王琼[1]2003年在《旋毛虫成虫虫体抗原、排泄分泌抗原和表面抗原保护性免疫的研究》文中提出目的 比较旋毛虫成虫虫体抗原、排泄分泌抗原和表面抗原对小鼠产生的免疫保护作用。 方法 收集人工感染大鼠小肠内的旋毛虫成虫，经冻融和超声粉碎制备虫体抗原。采用体外培养的方法从培养液中提取旋毛虫成虫的排泄分泌抗原和表面抗原。分别用叁种抗原各100μg与等量的福氏佐剂充分混合后经腹腔注射免疫小鼠，以佐剂组和未免疫组作对照，每隔7天免疫1次，共免疫3次。末次注射后7天，每只小鼠经口攻击旋毛虫感染期幼虫200条，于感染后7天和30天检查各组肠道成虫数和肌肉幼虫数。同时于攻击感染后30天，用ELISA检测各组小鼠血清中抗旋毛虫肌幼虫IgG的抗体滴度。攻击感染后的7天和30天，测定血液中嗜酸性粒细胞(EOS)的绝对值。 结果 1．虫体抗原、排泄分泌抗原、表面抗原和佐剂组的成虫减虫率分别为84.48％、89.98％、85.16％、2.2％；肌肉幼虫减虫率分别为69.82％、78.80％、73.94％、6.98％。2．各免疫组小鼠血清抗体滴度明显升高，虫体抗原组、排泄分泌抗原组和表面抗原组的几何平均倒数滴度(GMRT)分别为3198.89、3674.51、2784.83，分别是未免疫组的6.96、7.99、6.06倍。3．攻击感染后7天，外周血中的嗜酸性粒细胞(EOS)即开始增多，虫体抗原、排泄分泌抗原和表面抗原免疫组小鼠的EOS平均值分别为680／mm~3、695／mm~3、675／mm~3，均高于未免疫组(270／mm~3)(p＜0.01)。攻击感染后30天，血液中的EOS数增加更明显。虫体抗原、排泄分泌抗原和表面抗原免疫组小鼠EOS平均值分别为940／mm~3、965／mm~3、910／mm~3，均高于未免疫组(525／mm~3)(p＜0.01) 天津医科大学硕士研究生学位论文结论旋毛虫成虫虫体抗原、排泄分泌抗原和表面抗原均能诱导宿主产生较强的抗攻击感染的能力，且可激发特异性体液免疫和细胞免疫。成虫的排泄分泌抗原显示出更强的免疫原性。
董明治[2]2010年在《旋毛虫成囊前期幼虫抗原的初步研究》文中研究说明目的：研究大理猪源旋毛虫成囊前期幼虫(Trichinela spiralis pre-encysted larva)叁种抗原：排泄分泌抗原(excretory-secretory antigens, ES)、表面抗原(surface antigens,SA)和虫体可溶性抗原(body soluble antigens, BSA)的蛋白组分及其之间的差异,分析其免疫原性和免疫反应性,为分离和筛选出免疫原性和免疫反应性强的旋毛虫成囊前期幼虫抗原成分打基础。由于旋毛虫成囊前期幼虫比成囊期幼虫在宿主体内约早2周出现,宿主产生的抗成囊前期幼虫抗体出现也较早,可介导对成囊前期幼虫的杀伤作用,因此从成囊前期幼虫中寻找保护性抗原将是旋毛虫病免疫预防研究的一个发展方向。方法：(1)旋毛虫成囊前期幼虫的收集：20只成年大鼠,每只大鼠感染3000条旋毛虫成囊幼虫,分别于感染后14、15、16、17、18、19、20、21d将大鼠处死,用人工消化液消化肌肉收集旋毛虫成囊前期幼虫。(2)旋毛虫成囊前期幼虫抗原制备：将旋毛虫成囊前期幼虫在不含血清的RPMI-1640培养基中于5%CO2培养箱中37℃培养24h,离心、收集上清、透析、浓缩后得到排泄分泌抗原(excretory-secretory antigens, ES);将旋毛虫成囊前期幼虫在含0.25%十六烷基叁甲溴化铵(CTAB)及2%脱氧胆酸钠的RPMI-1640培养基中孵育2.5h,其间摇动培养瓶1次,离心、收集上清、透析、浓缩得到表面抗原(surface antigen, SA);将旋毛虫成囊前期幼虫反复冻融、研磨、超声粉碎、冷浸、离心,得到虫体可溶性抗原(body soluble antigens,BSA)。(3)免疫血清的制备：阴性血清的制备,SD大鼠感染旋毛虫之前尾静脉采血,制备阴性血清,-20℃冰箱保存备用。大鼠抗旋毛虫血清的制备,用旋毛虫成囊期幼虫经口感染SD大鼠(8×103条/只),从感染后第17d开始,尾静脉取血,用旋毛虫IgG抗体检测试剂盒检测感染旋毛虫大鼠血清IgG抗体效价。到感染后第20d检测得大鼠血清IgG抗体效价高达1：10240,即可于乙醚麻醉下经股动脉取血,室温静置30min,3×103r/min离心5min,取上清液即为大鼠抗旋毛虫血清,分装,-20℃冰箱保存备用。(4)旋毛虫成囊前期幼虫抗原保护性免疫的分析：分别用旋毛虫成囊前期幼虫虫体可溶性抗原、排泄分泌抗原、表面抗原免疫小鼠,同时设佐剂组和阴性对照组,间隔7d共免疫3次。末次免疫后7 d,每只小鼠用200条旋毛虫感染期幼虫经口攻击感染。感染后7d和30 d检查各组小鼠肠道成虫数和肌幼虫数；用ELISA测血清中抗旋毛虫成囊前期幼虫IgG抗体。(5)旋毛虫成囊前期幼虫叁种抗原的分析：以大理猪源旋毛虫成囊期幼虫的叁种抗原(排泄分泌抗原、表面抗原和虫体可溶性抗原)作对照,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),分别对成囊前期幼虫叁种抗原蛋白组分进行分析；采用蛋白印迹(Western-blot)对成囊前期幼虫抗原进行免疫反应性分析。结果：(1)旋毛虫成囊前期幼虫收集：旋毛虫感染后14、15、16 d大鼠膈肌均未见旋毛虫,17、18、19、20、21 d膈肌有旋毛虫的侵入并逐渐增多；17、18、19、20、21d平均每只大鼠分别收集5000、8000、10000、30000、30000条旋毛虫幼虫。(2)旋毛虫成囊前期幼虫抗原的保护性免疫：成囊前期幼虫虫体可溶性抗原、排泄分泌抗原、表面抗原和佐剂组的成虫减虫率分别为84.89%、89.73%、85.65%,2.57%；肌幼虫减虫率分别为71.71%、80.98%、73.66%,5.60%。排泄分泌抗原组、表面抗原组的成虫减虫率均高于虫体可溶性抗原组(p<0.05)。排泄分泌抗原组、表面抗原组的肌幼虫减虫率均高于虫体可溶性抗原组(P<0.01)。各免疫组小鼠血清IgG抗体滴度明显升高,虫体抗原组、排泄分泌抗原组和表面抗原组的几何平均倒数滴度分别为2798.89、3474.51、2984.83,分别是阴性对照组(459.32)的6.09、7.56、6.50倍。(3)旋毛虫成囊前期幼虫抗原的SDS-PAGE分析结果：以旋毛虫成囊期幼虫排泄分泌抗原、表面抗原和虫体可溶性抗原作对照,对旋毛虫成囊前期幼虫排泄分泌抗原、表面抗原和虫体可溶性抗原经SDS-PAGE分析和考马斯亮蓝R-250染色后,可见旋毛虫成囊前期幼虫可溶性抗原显示20条蛋白染色条带,分子量范围在120kDa-14kDa之间,其中主带10条,分子量分别为100、67、55、47、45、43、39、37、35、30kDa；旋毛虫成囊期幼虫虫体可溶性抗原显示22条蛋白染色条带,分子量范围在120kDa-10kDa之间,其中主带14条,分子量分别为90、88、67、66、55、45、43、39、30、20、16、14、12、10kDa；旋毛虫成囊前期幼虫表面抗原显示9条蛋白染色条带,分子量范围在120kDa-20kDa之间,其中主带4条,分子量分别为119、40、39、35kDa；旋毛虫成囊期幼虫表面抗原显示11条蛋白染色条带,分子量范围在120kDa-10kDa之间,其中主带7条,分子量分别为119、63、55、45、39、20、13kDa旋毛虫成囊前期幼虫排泄分泌抗原显示6条蛋白染色条带,分子量范围在45kDa-18kDa之间,其中主带3条,分子量分别为39、28、22kDa旋毛虫囊期幼虫排泄分泌抗原显示10条蛋白染色条带,分子量范围在70kDa-14kDa之间,其中主带8条,分子量分别为53、45、43、35、33、28、25、18kDa(图3)。(4)旋毛虫成囊前期幼虫抗原Western-blot检测结果：以大鼠抗旋毛虫血清检测时,旋毛虫成囊前期幼虫虫体可溶性抗原可出现5条反应条带,其中分子量为100、67、45、43、39kDa的条带着色明显；旋毛虫成囊期幼虫虫体可溶性抗原可出现5条反应条带,其中分子量为90、67、45、43、39kDa的条带着色明显；旋毛虫成囊前期幼虫表面抗原出现2条反应条带,其分子量分别为40、39kDa；旋毛虫成囊期幼虫表面抗原出现3条反应条带,分子量分别为63、55、45kDa；旋毛虫成囊前期幼虫排泄分泌抗原显示1条反应带,其分子量为39kDa；旋毛虫成囊期幼虫排泄分泌抗原显示2条反应带,其分子量为45、43kDa(图4)。而阴性血清在相应位置均无特异性反应条带出现。结论：(1)感染后20 d左右是旋毛虫成囊前期幼虫收集的最佳时期,人工消化法可以收集成囊前期幼虫。(2)旋毛虫成囊前期幼虫虫体可溶性抗原、排泄分泌抗原和表面抗原均能诱导宿主产生抗攻击感染的保护力。成囊前期幼虫排泄分泌抗原显示出显着的免疫原性。(3)旋毛虫成囊前期幼虫虫体可溶性抗原中分子量为100、67、45、43、39 kDa的蛋白组分能与大鼠抗旋毛虫血清抗体IgG发生特异性识别。(4)旋毛虫成囊前期幼虫表面抗原中分子量为40、39kDa的蛋白组分能与大鼠抗旋毛虫血清抗体IgG发生特异性识别。(5)旋毛虫成囊前期幼虫排泄分泌抗原中分子量为39kDa蛋白组分能与大鼠抗旋毛虫血清抗体IgG发生特异性识别。
董明治, 吴敏芳, 申丽洁[3]2010年在《旋毛虫成囊前期幼虫抗原保护性免疫的研究》文中研究指明目的比较旋毛虫成囊前期幼虫虫体抗原、排泄分泌抗原和表面抗原对小鼠产生的免疫保护作用。方法分别用旋毛虫成囊前期幼虫虫体抗原、排泄分泌抗原、表面抗原免疫小鼠,同时设佐剂组和阴性对照组,间隔7d免疫1次,共3次。末次免疫后7d,每只小鼠用200条旋毛虫感染期幼虫经口进行攻击感染。感染后7d和30d分别检查各组小鼠肠道成虫数和肌幼虫数;用ELISA测血清中抗旋毛虫肌幼虫IgG抗体。结果虫体抗原、排泄分泌抗原、表面抗原和佐剂组的成虫减虫率分别为84.89%、89.73%、85.65%、2.57%;肌幼虫减虫率分别为71.71%、80.98%、73.66%、5.60%。排泄分泌抗原组、表面抗原组的成虫减虫率(P均<0.05)及肌幼虫减虫率(P均<0.01)均高于虫体抗原组。各免疫组小鼠血清IgG抗体滴度明显升高,虫体抗原组、排泄分泌抗原组和表面抗原组的几何平均倒数滴度分别为2798.89、3474.51、2984.83,分别为阴性对照组(459.32)的6.09、7.56、6.50倍。结论旋毛虫成囊前期幼虫虫体抗原、排泄分泌抗原和表面抗原均能诱导宿主产生较强的抗攻击感染保护力。成囊前期幼虫的排泄分泌抗原显示出更强的免疫原性。
于艳玲[4]2008年在《旋毛虫早期识别性单克隆抗体的制备及鉴定》文中研究指明旋毛虫病是由旋毛虫(Trichinella spiralis)引起的一种呈全球性分布的人兽共患寄生虫病,可感染人及150多种动物,在我国该病仍有发生,不仅给畜牧业生产和肉品工业造成巨大的经济损失,而且严重威胁着人民群众的身体健康。旋毛虫病的临床表现症状一般不具典型特征,临床诊断较为困难,易与其他传染病相混淆。虽然肌肉活检发现幼虫或包囊虽可确诊,但在轻度感染早期往往不易检出,即使是感染晚期,因组织局限性的影响,活检阳性率也只有50%左右,且不易被人们接受。为此,寻找一种特异性强、敏感性高的诊断方法对旋毛虫病的防治具有重要意义。免疫学方法ELISA是目前最为敏感的方法,其敏感性可检测至每克肉0.01条虫体即每公斤肉含虫量少于10条,这一敏感性可完全确保肉类的安全,然而实验表明,用旋毛虫肌幼虫ES抗原为诊断抗原检测血清中抗旋毛虫抗体在感染2周后才可检出,而循环抗原(CAg)即排泄分泌(ES)抗原在最初几天就可检测到。因此,检测CAg是解决旋毛虫病早期诊断一个很有效的方法。为实现旋毛虫病的早期诊断,我们选用旋毛虫新生幼虫ES抗原作为筛选抗原,通过反复攻虫的免疫方法和单克隆抗体的制备技术获得了叁株抗旋毛虫新生幼虫ES的单克隆抗体。通过免疫荧光实验我们发现这叁株单克隆抗体可以与新生幼虫裸虫及感染早期的旋毛虫发生反应。证明我们所制备的单克隆抗体可以用于旋毛虫病的早期诊断。此外,我们还用所制备的单克隆抗体建立了旋毛虫病早期诊断双抗体夹心ELISA方法,为建立检测旋毛虫CAg早期诊断旋毛虫病的诊断试剂盒和试纸条奠定了基础。
王琼, 安桂珍[5]2004年在《旋毛虫成虫抗原的免疫保护性研究》文中研究指明目的 比较旋毛虫成虫虫体抗原、排泄分泌抗原和表面抗原对小鼠产生的免疫保护作用。 方法 检查免疫鼠和对照鼠肠道成虫、肌幼虫和血液中的嗜酸性粒细胞数;用ELISA测血清中抗旋毛虫肌幼虫IgG抗体滴度。 结果旋毛虫成虫虫体抗原、排泄分泌抗原和表面抗原免疫组的成虫减虫率分别为84.48％、89.98％和85.16％;肌幼虫减虫率分别为69.82％、78.80％和73.94％。3种抗原免疫组小鼠血中的嗜酸性粒细胞(EOS)数明显增多,血清中IgG抗体滴度明显升高,IgG抗体的几何平均倒数滴度(GMRT)分别是未免疫组的6.96、7.99和6.06倍。 结论 旋毛虫成虫虫体抗原、排泄分泌抗原和表面抗原均能诱导宿主产生较强的抗攻击感染保护力,且可激发特异性体液免疫和细胞免疫。成虫的排泄分泌抗原显示出更强的免疫原性。
杨志东[6]2007年在《旋毛虫、伪旋毛虫肌幼虫cDNA文库的构建及其免疫学筛选》文中提出旋毛虫病是一种危害非常严重的食源性人兽共患病,是世界各国屠宰动物首检和强制性必检的人兽共患病病种。在我国其不但被列为叁大人重要食源性人兽共患寄生虫病之首(旋毛虫,囊虫及棘球蚴),同时也是烈性人兽共患病(如SARS、禽流感)流行之后突现出来的可长期和经常制造突发性重大公共卫生事件的典型病种。本研究通过分子生物学技术构建旋毛虫、伪旋毛虫肌幼虫cDNA文库,利用免疫学方法对两个文库进行筛选,分离其特异性基因,从而为旋毛虫的诊断性及保护性抗原的筛选及大量制备奠定基础。本研究从旋毛虫肌幼虫中提取总RNA,并分离mRNA,通过ZAP表达载体成功构建了中国河南猪旋毛虫分离株肌幼虫cDNA文库。鉴定结果表明:库容量为1.92×106,重组率为98. 6 %,文库扩增后的滴度为1.6×109 pfu/mL。然后,以旋毛虫感染猪血清为抗体探针,对本文库进行免疫学筛选,经初筛、复筛,共筛选出15个阳性克隆,得到一个强反应原性高拷贝的旋毛虫肌幼虫cDNA分子(WM5),其编码丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor),与日本Nagano注册的cDNA相比同原性很高,仅有3个核苷酸不同,2个氨基酸发生变化。本研究者等人认为这两个核苷酸的变异可能是由旋毛虫不同分离株的单核苷酸多态性(SNP)所致,且该叁个核苷酸的变异是我国旋毛虫T. spiralis种分离株该cDNA的特异性和特征性SNP标记。本实验获得了大量丝氨酸蛋白酶抑制剂,有望成为旋毛虫病的诊断抗原基因,并为基因重组诊断抗原的进一步研究奠定基础。同时,对研究国内外物种侵入及肉类进出口具有重要意义。利用上述方法我们又成功构建了罗马尼亚猪伪旋毛虫分离株T4肌幼虫cDNA文库。鉴定结果表明:容量为4.0×106,重组率为95.4 %,文库扩增后的滴度为1.5×109pfu/ mL。应用伪旋毛虫感染猪血清对伪旋毛虫肌幼虫cDNA文库进行免疫筛选,获得44个阳性噬菌斑。选择其中27个反应信号相对较强的阳性克隆噬菌斑进行测序。发现11个克隆编码同一个未曾报道过的新基因;即编码蛋白酶激活因子亚基(Proteasome activator subunit),根据筛选实验中反应信号强弱情况及序列分析结果推断,强反应原性高拷贝的编码蛋白酶激活因子亚基的cDNA分子,有望成为伪旋毛虫病的诊断抗原基因,为筛选和克隆伪旋毛虫功能性抗原基因的深入研究奠定基础。
马鸣旺, 申丽洁[7]2008年在《旋毛虫抗原的研究进展》文中认为旋毛虫抗原分为表面抗原、排泄-分泌抗原(ES抗原)、虫体抗原和杆细胞颗粒相关抗原,本文综述了其分类、化学组成及其功能、免疫保护性和重组抗原的研究情况。
原丽红[8]2005年在《旋毛虫新生幼虫编码p46 kDa抗原基因的克隆、表达及抗原性分析》文中提出旋毛虫病是由旋毛虫(Trichinella spiralis)引起的一种呈全球性分布的人兽共患寄生虫病,严重威胁着人民群众的身体健康。本研究利用分子生物学及免疫学技术,分离新生幼虫抗原基因,从而为旋毛虫病诊断抗原及保护性抗原的筛选及大量制备奠定基础。以旋毛虫感染猪血清为抗体探针,对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选,从4×105个重组噬菌体中共获得156个阳性噬菌斑。其中WN10 cDNA 编码旋毛虫新生幼虫p46 kDa抗原,全长为1352 bp,含有1218bp完整的开放阅读框,氨基酸序列第1-18位为信号肽。GenBank数据库BlastN 同源性分析表明,与旋毛虫Ts ORF9.10 (U88241) 同源性为99%(899/906)。研究表明此基因在旋毛虫肌幼虫、新生幼虫、3日龄及5 日龄成虫期均有表达。利用PCR 技术, 从筛选得到的pBK-CMV-WN10重组质粒中扩增到不含信号肽序列的WN10基因片段,重组到原核表达载体pET-28a中。用IPTG诱导培养重组表达菌,对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示,经IPTG诱导后重组菌体裂解产物与对照菌相比出现了1条相对分子量约为48 kDa的新条带。重组蛋白的抗原性分析表明,该重组抗原对小鼠产生了较好的免疫保护效果,其旋毛虫肠道成虫和肌幼虫的减虫率分别为64.28%和61.21%,说明重组抗原可诱导小鼠机体获得较强的抗旋毛虫攻击感染的能力及产生抗旋毛虫在肌肉组织中寄生的免疫保护作用。Western-blotting 检测显示,重组抗原可被旋毛虫感染的猪血清、小鼠血清以及重组抗原免疫的小鼠血清识别,与ELISA 检测结果一致,说明在旋毛虫感染动物及重组抗原免疫后,可以刺激宿主免疫系统使其产生抗此抗原的特异性抗体应答,重组抗原具有很好的抗原性,从而为旋毛虫病诊断抗原及保护性抗原的筛选及大量制备奠定基础。
牛廷献[9]2003年在《旋毛虫新生幼虫期特性基因的克隆、表达及抗原性研究》文中研究说明利用地高辛标记的旋毛虫新生幼虫期特异性核酸探T68对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行筛选，获得1个全长为1609 bp的cDNA分子。该cDNA含有1个1395bp的开放阅读框架(ORF)，该ORF编码1个465个氨基酸残基组成的多肽，其分子量理论推导值为50.1kDa，等电点(IP)为9.7。蛋白质序列分析显示，31～64位氨基酸为信号肽序列，N末端前31～64个氨基酸以疏水性为主，而其亲水性区域位于C末端。Blastn同源性分析表明，与其他已知生物基因序列无明显的同源性，为1个新的cDNA分子，命名为：T668，GenBank注册号为：AF331160.1。Blastp蛋白质同源性分析表明，T668与丝氨酸蛋白酶(U62659)同源性达38％。同时，从cDNA文库筛选获得1个克隆G10-7，编码此蛋白C-末端275个氨基酸残基。应用PCR技术，从筛选得到的pBK-CMV-G10-7和pBK-CMV-T668重组质粒中分别扩增到G10-7和不含信号肽序列的T668基因片段，与pMD18-T载体连接后进行克隆，再将其分别克隆于原核表达载体pET28，成功地构建了pETG10-7、pETT668重组表达质粒，将其转化到E.coli表达菌株BL21(DE_3)感受态细胞中，经IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果表明，G10-7和T668表达融合蛋白的分子量分别为34kDa和49kDa。薄层扫描结果显示，随诱导时间的延长蛋白表达量逐渐增加，在分别诱导4、5h时，表达量达到高峰，目的蛋白分别占菌体总蛋白的61.7％和34.6％。Western-blotting检测显示，两种蛋白均可被感染旋毛虫阳性猪血清所识别，表明两种蛋白均具有良好的反应原性，为旋毛虫病的早期诊断及防制提供了新的潜在抗原。 为了研究重组蛋白对旋毛虫病诊断的特异性、敏感性及其免疫保护性，以重组蛋白为抗原，并以排泄／分泌(ES)抗原作为检测对照，以兔抗旋毛虫血清、猪抗旋毛虫血清及人抗旋毛虫血清为一抗，分别以辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG、羊抗猪IgG和山羊抗人IgG为二抗，建立了检测兔、猪和人旋毛虫抗体的间接ELISA方法。结果表明，以G10-7、T668重组蛋白为抗原诊断旋毛虫病，敏感性强、检出率高，且与ES抗原检测结果完全一致。可见，重组抗原有望代替ES抗原，且G10-7重组抗原可以代替T668重组抗原诊断旋毛虫病。以T668、G10-7 重组蛋白为抗原免疫小鼠，每间隔1周免疫1次，共免疫3次。末次免疫后1周， 每只小鼠攻击感染200条旋毛虫感染性肌幼虫（ML），感染后5周用消化法检查ML 负荷。同时，用 ELISA方法检测攻击感染后 1～5周血清中抗 NBL IgG滴度。结果 表明，T668、G10－7重组蛋白免疫组 ML减虫率分别为 67．0％和 63．3％，明显高于 仅用佐剂组（5．4％和 5．8％）；血清中抗重组抗原哈G滴度也明显升高。可见，T668、 G10－7重组蛋白均能诱导小鼠产生特异性体液免疫及免疫保护，有望成为旋毛虫基 因工程疫苗的侯选抗原。 在原核表达的基础上，依据Te、G10－7基因序列设计引物，分别以 pBK－CMVT668和 PBK－CWG10－7为模板，扩增出m－7和含有信号肽的 T668目 的片段，将其分别克隆于真核表达载体 PCR3．1，构建 pCRG－7和 pCRT668真核表 达载体。经脂质体转染于COS－7细胞，经培养后，分别取不同时段的COS。7细胞裂 解物和培养物上清，ELISA检测其表达蛋白的反应原性。结果表明，pCRG10－7和 pCRT668重组质粒在COS－7细胞中的瞬时表达产物均具有良好的反应性。从而为旋 毛虫核酸疫苗的研制奠定了实验基础。
毕阔[10]2015年在《旋毛虫排泄分泌抗原基因Ts-ES-1的免疫筛选及其重组蛋白诱导小鼠免疫保护性的研究》文中认为旋毛虫病是由旋毛形线虫引起的一种食源性人畜共患寄生虫病。人体感染旋毛虫病主要因食入含囊包幼虫的肉类及其制品。旋毛虫病的临床症状复杂多样，病原诊断比较困难，且药物治疗不能解决寄生虫的反复感染。目前仍无有效的旋毛虫病疫苗问世。因此，研制有效的疫苗是旋毛虫病防治中亟待解决的问题。采用免疫学筛选法从cDNA文库中钓取基因片段，是寻找旋毛虫病疫苗候选抗原分子的有效方法之一，本实验利用人工感染猪血清筛选了旋毛虫成虫cDNA文库。筛选获得的阳性克隆经测序和序列分析后，选取一编码旋毛虫排泄分泌抗原的基因进行克隆表达，并用其重组蛋白免疫BALB/c小鼠，对其免疫学特性及诱导产生的免疫保护性作用开展研究。首先，本实验用感染猪血清对旋毛虫成虫cDNA文库进行了筛选，通过叁轮筛选，获得阳性克隆42个。对筛选结果进行了序列分析。序列分析和GenBank数据库检索结果显示，8-3-4克隆的插入片段全长700bp，开放阅读框（ORF）为516bp，其编码的蛋白质由172个氨基酸组成，理论分子量19.7kDa。通过软件预测，该蛋白1~21aa为信号肽序列，在体外表达时，应去除信号肽序列，表达22~172aa，共151aa，理论分子量17.3kDa。同源性比较显示，该基因编码的蛋白与旋毛虫一假定蛋白同源性100%，与伪旋毛虫的一个21kDa排泄分泌抗原（excretory/secretory，ES）同源性达79%。综合上述结果，推断此基因编码的蛋白为排泄分泌蛋白，命名为Ts-ES-1。为获得Ts-ES-1基因编码的蛋白并进一步鉴定其免疫学特性，我们将基因的ORF去除信号肽后（453bp）与原核表达载体pET-28a(+)进行构建并进行蛋白表达。结果显示，经IPTG诱导表达的重组蛋白（rTs-ES-1）分子量约为24kDa（含载体携带的组氨酸标签），与理论值相符。经镍柱亲和层析纯化和复性后，获得纯度较高的rTs-ES-1。将纯化的rTs-ES-1隔周免疫BALB/c小鼠，免疫叁次后，取rTs-ES-1免疫血清。经ELISA鉴定，小鼠体内产生了针对rTs-ES-1的高滴度特异性IgG抗体。Western blot结果显示，病鼠、病猪、病兔以及病人血清均能识别rTs-ES-1，提示rTs-ES-1具有较好的免疫原性和抗原特异性。免疫荧光定位分析证实，Ts-ES-1分布在旋毛虫杆状体的杆状细胞内。通过RT-PCR表明在旋毛虫成虫及肌幼虫体内均有Ts-ES-1基因的转录；Western blot显示，rTs-ES-1免疫血清与旋毛虫肌幼虫和成虫的虫体抗原以及ES抗原均发生反应，在约20kDa处出现识别条带，表明rTs-ES-1既存在于天然虫体抗原中，又存在于旋毛虫的ES抗原中。此结果进一步说明rTs-ES-1是旋毛虫排泄分泌抗原的组分。其次，为评价rTs-ES-1诱导产生的免疫保护作用，本实验将BALB/c小鼠随机分为叁组，用rTs-ES-1与佐剂ISA50V2混合免疫小鼠作为rTs-ES-1免疫组；PBS与佐剂ISA50V2混合免疫及单纯PBS免疫作为对照组；隔周免疫一次，共免疫叁次。于末次免疫后2周，每只小鼠经口攻击感染旋毛虫肌幼虫500条。分别在攻虫后5天和攻虫后45天评价成虫减虫率和肌幼虫减虫率，结果显示，与PBS对照组及单纯佐剂组比较，rTs-ES-1免疫组获得了27%的成虫减虫率和42.1%的肌幼虫减虫率（p<0.01）。最后，为探讨rTs-ES-1免疫小鼠诱导产生免疫保护性的机理，本实验用ELISA法对小鼠血清中总IgG和IgG抗体亚型（IgG1、IgG2a）的水平进行了检测，同时利用ELISPOT检测了小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5）的水平。结果显示，与PBS对照组和单纯佐剂组相比，rTs-ES-1免疫组小鼠血清中产生的抗rTs-ES-1特异性抗体IgG和IgG抗体亚型（IgG1、IgG2a）的水平均明显升高（p<0.01），其中IgG1较IgG2a升高更为明显。以rTs-ES-1作为刺激物，与PBS对照组及单纯佐剂组相比，rTs-ES-1免疫组小鼠脾细胞分泌Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2及Th2型细胞因子IL-4和IL-5均明显升高。通过上述实验，我们获得旋毛虫排泄分泌蛋白Ts-ES-1基因及其原核表达的重组蛋白rTs-ES-1。rTs-ES-1免疫小鼠后可诱导产生一定的免疫保护力，成虫和肌幼虫减虫率分别为27%和42.1%。同时，rTs-ES-1可诱导小鼠产生以Th2反应为主的Th1/Th2混合型免疫应答。以上结果表明，rTs-ES-1可作为抗旋毛虫病的疫苗候选抗原分子，为抗旋毛虫病疫苗的研究奠定了基础。
参考文献：
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[8]. 旋毛虫新生幼虫编码p46 kDa抗原基因的克隆、表达及抗原性分析[D]. 原丽红. 吉林大学. 2005
[9]. 旋毛虫新生幼虫期特性基因的克隆、表达及抗原性研究[D]. 牛廷献. 中国人民解放军军需大学. 2003
[10]. 旋毛虫排泄分泌抗原基因Ts-ES-1的免疫筛选及其重组蛋白诱导小鼠免疫保护性的研究[D]. 毕阔. 首都医科大学. 2015