刘维达[1]1993年在《致病酵母核型的脉冲电泳分析及在分类鉴定和临床诊断中的应用》文中研究表明念珠菌属和新型隐球菌是临床上最常见的条件致病真菌，由于各种原因引起的免疫低下患者不断增多，致病酵母引起的感染也随之迅速增加。以往对病原真菌的种间鉴别和种内分型主要建立在无性阶段表型特征基础上，难以达到分类学和流行病学所要求的准确性，稳定性和重复性的要求。脉冲电泳(PFGE)技术解决了分离大分子DNA的技术难题，为医学真菌的分子遗传学及基因型分类鉴定的研究提供了新的途径。本研究用PFGE中较先进的CHEF系统分析了187株念珠菌和23株新型隐球菌标准株和临床分离株的电泳核型(EK)，并用DNA-DNA杂交的方法探讨了不同念珠菌间的亲缘关系。 本研究首先建立了用PFGE分析致病酵母的方法学，并选择出合适的制备全染色体DNA的程序，得到了完整的染色体DNA。接着摸索出一套既能获得清晰易读的带型又有利于临床快速鉴别的电泳条件。由4组不同的电泳参数组成，还分析了影响EK的各种因素。 第二，获得致病酵母基因组结构的基本数据。(?)种不同念珠菌的染色体大小范围在0.5～2.8Mb之间，基因组单倍体染色体数目为5～14条不等，具体为白色念珠菌(?)条，热带念珠菌5条，伪热带念珠菌10条，近平滑念珠菌9条，季也蒙念珠菌6条，克柔氏念珠菌4条，类星形念珠菌10条，光滑念珠菌12条，新型隐球菌染色体数目新型变种为10或12条，gattii变种及上海变种为11条，大小范围在0.4～2.1Mb之间。 第三，得到了各念珠菌和新型隐球菌特征性EK。发现EK不仅有种或变种特异性，而且在种内存在着广泛的染色体长度多态性(CLP)。说明EK不仅可作为种间或亚种间基因型鉴别的依据，也可成为区别种内不同菌株的流行病学研究的可靠标志。 第四，对EK的实用性进行了评价，证明EK有较好的重复性和稳定性，并扩大了实验样本量。通过比较，发现EK与表型鉴定法有良好的一致性，并纠正了一些表型鉴定的错误，但未发现EK与带菌或分离部位及药物敏感性有直接关系。 最后，用3株不同种的标准念珠菌的全染色体DNA做探针，分析了(?)种不同念珠菌的亲缘关系，发现近平滑念珠菌与白色念珠菌的同源性较高，而其它念珠菌之间的亲缘性并不象原来想象的那样近。并发现rDNA在不同种甚至同种不同株的染色体上定位有差异，表明也可做为分类鉴定的特征之一。
汪贵娥[2]2008年在《短帚霉的形态学观察及致病性的动物实验研究》文中进行了进一步梳理目的:短帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)是一种腐生性条件致病真菌,通常引起甲真菌病,较少引起其他部位的感染,但目前国外已经有关于深部组织感染的报道。此菌分离于我科门诊病人,经中国医学科学院微生物研究所鉴定为Scopulariopsis brevicaulis。本研究一方面通过对短帚霉形态学观察,进一步了解短帚霉的形态学特征与产孢方式,为临床上诊断短帚霉病提供指导;另一方面,通过动物实验检测其引起系统性感染的可能性,并且观察不同免疫状态下动物的死亡情况,同时对自然死亡和分期处死的小鼠进行解剖,通过镜检、组织逆培养、组织病理学检查、组织载菌量测定等方法比较各脏器的感染程度。为进一步了解此菌的致病力和引起的病理形态学改变提供实验室依据。方法:1 DNA序列分析提取分离菌DNA,PCR扩增其26SrDNA近5’端D1/D2区域,在DNA自动测序仪上进行直接双向测序确定碱基位点,通过GenBank/EMBL/DDBJ/PDB核酸序列数据库进行同源序列检索,通过系统树显示其亲缘关系。2菌株的形态学观察2.1大体菌落观察将我科保存菌株复温24h,转种于SDA培养基上, 37℃和27℃温箱培养,每天观察菌落的生长情况。2.2光镜观察取其菌落标本置于载玻片上,10%KOH溶液溶解后,盖上盖玻片,光镜下观察。2.3扫描电镜观察取两个温度下培养10天的菌落标本,置于4%的戊二醛中固定,常规制片后在扫描电镜下观察。3动物的致病性试验3.1短帚霉系统感染动物模型的制作将保存菌株复温,转种于SDA培养基上27℃培养10天。用无菌生理盐水制备成菌悬液,通过皮下、腹腔、静脉三种途径接种至不同免疫状态的小鼠。3.2死亡率的观察连续观察各组小鼠感染该菌后四周内的自然死亡情况,记录死亡日期和死亡只数。3.3感染内脏的大体观察将不同感染时间的动物解剖,分别取出心、肝、脾、肺、肾,观察各脏器是否肿大或萎缩、有无颜色变化等。3.4直接镜检肉眼可见感染灶的脏器取脓灶处小块组织,压碎后于光学显微镜下直接镜检。3.5组织逆培养各脏器用组织研磨器研碎后挑取少许分别接种于沙堡氏试管培养基,27℃温箱培养,观察菌落的生长情况,然后挑取菌落制成湿片在光学显微镜下观察菌丝及孢子形态。3.6组织病理学检查取各脏器表面肉眼可见病理改变组织,用10%福尔马林溶液常温固定,常规脱水、透明、包埋、切片,HE和PAS染色,光镜下观察组织病理学变化。3.7肾脏载菌量(CFU)的测定单侧肾脏用组织研磨器研碎后,加无菌生理盐水1ml混匀,取10μl组织悬液均匀涂布于平皿培养基表面,27℃温箱中培养,48小时后读取平皿表面的菌落数。结果:1 DNA序列分析结果基于26SrDNA D1/D2区序列和Neighbor-Joining分析绘制的系统树,示该菌株与Scopulariopsis brevicaulis是近缘种的关系。2大体菌落观察培养3～4天,菌落开始生长,初为白色膜样菌落,生长迅速,以后变为灰褐色。3光镜下观察可见分枝分隔菌丝,帚状枝,分生孢子自环孢子梗长出一串,呈球形,壁厚,表面光滑或粗糙。4扫描电镜观察可见帚状枝,菌丝末端或侧面着生球形的分生孢子。5动物模型腹腔和静脉注射途径感染小鼠,真菌培养阳性,组织病理学检查可见大量菌丝和少数的孢子。皮下接种各脏器真菌培养和组织病理学改变均呈阴性。6自然死亡情况免疫抑制静脉组在接种后第2天开始出现死亡,第3天达到死亡高峰,死亡率高到93.3%。免疫抑制腹腔组在接种该菌后3天开始出现死亡,第7天达到高峰,至2周止,死亡率为53.3%。其余各组均无自然死亡。7内脏的大体改变见到肝脾肿大,或萎缩,呈紫红色。部分死亡小鼠的肺明显萎缩,呈粉色或白色。8直接镜检可见大量分枝分隔菌丝,圆形孢子。9组织逆培养三天后可见部分脏器长出菌落。10病理学变化苏木精-伊红染色早期为急性炎细胞浸润,可见组织细胞坏死,后期可见组织细胞及多核细胞反应性增生。PAS染色可见紫红色的菌丝和圆形孢子。11肾脏载菌量(CFU)无论免疫正常还是免疫抑制状态下,静脉注射组肾脏感染程度较腹腔组重,经统计学处理有显著性差异(P<0.05);免疫抑制腹腔注射组肾脏感染程度较免疫力正常腹腔注射组重,经统计学处理有显著性差异(P<0.05);免疫抑制静脉注射组肾脏感染程度较免疫力正常静脉注射组重,经统计学处理有显著性差异(P<0.05)。结论:1短帚霉只有丝状型一种菌落形态,可见丰富的分枝分隔菌丝,有帚状枝,分生孢子由环孢子梗产生一串,呈球形,壁厚,表面光滑或粗糙有刺,为短帚霉的形态学特征。环痕产孢为其产孢方式。2通过腹腔和静脉注射途径可以成功建立短帚霉系统性感染小鼠模型。皮下注射接种则不能致系统性感染。3免疫力低下状态更易引起感染,感染的程度也更重。但当进入体内的菌量较大时也可引起免疫力正常的小鼠的系统性感染,说明此菌具有较强的致病力。4短帚霉引起的组织病理学改变为真菌感染的急慢性炎症,并无特异性改变。5死亡率和肾脏组织载菌量显示静脉接种引起的感染程度较腹腔接种更严重。
郭梅[3]2003年在《临床主要致病真菌感染的基因诊断研究》文中进行了进一步梳理近年来，侵袭性念珠菌病、曲霉菌病等机会性真菌感染日益增多，且致病真菌的种类也不断增加。真菌血症的临床诊断比较困难，常规血培养阳性率低、耗时长；而检测真菌循环抗原(体)、特异性酶和代谢产物的血清学方法则存在特异性和敏感性低的缺陷。由于真菌血症等系统性真菌感染的死亡率高，加之近来发现的几种非白念珠菌感染的致病菌具有对常规抗真菌药物的天然耐受性，因此，及早将致病菌鉴定到种对于指导临床应用合适的抗真菌药物进行治疗具有非常重要的意义。 本文建立了PCR结合反向斑点杂交技术鉴定医学重要真菌的分子生物学方法。PCR扩增临床常见真菌DNA所用的通用引物P4501、P4502是根据真菌的ERG11基因而设计的，用此引物扩增念珠菌属和新型隐球菌DNA，扩增片段的长度为300-350bp。对扩增产物进行序列分析，表明此序列与基因库中提供的序列基本一致，同源性高达99.6％。引物之一P4501在5′端标记生物素，其PCR产物用于反向杂交分析。此通用引物不扩增其它临床常见的细菌、病毒和人类细胞的DNA分子；且PCR反应可检测出100fg的真菌DNA或10个真菌细胞。因而具有很好的特异性和敏感性。 由于白念珠菌感染占临床真菌感染的50％左右，我们应用复合PCR技术可以首先将白念珠菌鉴定出来。白念珠菌特异性引物和上述真菌通用引物同时扩增提取的真菌DNA，如为白念珠菌，则电泳图谱可显示出2条DNA带，其长度分别为300bp(通用引物扩增产物)，779bp(白念特异性引物扩增产物)。如果只出现通用引物扩增的一条带，再通过反向杂交进行种的鉴定。复合PCR技术可一步区分出白念珠菌和非白念珠菌的致病真菌，节省了人力、物力，并为临床治疗争取了时间。军事医学科学院硕士论文中文摘要 ERGll基因是高度保守的，但其中也存在可变区。种特异性寡核昔酸探针即是根据这些区域设计的，本研究合成了8种临床常见致病真菌的特异性探针:白念珠菌探针(pCal)、热带念珠菌探针(pTro)、克柔念珠菌探针(pKru)、光滑念珠菌探针(pGla)、季也蒙念珠菌探针(pGui)、近平滑念珠菌探针 (PPar)、新型隐球菌探针(pCry)，和近年来新发现的都柏林念珠菌探针 (pDub)。用此8种特异性探针对PCR产物进行反向斑点杂交，可将致病真菌鉴定到种的水平。试验结果表明，此8种探针不与其它种的真菌、细菌和人类DNA分子杂交，此方法具有高度的特异性。 利用PCR一反向斑点杂交法对112例各种临床标本进行检测分析，经与常规的培养鉴定方法(A Pl ZOC)相比较，其中107例两种方法鉴定结果完全一致，另5例中的3例PCR结果为阳性，但PCR扩增产物与上述8种探针的杂交反应均为阴性，表明是上述8种真菌以外的致病真菌，临床培养鉴定的结果为无名念珠菌 (2例)和乳酒念珠菌(1例);其余2例血液标本PCR一反向斑点杂交法结果为阳性，常规培养法为阴性。常规血培养方法约需3一6个工作日才能将致病菌鉴定到种，而本方法则只需1一2天即可，如经大量临床标本尤其是血液和脑脊液标本的检测验证，可望成为一种快速、敏感、特异的诊断方法。 为将PCR一反向杂交技术更好地应用于临床，我们初步探讨了PCR结合微孔板反向杂交的检测方法。这一方法具有比斑点杂交更为快速和简便的优点，并且具有自动化的潜能。试验结果表明，微孔板杂交的敏感性和特异性与斑点杂交相当，且容易操作，可以进行大量临床标本的检测，非常适合在临床实验室开展。
参考文献：
[1]. 致病酵母核型的脉冲电泳分析及在分类鉴定和临床诊断中的应用[D]. 刘维达. 中国协和医科大学. 1993
[2]. 短帚霉的形态学观察及致病性的动物实验研究[D]. 汪贵娥. 河北医科大学. 2008
[3]. 临床主要致病真菌感染的基因诊断研究[D]. 郭梅. 中国人民解放军军事医学科学院. 2003