龚靖丹
义乌国际旅行卫生保健中心 322000
摘要：目的：探讨荧光定量PCR的检测流感病毒中的应用。方法：采用实时荧光定量PCR法对60份经胶体金快速检测法筛查检测的标本进行检测，进行统计分析，评估不同方法灵敏度和特异性差异。结果：实时荧光定量PCR法和胶体金快速检测法的阳性率分别为78.33%和58.33%，胶体金快速检测法较于实时荧光定量PCR的灵敏度和特异性分别为74.47%和53.85%。结论：实时荧光定量PCR检测技术可作为流感防控的病原快速检测技术。
关键词：流感病毒；胶体金快速检测；实时荧光RT-PCR
流行性感冒病毒（Influenza virus）是正黏病毒科的代表种，简称流感病毒，是单负链分节段的RNA病毒，易引起人群的上呼吸道感染。人流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行性感冒的病原体。病毒的表面抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）易发生变异，是导致其引起世界大流行的原因。甲型流感病毒可感染多种动物，也是人类感染的主要病原。甲型流感病毒根据其H和N抗原的不同，又可分为多个亚型。其中H抗原有15个亚型，N抗原有8个亚型。人类容易感染和传播的主要有H1N1、H2N2、H3N2这三种亚型。
流感病毒的临床症状容易和普通感冒相混淆，传统的实验室确诊方法耗时长而且技术要求高，无法及时对暴发疫情做出诊断。实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR）技术，利用PCR对核酸的高度扩增，探针技术的高特异性的特点，实现了PCR从定性到定量的飞跃，不仅克服了常规PCR检测易污染与假阳性率高的缺点，而且具有特异性强、灵敏度高和自动化操作等优点，利用RT-PCR方法可快速检测流感病毒。
1 材料与方法
1.1 标本 采集自义乌机场出入境发热旅客60例。
1.2设备与试剂 荧光定量PCR仪ABI7500，全自动核酸提取仪ABI magMAX，生物安全柜上海力康，高速冷冻离心机为德国Sigma RT-PCR试剂盒购自上海之江生物科技股份有限公司，RNA提取试剂盒为ABI公司生产，流感胶体金快速检测试剂由浙江省出入境检验检疫局提供。
1.3 病毒RNA的提取 按照试剂盒说明书将每个反应按3μlCarrierRNA和232μlLysis/Binding Solution Concentrate比例制成混合液，加入到Bead管，再加175μl样本，振荡击打Bead 15分钟后，16000×g离心3分钟，将Beads聚集在一起。将前处理过的样本和试剂加入8联管中，A孔加入100%异丙醇65μl磁珠混合液20μl样本裂解物115μl，B孔加入洗液Ⅰ 150μl，C孔加入洗液Ⅰ 150μl，D孔加入洗液Ⅱ 150μl，E孔加入洗液Ⅱ150μl，F孔加入洗脱液90μl，将反应管放入全自动核酸提取仪中进行核酸提取。
1.4 试剂的配制 取n×8μlIFVA&IFVB核酸荧光PCR混合液，n×1μl内部对照品，与n×1μlR-PCR酶（n为反应管数），振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆取上述混合液20μl置于PCR管中，然后将样品核酸提取液、DEPC-H2O、阳性对照品各5μl分别加入PCR管中，盖好管盖，立即进行PCR扩增。
1.5病毒的扩增 反应管至于定量荧光PCR仪上，按照试剂盒推荐循环参数设置：45℃×10min；95℃×15min；再按95℃×15sec→60℃×60sec，循环45次；单点荧光检测在60℃，反应体系为25μl。荧光通道检测选择：选用FAM、HEX（或VIC/JOE）和ROX通道。
1.6胶体金快速检测法按照试剂盒说明操作。
2 结果
在60份样品中，实时荧光PCR法检测出阳性样本47份，其中35份经胶体金快速检测法检测为流感阳性，同时在13份实时荧光PCR法检测为阴性样本中检出7份流感阳性样本，两者符合率为70%[（35+7/60）]，胶体金快速检测法检测灵敏度是实时荧光PCR法的74.47%（35/47），胶体金快速检测法特异性为实时荧光PCR的53.85%（7/13）。经统计学检验，P＜0.005，表明两者差异显著，具有统计学意义。
2.1特异性
只有当探针与待测模板匹配时Taq酶才会启动其5-3′端的外切酶活性，讲探针上的荧光基团切割下来而产生荧光强度的增长，因此荧光定量PCR技术克服了普通PCR由于非特异性扩增而导致的假阳性问题。双重荧光PCR方法对甲型流感的检测只有相对反应的阳性标本出现阳性扩增反应，乙型流感为阴性反应。说明针对流感优化的双重荧光PCR方法具有高度的特异性。
2.2灵敏度
将各稀释度荧光RT-PCR扩增的产物取出，利用2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。电泳结果显示，10-1到10-5稀释度的扩增产物在100-200bp之间均出现1条130bp左右的目的条带，并且无其他杂带，说明荧光RT-PCR扩增反应具有良好的特异性。但是10-6以后的稀释度就看不到有目的条带出现，这同时也说明了，同样的RT-PCR扩增反应，琼脂糖凝胶电泳鉴定的灵敏度还是低于荧光信号的判定。
3讨论
通常比较常用的流感病毒诊断方法有血清学诊断法、病毒分离和特异性抗体检测法等。然而，当新型重配流感病毒引起流感大流行时，由于短期内无法获得毒株抗体，因而不能实现血清学检测。因此开张病毒核酸检测技术研究，对于病原早期诊断具有极其重要的意义。
胶体金快速检测法以其操作简便，20分钟内即可快速得到检测结果，无需特殊仪器，操作人员经培训后易于掌握等优势，作为快速筛查的有效手段，但是其阳性率偏低，容易产生假阴性问题。
荧光PCR方法通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光PCR中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。通过对荧光的实时动态监测可对PCR产物进行定性和定量。它具有特异性强，灵敏度高，快速简便，经济实惠等优点，能在3-4小时内完成流感病毒的检验，并且实现了PCR检测的密闭操作，克服了普通PCR易污染的缺点。实验中用于探针标记的两种荧光素FAM和JOE的发射波长相差比较远，避免了因荧光波长相近而相互干扰，确保了试验的特异性和灵敏。随着全球流感疫情的日趋严重，对口岸传染病的检测要求也越来越高，荧光PCR方法可以快速有效检测出流感病毒。
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论文作者:龚靖丹
论文发表刊物:《健康世界》2015年28期供稿
论文发表时间:2016/4/12
标签：荧光论文; 流感论文; 病毒论文; 定量论文; 快速论文; 特异性论文; 胶体论文; 《健康世界》2015年28期供稿论文;