熊清明[1]2001年在《致病性迟缓爱德华菌的检测及其胞外产物的免疫效果评价》文中研究表明迟缓爱德华菌（Edwardsiella tarda，Et）对多种动物致病，其危害日益突出。为控制和预防该病，本文对致病性Et的检测和保护性抗原进行了研究。 本试验建立了致病性Et检测的Dot-ELISA，并以此为基础构建检测试剂盒。以Et强致病株JEL4的胞外产物ECP为抗原制备兔抗血清，用于Dot-ELISA检测25株Et的ECP，同时对Et的溶血素和胞外蛋白酶（ECPase）进行检测，结合小鼠和剑尾鱼的致病性试验。结果表明，溶血素与菌株的动物致病性良好相关，致病株均为溶血素产生株，ECPase与致病性无关。JEL4 ECP的Dot-ELISA结果与动物致病性的符合率达100％。在此基础上，将ECP抗血清冻干作为核心试剂，并对Dot-ELISA的反应条件进行优化，构建了检测试剂盒。该试剂盒能快速、简便、特异、灵敏地检出致病性Et。 以致病性Et JEL4的全菌灭活物（FKC）和ECP为免疫原免疫小鼠和剑尾鱼，7周后用JEL4和异源菌株进行攻击，评价了FKC和ECP的免疫保护效果。试验显示，免疫小鼠FKC组和ECP组均获良好保护；免疫剑尾鱼中，FKC和ECP组对同源菌株保护率分别为60％和100％。对异源菌株的攻击，均不能全部保护，但ECP组可明显延缓剑尾鱼死亡时间。 根据已发表的Et溶血素基因序列，设计一对引物，扩增出含438bp阅读框的溶血素基因序列，连接到真核表达载体pcDNA3.1中，构建真核表达重组质粒pHL，脂质体法转染sp2/0细胞，SDS-PAGE显示有大小为16kD的表达蛋白产生。
张永华[2]2012年在《副溶血弧菌感染斑马鱼的致病性及天然免疫应答研究》文中研究说明近年来随着水产养殖业的发展，水产动物病害问题也日益突出，副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus,Vp)是引起多种海水鱼类产生弧菌病的主要病原菌之一。由于水产动物重大病害频频发生给水产养殖业造成灾难性的危害，使得免疫防治技术在鱼病防治中呈现出日益广阔的应用前景。因此，对鱼类免疫机制的研究受到国内外学者的广泛关注，且尤为重视天然免疫应答机制的研究。斑马鱼(Daniorerio)拥有完整的免疫系统（特异和天然免疫系统），而且体型小，生命周期相对较短，易于实验室养殖，便于开展大规模的试验。斑马鱼是研究鱼类传染病的发病机理和免疫应答等基础研究的最合适的模型动物。本研究用副溶血弧菌的鱼类致病株(Vp1.2164)和人类致病株(Vp17)为研究对象，以斑马鱼为感染动物模型，探讨参与天然免疫应答的炎性细胞因子的变化规律。首先，系统比较了不同保藏方法对副溶血弧菌的毒力及生物学特性的保藏效果，为进行后续的相关研究提供了先决条件；其次，摸索其感染斑马鱼的有效方式及其致病性，分析了不同感染方式下致病菌株对斑马鱼的致病性；最后，采用荧光定量PCR技术检测了斑马鱼在创伤感染和腹腔注射副溶血弧菌后，比较了2株副溶血弧菌创伤感染和腹腔注射感染斑马鱼后，IL-1β、IFN和TNF这3种炎性细胞因子的表达变化，得到以下主要结论：1、本研究发现不同保藏方法，副溶血弧菌随保藏时间的延长毒力有不同程度的下降。短期保藏，室温斜面保藏比4℃斜面保藏效果好；长期保藏，-80℃甘油保藏和冷冻真空干燥保藏效果较好，均为24个月以上；在-20℃，保护剂脱脂牛奶比甘油的效果要好，而在-80℃甘油保藏效果很好，说明甘油在超低温下作为保护剂更适合副溶血弧菌。2、本研究发现鱼类致病株（Vp1.2164）与人类致病株(Vp17)对野生斑马鱼的毒力差异不显着，两者均出现典型的败血症症状，可在死亡鱼的体内再分离到副溶血弧菌。组织病理切片显示肠粘膜上皮细胞脱落、炎性水肿，脾脏充血，水肿。斑马鱼在肌肉注射、腹腔注射感染或者创伤皮肤后浸泡下易感染副溶血弧菌，单纯的浸泡不会被感染。相比而言，腹腔注射较易操作，是较优的感染途径。3、本研究用鱼类致病株（Vp1.2164）与人类致病株(Vp17)分别创伤感染和腹腔注射感染斑马鱼，利用荧光定量PCR技术检测IL-1β、IFN和TNF叁种炎性细胞因子的mRNA转录水平变化。结果表明：与对照相比，2株细菌不同感染条件下斑马鱼3种基因的表达量随着感染时间延长均呈现出先升高后降低的变化特点。创伤感染Vp1.2164和Vp17的斑马鱼在8h，IL-1β表达水平达到高峰，分别为对照组的125.7和100.9倍；TNF的表达水平也在8h达到高峰，分别为对照组的249和55倍；而IFN的表达量达最大值的时间在2株菌中出现差异，创伤感染Vp1.2164的斑马鱼在8h，约为对照组的11.6倍，而感染Vp17的斑马鱼在4小时，为对照组的10.4倍。腹腔注射感染Vp1.2164和Vp17斑马鱼的IL-1β表达水平在4h达到高峰，分别为对照组的56.5和48.8倍；IFN表达水平也在4h达到高峰，分别为对照组的11和2倍；而TNF的表达量达最大值的时间在2株菌中出现差异，腹腔注射感染Vp1.2164的斑马鱼在4h，约为对照组的143倍，而感染Vp17的斑马鱼在2小时，为对照组的46.2倍。结果显示斑马鱼在感染后发生急性炎症反应，且创伤后浸泡副溶血弧菌感染反应比腹腔注射慢，但8h后感染鱼发生了非常强烈的炎症反应，3种炎症相关因子表达水平比腹腔注射感染的鱼高。综上所述，我们采用适宜的菌种保藏方法保持副溶血弧菌的毒力稳定后，以斑马鱼作为感染的动物模型，采用有效的感染方法，通过检测炎性细胞因子的表达变化，研究副溶血弧菌与斑马鱼之间感染与抗感染的相互作用，为鱼体抗细菌的天然免疫应答机制研究提供了很好的研究基础。本研究的方法和结果将对今后以斑马鱼为研究模型的宿主和病原体之间的相互作用和天然免疫应答的机制探究提供良好的理论基础。
参考文献：
[1]. 致病性迟缓爱德华菌的检测及其胞外产物的免疫效果评价[D]. 熊清明. 南京农业大学. 2001
[2]. 副溶血弧菌感染斑马鱼的致病性及天然免疫应答研究[D]. 张永华. 上海海洋大学. 2012