经过分离、纯化获得大鼠Mφ。实验中将模型动物分为四组,分别于皮瓣皮下应用重组大鼠GM-CSF,GM-CSF联合过继大鼠Mφ,过继大鼠Mφ及生理盐水。术后第7天取皮瓣标本,进行皮瓣成活面积的测定,以及免疫组化MVD检测,Masson染色检测皮瓣组织内胶原含量。活化的Mφ可分泌100多种物质,其中包括大量细胞因子,可直接诱导新生血管生长。从理论上来说,Mφ应该具有促进皮瓣成活的治疗作用,但是,我们的实验结果显示过继的Mφ没有增加大鼠皮瓣的成活比率。在皮瓣内MVD检测中,单纯应用Mφ干预皮瓣成活的T组皮瓣MVD高于对照组,但无统计学意义。在皮瓣胶原含量检测中我们发现,单纯应用Mφ干预组胶原含量明显低于对照组(p＜0.05),这可能因为Mφ过量激活金属蛋白酶导致胶原分解过程延长的结果。与其相反,应用GM-CSF组及其联合应用Mφ组皮瓣成活率高于对照组(p＜0.05),其皮瓣MVD和胶原含量均明显高于对照组(p＜0.001)。第二部分实验得到的结论是:重组大鼠GM-CSF及其联合过继的大鼠Mφ皮下注射能够提高大鼠DIEP皮瓣的成活率;并且能够明显提高术后第7天大鼠DIEP皮瓣的MVD及胶原含量。过继大鼠Mφ单独应用不能明显提高大鼠DIEP皮瓣的成活率。第叁部分实验的目的是探讨重组大鼠GM-CSF及其与过继大鼠Mφ联合应用促进大鼠DIEP皮瓣成活的分子机制。本实验中,我们利用RT-PCR技术检测第二部分实验中各组动物皮瓣内的多项基因表达,包括EMMPRIN、MMP2、TIMP1、CollagenⅠ、CollagenⅢ、EGF、TGF-β1、VEGF、EGFR及VEGFR等。比较它们在各组皮瓣中的表达情况,从基因水平探讨GM-CSF及其联合Mφ促进皮瓣成活的机理。实验结果显示,应用GM-CSF组皮瓣EMMPRIN、MMP2、CollagenⅠ、EGF和EGFR基因表达高于对照组;联合应用GM-CSF+Mφ组皮瓣EMMPRIN、MMP2、TIMP 1、CollagenⅠ、CollagenⅢ、EGF、TGF-β1和EGFR基因表达高于对照组;应用Mφ组皮瓣EMMPRIN、MMP2、TGF-β1和EGF基因表达高于对照组。这些基因的上调从分子水平解释了实验组大鼠皮瓣成活率提高的原因。综上所述,本实验研究的结论认为大鼠DIEP模型是一个稳定可靠的皮瓣研究模型;重组大鼠GM-CSF及其联合应用过继Mφ可以提高大鼠DIEP皮瓣的成活率;我们通过更进一步的研究认为,重组大鼠GM-CSF及其联合应用过继Mφ上调了皮瓣内部分基因表达的水平,有利于皮瓣血管生成和胶原重塑,最终促进了皮瓣的成活。
王立夫[4]2004年在《重组腺病毒载体介导的VEGF_（165）基因增强大鼠TRAM皮瓣存活的实验研究》文中研究表明带蒂肌皮瓣的部分坏死是整形重建外科仍然存在的重要问题。虽然传统TRAM皮瓣皮肤坏死的并发症相对较高,大约为6～28%,但是TRAM皮瓣仍被视为乳房重建的优秀皮瓣,在乳房重建手术中被广泛采用。这就需要进一步研究来克服其并发症问题。发展了诸如改良TRAM皮瓣、外科延迟、药物延迟、生长因子治疗和基因治疗等增加皮瓣存活的方法。 VEGF是强有力的内皮细胞特异性生长因子,是血管生成的重要诱导因子。许多研究证实:局部使用外源性VEGF,可以刺激血管生成及增强皮瓣和肌瓣存活,但是,直接使用VEGF效果短暂。 近几年来,研究焦点主要地集中在使用裸质粒DNA或病毒载体编码的血管生成因子方面,提供了比重组体蛋白更为持久的作用效果。在基因治疗中,裸质粒DNA或病毒载体编码的基因导入组织后被宿主细胞摄取,导致蛋白因子表达增强。两者相比,使用病毒载体介导的基因治疗方法优于裸质粒DNA,前者提供了高的感染效率,产生更为有效和持续的作用。 许多动物实验和临床试验研究证实了使用腺病毒载体编码的VEGF基因治疗效果。Lubiatowski等演示了在大鼠模型中,腹部皮下注射腺病毒载体介导的VEGF_(165)基因明显增强腹部带蒂皮瓣存活。Patel等进行的在猪缺血心肌模型中直接心脏注射腺病毒载体编码的VEGF_(121)促使心肌再血管化安全性评估实验后认为:用腺病毒载体感染宿主细胞并且导入VEGF_(121)基因后,不存在明显的安全性问题。
洪克春[5]2007年在《VEGF基因不同治疗途径在缺血皮瓣中的表达》文中提出目的:研究VEGF基因不同治疗途径在缺血皮瓣中表达的影响方法:建立大鼠腹壁下动脉为蒂的缺血皮瓣动物模型,30只SD大鼠随机分成经缺血皮瓣皮下途径导入pcD2 /hVEGF121真核表达质粒的治疗组A;经皮瓣蒂动脉途径导入pcD2 /hVEGF121真核表达质粒的治疗组B;未注射pc D2/h VEGF基因对照组C(各组n = 10)。术后7d,应用RT-PCR、医学图像分析软件等方法检测VEGF基因的表达。结果:叁组之间互相比较,表明在缺血皮瓣中VEGF基因的表达水平,治疗组A最强,治疗组B其次,对照组C最弱,差异有显着性(P﹤0.01)。结论:VEGF基因经皮瓣皮下或经皮瓣蒂动脉导入的治疗途径在缺血皮瓣中均能有效表达;经皮瓣皮下治疗途径的VEGF基因在缺血皮瓣中的表达水平明显高于经皮瓣蒂动脉治疗途径。
周英晋[6]2008年在《不同途径导入VEGF基因对缺血皮瓣影响的实验研究》文中研究指明目的:比较不同途径导入VEGF对大鼠腹部缺血皮瓣的影响,探讨有效的基因导入方法。方法:建立大鼠腹壁下动脉为蒂的缺血皮瓣动物模型,30只SD大鼠随机分成经缺血皮瓣蒂动脉组,皮下肉膜组,对照组,术后7d切取皮瓣,RT-PCR、免疫组化染色及真彩色医学图像分析软件等方法检测VEGF基因的表达、皮瓣皮下血管密度。结果:叁组之间互相比较,表明在缺血皮瓣中VEGF基因的表达、血管的密度,蒂动脉组、皮下肉膜组与对照组有显着差异(P＜0.01),蒂动脉组与皮下肉膜组有差异(P＜0.05)。结论:VEGF基因经皮瓣蒂动脉或经皮瓣肉膜的途径导入均能在缺血皮瓣中有效表达,增加新生血管,改善缺血皮瓣的血供,其中前者更有效。
李明[7]2009年在《rhEPO联合HBO对移植大鼠背部逆行超长皮瓣存活率的影响》文中进行了进一步梳理目的:有研究表明,重组人促红细胞生成素可诱导内皮前细胞分化成新生内皮细胞,高压氧则为新生内皮细胞提供增殖所需的充足氧份,加速了新生血管的发生。因此我们推测重组人红细胞生成素(rhEPO),高压氧(HBO),均有通过促进内皮细胞分化而提高外科皮瓣下新生血管生成的作用。为验证上述推理设计如下实验,分析重组人红细胞生成素、高压氧及其联合应用时对大鼠背部逆行超长缺血皮瓣的影响。材料与方法:实验于2008-04/2008-09在山东大学实验动物中心进行。按照随机数字表法将40只wistar大鼠随机分为四组,每组10只。于大鼠背部按4∶1设计逆行超长缺血随意皮瓣,皮瓣于深浅筋膜之间分离,结扎轴心血管,原位缝合后按照不同的干预方式均分为4组,常压氧组:给予生理盐水+常压氧;高压氧组:高压氧+生理盐水;重组人促红细胞生成素组:重组人促红细胞生成素+常压氧;综合组:重组人促红细胞生成素+常压氧。干预方法:重组人促红细胞生成素的注射量为400 IU/kg与生理盐水等量,1次/d,连用10 d。高压氧为202.65 kPa,体积分数为0.95;常压氧为101 kPa;体积分数为0.35,给氧均于缝合后8 h进行,1h/次,2次/d,共10 d。于缝合后10天测量各组皮瓣成活率。以血管内皮细胞生长因子和CD34作为血管标记行免疫组化染色,计数皮瓣新生血管密度。结果:定性分析:缝合后10 d,皮瓣成活率4组分别为:常压氧组:(56.19±2.66)%、高压氧组:(64.12+1.89)%、重组人促红细胞生成素组:(71.21±2.88)%、综合组:(87.59±2.64)%,各组间比较,均有统计学意义(P＜0.01),方差分析结果示rhEPO和高压氧之间存在协同作用,同时使用效果更好(P＜0.01)。组织学观察结果显示:常压氧组局部坏死,腺体萎缩,真皮下层薄,小血管数目少。高压氧组腺体形态较好,真皮下层薄,但较常压氧组厚,小血管数目较少。rhEPO组腺体增生明显,真皮下层较厚,细胞增生活跃,小血管数目较多。综合组腺体增生明显,真皮下层厚,细胞增生活跃,小血管数目多。定量分析显示:与常压氧组比较,后3组的血管密度值均增高(P＜0.01),且呈递增趋势,以α=0.05的检验标准,各组之间的差别有统计学意义(P＜0.01),方差分析结果显示重组人促红细胞生成素和高压氧之间存在协同作用,同时使用效果更好。结论:重组人促红细胞生成素和高压氧以及二者联合应用,可以促进缺血皮瓣下的毛细血管生成,提高皮瓣存活率并扩大皮瓣长宽比例,重组人促红细胞生成素促进皮瓣成活效果好于高压氧,二者同时使用效果更好。
参考文献：
[1]. 重组人VEGF基因对大鼠TRAM皮瓣成活的影响[D]. 叶秀娣. 浙江大学. 2001
[2]. 重组人VEGF基因治疗大鼠缺血TRAM皮瓣的观察[J]. 虞渝生, 叶秀娣, 寿林. 中华整形外科杂志. 2003
[3]. 巨噬细胞及GM-CSF对大鼠DIEP皮瓣成活影响的实验研究[D]. 冯锐. 中国协和医科大学. 2008
[4]. 重组腺病毒载体介导的VEGF_（165）基因增强大鼠TRAM皮瓣存活的实验研究[D]. 王立夫. 四川大学. 2004
[5]. VEGF基因不同治疗途径在缺血皮瓣中的表达[D]. 洪克春. 南昌大学. 2007
[6]. 不同途径导入VEGF基因对缺血皮瓣影响的实验研究[D]. 周英晋. 南昌大学. 2008
[7]. rhEPO联合HBO对移植大鼠背部逆行超长皮瓣存活率的影响[D]. 李明. 山东大学. 2009