王仕钦[1]2011年在《白念珠菌烯醇化酶及其N端肽段的原核表达和应用研究》文中研究说明白念珠菌是一种常见的条件致病菌,也是念珠菌感染中居于首位的病原菌。近年来,随着大量免疫抑制剂、化疗药物和广谱抗生素的广泛应用,侵袭性念珠菌感染(invasive candidiasis, IC)的发病率和死亡率不断上升。现阶段仍然缺乏能早期、敏感而特异性检测侵袭性白念珠菌感染的方法。国内外研究已经把注意力集中于检测患者血液中的白念珠菌特异性抗原成分及其代谢产物上。白念珠菌烯醇化酶即是目前研究较多的一类免疫优势抗原,检测病人血清中烯醇化酶抗原及其相应抗体可以区分侵袭性感染和单纯的定植,为IC的诊断提供有力的依据。目的：应用分子克隆和原核表达技术,获得白念珠菌烯醇化酶的全长重组蛋白及N端肽段ENO1-319P；制备相应的多克隆抗体；为建立快速诊断侵袭性念珠菌感染新的血清学检测方法提供试剂原料。方法：以白念珠菌C1标准株基因组DNA作为模板,用PCR法扩增烯醇化酶的全长DNA序列,以pET28a(+)为载体,构建重组表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组融合蛋白表达。用抗his6标签的单克隆抗体和白念珠菌抗体阳性的病人血清进行Western blot鉴定,TALON金属亲和柱层析纯化重组蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原分别免疫家兔和山羊制备多克隆抗血清,并检测抗体特异性。另通过念珠菌与人体细胞内烯醇化酶氨基酸序列的同源性比对寻找同源性低的区域,并通过原核表达技术获得序列特异性更高的肽段EN01-319P,,并建立检测病人血清中ENO1-319P抗体的ELISA方法以评估其在侵袭性念珠菌病早期诊断中的价值。结果：先获得了含白念珠菌烯醇化酶全长基因的重组表达载体和相应工程菌株,测序结果证明克隆的烯醇化酶基因序列完全正确,经IPTG诱导后能高效表达重组融合蛋白。使用重组蛋白制备了针对白念珠菌烯醇化酶的兔抗血清及羊抗血清。后来又成功克隆了白念珠菌烯醇化酶N端1-319位氨基酸的肽段,获得的重组肽段经病人血清Western blot鉴定表明有良好的抗原性,以之建立的ELISA抗体检测方法敏感性为86.4%,特异性95.0%,IC患者阳性率为84.8%(56/66),健康人阳性率为3.0%(6/200)。结论：成功克隆了白念珠菌烯醇化酶及其N端肽段ENO1-319P并在大肠埃希菌中获得高效表达,并以纯化的重组蛋白制备抗ENO1多克隆抗体。为IC的早期诊断建立检测白念珠菌烯醇化酶抗原和相应抗体的血清学方法打下了基础。
宋秋荷[2]2004年在《两种单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立》文中认为目的:目前,念珠菌已经成为医源性感染中常见的病原菌,而白念珠菌又是念珠菌感染中居首位的病原菌。白念珠菌不仅可以引起机体皮肤和粘膜的损害,还可以导致系统性的感染。白念珠菌粘附、定殖于宿主的内皮细胞或粘膜的表面,进一步达到侵袭宿主的目的。能够快速、早期地诊断白念珠菌系统性感染对指导临床的治疗有着重要意义。现阶段对白念珠菌系统性感染的诊断方法,尤其是能早期、敏感而特异性的检测,仍然是缺乏的。临床研究已经把注意力集中于检测患者血液中的白念珠菌特异性抗原成分及其代谢产物上。本研究目的在于制备两种抗念珠菌特异抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株,为建立快速、早期诊断系统性念珠菌感染提供新的实验室检测方法;同时也初步探讨抗白念珠菌芽管胞壁外膜单克隆抗体在体外试验中抑制白念珠菌相变的作用。方法:分别用酵母菌烯醇化酶和带芽管白念珠菌标准菌株{ATCC-90028}孢子作为抗原,免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术,制备出抗烯醇化酶和抗白念珠菌芽管胞壁外膜单克隆抗体杂交瘤细胞株,并对两种杂交瘤细胞株进行相关鉴定;通过体外白念珠菌芽管诱导抑制实验,观察抗白念珠菌芽管胞壁外膜单克隆抗体能否抑制白念珠菌芽管形成,影响白念珠菌菌相的转换,并对实验数据进行统计学处理。结果:建立了2株分泌抗烯醇化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为Mab03.3G5-F3-F5、Mab03.4G6-F3-C7,并对Mab03.3G5-F3-F5单抗进行鉴定。小鼠腹水单克隆抗体的最高稀释度达1:12800以上;单克隆抗体的重链属于IgG1亚类,轻链属于κ型;Western Blotting显示这2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体皆能与烯醇化酶抗原(48kD)特异性地结合,证实是抗烯醇化酶的单克隆抗体。成功地制备了1株分泌抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为Mab03.2C1-C2。其小鼠腹水单克隆抗体的最高稀释度达1:25600;单克隆抗体的重链属于IgG1亚类,轻链属于λ型;通过IIF,可见单抗能使白念珠菌芽管特异性染上荧光,而孢子上无荧光着色,证实了该单抗是抗白念珠菌芽管胞壁外膜特异性抗原的单克隆抗体;经Western Blotting证实Mab03.2C1-C2杂交瘤细胞分泌的单克隆抗<WP=9>体能与白念珠菌芽管表面抗原提取物特异性地结合,得知该单抗的靶位是在白念珠菌芽管胞壁外膜上分子量为156kD的抗原成分。抗白念珠菌芽管胞壁外膜单克隆抗体杂交瘤细胞株Mab03.2C1-C2所分泌的单克隆抗体对白念珠菌芽管的诱导具有显著的抑制作用,影响白念珠菌菌相的转换。结论:通过本次实验,我们成功地制备2株抗烯醇化酶单克隆抗体杂交瘤细胞株和1株抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,并对其中Mab03.3G5-F3-F5和Mab03.2C1-C2 单抗进行鉴定;抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原单克隆抗体的靶位是芽管胞壁外膜上分子量为156kD的抗原成分;同时得出抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原单克隆抗体Mab03.2C1-C2具有影响白念珠菌菌相转换的作用的结论。本实验为进一步早期、快速检测系统性念珠菌病,开发系统性念珠菌病诊断试剂盒,以及探讨芽管单抗的保护性免疫作用等实验室及临床研究打下基础。
贺政新, 侯天文, 李玮, 王缚鲲, 王宪灵[3]2015年在《白色念珠菌烯醇化酶1的原核表达及多克隆抗体制备》文中认为研究背景:近年来,住院患者院内侵袭性念珠菌感染(invasive candidiasis,IC)日益严峻,由于其临床表现与细菌重症感染难以鉴别,其病死率高达40%~80%。及时明确念珠菌感染诊断是减少IC病死率的有效途径。目前,临床上还没有一种令人满意的念珠菌感染的实验室诊断方法。研究人员不断探讨真菌的致病机制及检测真菌的抗原、抗体和代谢产物用于临床早期诊断IC的可能,并迅速成为这一领域的热点。烯醇化酶(enolase,Eno)又称2-磷酸-D-甘油酸水解酶,它催化磷酸甘油向磷酸烯醇式丙酮酸的转化,是糖酵解过程的限速酶。一直以来均认为该酶是一个古老的、保守的、功能单一的蛋白,然而最近的研究发现该酶可能是IC血清学检测重要的靶标分子。研究目的 :选取编码Eno的基因序列,构建其原核表达质粒并诱导其在E.coli BL21(DE3)中表达,经亲和层析纯化后制备其多克隆抗体,为进一步研究该蛋白在临床快速诊断真菌感染性疾病中的价值提供实验基础。方法 :PCR法获取白念珠菌SC5314的eno1全长基因,克隆入原核表达载体p ET30a,转化感受态细胞E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后以亲和层析纯化重组蛋白并以SDS-PAGE和Western blot法鉴定。用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备烯醇化酶的多克隆抗体,经纯化后,间接ELISA法测定抗体效价,Western blot法鉴定其反应性。结果 :成功构建原核表达质粒p ET-30a-eno1,诱导后表达的重组蛋白相对分子质量(Mr)约为50 000,主要以可溶性上清形式存在。纯化制备的Eno1多克隆抗体效价约为1︰12 800 000,可与重组的烯醇化酶反应。结论 :成功获得白念珠菌Eno1重组蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体。
唐宁枫[4]2000年在《白念珠菌烯醇化酶的研究》文中研究说明系统性真菌病的发生率正在逐年上升。它是免疫缺陷患者死亡的主要原因之一。白念珠菌是其中最主要的病原菌。烯醇化酶能够催化磷酸甘油盐向磷酸烯醇式丙酮盐转变，同时也在糖异生过程中催化逆向反应。是一种高度保守的蛋白质。在白念珠菌系统感染过程中具有很强的免疫源性。对它的功能及生物活性的研究，有助于系统性念珠菌病的早期诊断，防治及阐明白念珠菌的致病机理。 本研究首先从白念珠菌菌体中分离出烯醇化酶，并对其酶学活力进行了测定。将白念珠菌标准菌株在沙氏培养基上37℃培养24小时后，收集酵母相细胞，以酶解法和超声波粉碎法破坏细胞壁和细胞膜。将所获的全菌蛋白质经50％及70％硫酸铵沉淀。然后经DEAE-Sephadex A-50凝胶柱和ConA-Sepharose-4B凝胶柱层析。除去杂蛋白。获得烯醇化酶。以聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测得所分离出酶蛋白的分子量为47KD。在体外建立部分糖代谢反应链。以此测得烯醇化酶在30℃时的活力为2950.0u／ml。并且计算出本分离方法的蛋白质得率6.0％。 采用多点注射法以白念珠菌烯醇化酶免疫家兔，并以酶联免疫吸附试验(ELISA)测定所获得的抗烯醇化酶血清效价最高为1：6400。烯醇化酶与感染白念珠菌家兔血清的免疫印迹显示它具有很高的特异性。与此同时也制备了抗白念珠菌全菌蛋白及非糖基化菌体蛋白的兔血清。在体外比较三种抗血清及白念珠菌感染的兔血清检测白念珠菌、季也蒙念珠菌、乳酒念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、酿酒酵母菌、黄曲霉和烟曲霉全菌抗原的效果。结果抗白念珠菌烯醇化酶血清表现出良好的特异性和敏感性。优于抗白念珠菌全菌蛋白及非糖基化菌体蛋白血清。 以环磷酰胺经腹腔给药抑制小鼠的免疫功能。然后再以白念珠菌孢子经尾静脉感染健康小鼠及免疫抑制的小鼠。通过免疫电泳技术以抗白念珠菌烯醇化酶血清检测小鼠血中白念珠菌。并以血培养方法加以对照。结果在健康小鼠抗白念珠菌烯醇化酶血清在第3天就可以测出1只小鼠血中白念珠菌抗原，而血培养到第7天才有阳性结果。在感染后第一周内，抗白念珠菌烯醇化酶血清可在28只免疫健全小鼠中的8只血中测出相应抗原。在免疫抑制小鼠抗白念珠菌烯醇化酶血清在感染第2天可测出1只小鼠血中白念珠菌抗原。而血培养到第6天才有1例阳性结果。在感染后第一周内，抗白念珠菌烯醇化酶血清可在28只免疫受抑制小鼠中的10只血中测出抗原。抗白念珠菌烯醇化酶血清所检测的阳性率高于血培养。两种方法有显著性差异(p＜0.05)。 我们还观察了白念珠菌烯醇化酶对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活力的影响。白念珠菌烯醇化酶处理组的巨噬细胞在体外平均吞噬2.8±0.3个未经调理的白念珠菌孢子，而未处理组的巨噬细胞平均仅吞噬1.9±0.3个未经调理白念珠菌孢子。但如果在培养基
王廷廷, 贺政新, 王缚鲲[5]2017年在《白念珠菌烯醇化酶的研究进展》文中进行了进一步梳理念珠菌是与人类共生的条件致病菌,能导致系统性念珠菌感染和深部念珠菌侵袭。烯醇化酶是白念珠菌生长过程中的一种关键的糖酵解代谢酶,同时也是侵袭感染过程中重要的免疫优势抗原,在白念珠菌致病、血清学诊断和宿主抵抗白念珠菌感染过程中发挥重要作用。对烯醇化酶的深入研究将为制备蛋白质疫苗以及正确选择临床抗真菌药物提供理论依据。该文就白念珠菌烯醇化酶的基因结构、致病机制、诊断价值和疫苗研发方面作一综述。
唐宁枫, 焦瑞清, 吴绍熙, 郭宁如, 秦浚川[6]2001年在《白念珠菌烯醇化酶的抗原特异性研究》文中提出目的探讨白念珠菌烯醇化酶的抗原特异性。方法和结果①免疫印迹显示烯醇化酶是白念珠菌非糖基化蛋白中可以和感染兔血清发生反应的主要蛋白质。②以纯化的白念珠菌烯醇化酶免疫家兔获得最高效价为1:6400的多克隆抗体(ELISA法测定)。③与另外3种多克隆抗体相比,抗烯醇化酶抗体在检测白念珠菌菌体抗原时显示出较高的特异性。结论白念珠菌烯醇化酶是一种值得进一步研究的特异性抗原。
唐宁枫[7]1999年在《白念珠菌的烯醇化酶》文中研究说明烯醇化酶是生物体内糖酵解途径中的关键酶。文中就白念珠菌烯醇化酶的生物学活性、酶蛋白的一级和二级结构特征、基因组成、与白念珠菌过敏患者IgE结合的特点和位点以及其作为白念珠菌感染宿主的特征性标志物在诊断深部念珠菌病中的价值等方面加以综述。
宋秋荷, 李忠元, 赵政凤, 王鲁, 王鲁[8]2009年在《白念珠菌烯醇化酶单克隆抗体的制备及鉴定》文中研究说明目的:制备并鉴定抗白念珠菌烯醇化酶单克隆抗体杂交瘤细胞株。方法:提取白念珠菌标准株ATCC-9002胞内烯醇化酶做抗原,再用细胞融合技术制备单克隆抗体,采用间接ELISA法对单克隆抗体进行筛选和鉴定。结果:建立了1株持续分泌抗白念珠菌烯醇化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中Mab07.4G6-F3-C7小鼠腹水单克隆抗体的最高稀释度达1:12800,单克隆抗体的重链属lgGl亚类,轻链属κ型;Western blot证实单抗能与白念珠菌烯醇化酶抗原特异性地结合。结论:本研究建立了抗白念珠菌烯醇化酶杂交瘤细胞株单克隆抗体,为快速诊断白念珠菌感染奠定了实验基础。
孔小祥, 李芳秋, 王仕钦, 史利宁, 邵海枫[9]2011年在《抗烯醇化酶抗体检测对侵袭性念珠菌病的诊断价值》文中研究说明目的利用白念珠菌烯醇化酶重组蛋白质为抗原,建立测定人血清中抗白念珠菌烯醇化酶IgG类抗体的ELISA法,评估其在侵袭性念珠菌病(IC)诊断中的应用价值。方法收集各类确诊IC患者(66例)和白念珠菌定植者(32例)血清,用重组白念珠菌烯醇化酶包被ELISA微孔板,测定血清中的抗烯醇化酶抗体,确定cut off值并对方法的精密度和特异性进行考察。结果以重组烯醇化酶抗原建立的ELISA法批内变异系数(CV)为5.7%,批间CV为14.6%;重组抗原对血清中相应抗体的阻断率为93.0%。经ROC曲线分析,选择吸光度值0.37作为cut off值,对IC的诊断敏感性为77.3%,特异性为98.0%。念珠菌定植者阳性率为31.3%(10/32),IC患者阳性率为77.3%(51/66),两组差异有统计学意义(P<0.05)。动态观察发现,IC患者中47.0%(31/66)可以在血培养阳性前检测到抗烯醇化酶抗体。结论建立了检测抗白念珠菌烯醇化酶抗体的ELISA法,在IC早期诊断中具有潜在应用价值。
邢春燕[10]2008年在《血清白念珠菌烯醇化酶抗原检测对诊断侵袭性白念珠菌感染临床价值的研究》文中进行了进一步梳理目的:通过对侵袭性白念珠菌感染时烯醇化酶(enolase)血清水平检测,评价烯醇化酶抗原在诊断侵袭性白念珠菌感染中的价值。方法:根据血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗原则(草案)、2001年卫生部发布的《医院感染诊断标准(试行)》为依据,选择40例患者为试验组,其中确诊为侵袭性白念珠菌感染患者18例、临床诊断侵袭性肺白念珠菌感染患者12例、浅表定植白念珠菌患者10例作为试验组,同时选择健康体检人员10例作阴性对照,留取血标本。首先采用酶联免疫法(ELISA法)测定不同浓度梯度的烯醇化酶标准抗原与标准抗体的吸光度值(OD值),寻找最适的抗体浓度,并绘制抗原的标准曲线。再以相同的条件检测待测血清中烯醇化酶的OD值,通过标准曲线反应出待测血清中抗原含量。探讨血清烯醇化酶水平与感染发生的相关性,评价烯醇化酶抗原检测在诊断侵袭性白念珠菌感染中的价值,从而为侵袭性白念珠菌感染的早期、快速诊断提供依据。结果:1.确诊侵袭性白念珠菌感染组患者血清烯醇化酶的平均浓度为0.630±0.02405μg/ml,临床诊断侵袭性肺白色念珠菌感染组为0.5233±0.1832μg/ml,定植组0.1050±0.0299μg/ml,健康组0.0690±0.0393μg/ml。两两比较,确诊和临床诊断组与后二组均有差异,前两组比较无明显差异,后二组无明显差异。2.用ELISA检测血清烯醇化酶的浓度,以0.35μg/ml为诊断阈值的敏感性、特异性分别为:77%、100%。结论:1.侵袭性白念珠菌感染时血清烯醇化酶水平明显高于定植组和健康组,提示:血清烯醇化酶抗原检测可作为侵袭性白念珠菌感染的诊断指标。2.以0.35μg/ml为诊断阈值对诊断侵袭性白念珠菌感染的敏感性、特异性较为理想。
参考文献：
[1]. 白念珠菌烯醇化酶及其N端肽段的原核表达和应用研究[D]. 王仕钦. 南京师范大学. 2011
[2]. 两种单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立[D]. 宋秋荷. 第三军医大学. 2004
[3]. 白色念珠菌烯醇化酶1的原核表达及多克隆抗体制备[C]. 贺政新, 侯天文, 李玮, 王缚鲲, 王宪灵. 第十届全国免疫学学术大会汇编. 2015
[4]. 白念珠菌烯醇化酶的研究[D]. 唐宁枫. 中国协和医科大学. 2000
[5]. 白念珠菌烯醇化酶的研究进展[J]. 王廷廷, 贺政新, 王缚鲲. 临床检验杂志. 2017
[6]. 白念珠菌烯醇化酶的抗原特异性研究[J]. 唐宁枫, 焦瑞清, 吴绍熙, 郭宁如, 秦浚川. 中华皮肤科杂志. 2001
[7]. 白念珠菌的烯醇化酶[J]. 唐宁枫. 国外医学(皮肤性病学分册). 1999
[8]. 白念珠菌烯醇化酶单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 宋秋荷, 李忠元, 赵政凤, 王鲁, 王鲁. 西南国防医药. 2009
[9]. 抗烯醇化酶抗体检测对侵袭性念珠菌病的诊断价值[J]. 孔小祥, 李芳秋, 王仕钦, 史利宁, 邵海枫. 临床检验杂志. 2011
[10]. 血清白念珠菌烯醇化酶抗原检测对诊断侵袭性白念珠菌感染临床价值的研究[D]. 邢春燕. 山东大学. 2008
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