宿志瑞
陕西阳光生物工程股份有限公司 邮编：710119
【摘要】目的：评价实时荧光定量PCR检测HPV-DNA在宫颈癌筛查中应用价值。方法：2015年1月～2015年12月，对我中心经病理组织学诊断宫颈疾病女性500例开展实时荧光定量PCR检测HPV-DNA水平。结果：y（Ct）=-3.3236lgx＋34.713，R2=0.9986，批内、批间、日间重复性检测CV均在合格范围内；不同病理类型HR-HPV阳性率差异具有统计学意义（ =56.416，P＜0.05）；不同类型HR-HPV阳性者拷贝数分布差异无统计学意义（μ=11.495，P=0.063＞0.05）。结论：实时荧光定量PCR检测HPV-DNA可作为宫颈癌筛查方法，筛查早期CIN病变。
【关键词】宫颈癌；HPV-DNA；PCR；实时荧光定量
持续高危人乳头瘤病毒（HR-HPV）感染是宫颈癌关键发病因素，检测HPV感染是宫颈癌筛查必要内容之一，有助于筛查HPV感染与可以逆转的宫颈上皮内瘤病变（CIN），及早开展干预预防宫颈癌[1]。HPV临床检验主要包括细胞学法、斑点印迹法、荧光原位杂交法、多聚合酶链反应（PCR）法，这些方法各有优劣，PCR法特异性强、灵敏度高、操作简单，对原始材料质量要求低，被认为是检测HPV-DNA的最好方法，WHO推荐其作为宫颈癌筛查[2]。实时荧光定量PCR法克实施监测PCR整个反应过程，定量检测范围大，备受卫生机构欢迎。本次研究试评价实时荧光定量PCR检测HPV-DNA在宫颈癌筛查中应用价值。
1材料与方法
1.1研究对象
以2015年1月～2015年12月，我中心经病理组织学诊断宫颈疾病女性500例作为研究对象，年龄20～57岁，平均（41±5）岁。均有性生活时，无宫颈瘤治疗史、手术史。
1.2仪器与试剂
0.9%生理盐水，16、18、31、33、45、52、56、58型HR-HPV核酸定量检测试剂盒，HR-HPV阳性定量参考品，HR-HPV阴性质控品，DNA提取液，HR-HPV PCR反应液等。ABI实时荧光PCR仪，生物安全柜，高速离心机，恒温器等。
1.3方法
以棉球沾取无菌生理羊水拭去宫颈外分泌物，以宫颈帅插入宫颈内，5s后旋转采集宫颈分泌物，置入无菌管中，密封送检。取阴性质控品、临界阳性质控品，8000rpm离心5s，吸50μl～0.5ml入灭菌离心管中，加入50μlDNA提取液，100℃（10±1）min，12000rpm离心5min，处理质控品备用。取阳性标准品，8000rpm离心5s，备用。进行PCR扩增，取相应量PCR反应液与Taq酶，混匀后43μl/管分装至0.2ml离心管，加入处理后样品上清液2μl或阳性定量查考品2μl，8000rpm离心5s,放入PCR仪样品槽。常规方法建立校正曲线，并进行批内重复性、日间重复性精密度检测，确认质控水平，合格后开始检测标本中的HR-HRP DNA水平。以浓度分别为104、105、106、107copies/ml为阳性定量参考品检测限度，进行荧光定量PCR，据构建的校正曲线，通过检测标本Ct值，计算拷贝指数。病理检查终诊参照2001年国际癌症协会（NCI）推荐TBS分类标准。
1.4统计学处理
收集数据建立WPS xls数据表，以SPSS18.0软件进行数学统计，计量资料以均数±标准差（ ±s）表示，计数资料以数（n）或率（%）表示，比较采用 检验，等级资料比较采用秩和检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1 组织病理学
500名对象，其中慢性宫颈炎214例、CINⅠ级101例、CIN Ⅱ级94例、CINⅢ级91例。以Ct值为因变量y，起始拷贝数为自变量x，校正公式为y（Ct）=-3.3236lgx＋34.713，R2=0.9986，呈现高度相关性。批内重复性检测，结果显示低拷贝检测限0.93×104～1.10×104copies/ml，（1.02±0.058）×104copies/ml,变异系数 5.7%,高拷贝检测限0.91×107～1.06×107copies/ml，（1.01±0.055）×107copies/ml,变异系数 （CV）5.5%。CV＜10%提示精密度较好。日间重复性检测CV在5.5%～12.0%之间，精密度较好。
2.2 HR-HPV感染情况
不同病理类型HR-HPV阳性率差异具有统计学意义（ =56.416，P＜0.05）。不同类型HR-HPV阳性者拷贝数分布差异无统计学意义（μ=11.495，P=0.063＞0.05）。见表1。
3讨论
建立的实时荧光定量PCR检测HPV-DNA标准曲线，批内、批间与日间CV均在质控标准范围内，可作为定量检测方法。研究显示，不同病理类型HR-HPV阳性率差异具有统计学意义（P＜0.05），反映HR-HPV感染确实与上皮内瘤病变有关，但并非病变的唯一条件，当然这也与本次研究一次检测的HR-HPV数量有限有关，目前临床上普遍采用18种HR-HPV检测试剂盒进行定性检测，检测水平较高，但定量检测在抗HPV病毒载量评估、疗效评估等领域具有较高的应用价值。
【参考文献】
[1]吴兵，张崇移，李铭芬，等．人乳头状瘤病毒感染与宫颈病变的相关性研究
[J]．中华医院感染学杂志，2013，23 (10)：2377-2378
[2]张俊萍.宫颈病变的筛查方法新进展[J]中国妇幼保健，2011， 26(32):5105-5107
论文作者:宿志瑞
论文发表刊物:《医师在线》2016年3月第5期
论文发表时间:2016/6/16
标签：定量论文; 宫颈癌论文; 宫颈论文; 荧光论文; 统计学论文; 实时论文; 筛查论文; 《医师在线》2016年3月第5期论文;