申永刚[1]2003年在《大鼠视神经不全损伤动物模型的建立及重组人睫状神经营养因子对视神经不全损伤后视网膜节细胞保护作用研究》文中研究指明目的 建立实验性大鼠视神经不同程度不全损伤模型，在此基础上观察重组人睫状神经营养因子对视神经不全损伤后视网膜节细胞的保护作用。方法 用同一把大号无创血管夹在球后1.5mm处分别钳夹成年大鼠视神经5秒、10秒、20秒、40秒，7天后取材观察不同致伤量对视神经病理、超微结构的影响；钳夹前及钳夹后即时、3天、7天、14天、28天时观察F-VEP变化情况，并以轴突占视神经横截面积的比例和F-VEP恢复程度作为划分损伤程度的标准。以大鼠视神经中度损伤为模型，实验组伤后即时、7天、14天、28天时玻璃体腔内注射rhCNTF 溶液2μl (1μg/μl)，对照组注射等量蒸馏水（rhCNTF溶剂）。伤后7天、14天、28天、56天取材检测。1.取材前48小时每组部分大鼠用粒蓝逆行标记RGCs，48小时后取视网膜荧光显微镜下观察、计数RGCs密度。2.用RT-PCR方法检测、观察rhCNTF对视网膜组织表达GAP-43mRNA 影响。3.用免疫组化方法检测、观察rhCNTF对视网膜组织GAP-43、GFAP蛋白表达的影响。结果1、以大号无创血管夹钳夹视神经不同时间，可以造成视神经轻，中，重度不全损伤。2、轻度损伤（5秒）后7天轴突占视神经横截面积比例为74.11%，F-VEP潜伏期恢复正常，伤后28天时振幅恢复至正常的70.00%；中度损伤（10秒）后7天轴突所占面积比例约等于54.71%， F-VEP潜伏期恢复正常，伤后28天时振幅恢复到正常的33.99%；重度损伤（20秒、40秒）后7天轴突占面积比例为30.80%-15.14%，伤后28天F-VEP潜伏期仍未恢复正常，振幅只恢复到正常的31.04%-22.58%。3、rhCNTF可以促进中度视神经不全损伤后RGCs的存活。实验组伤后7天、14天、28天、56天时RGCs存活率分别为70.18%、53.09%、37.30%、23.97%；对照组分别为42.25%、31.61%、14.92%、8.51%。伤后7天、14天实验组和对照组相比有非常显着差异(p<0.01)，伤后28天、56天两组间有显着差异（p<0.05）。4、免疫组化结果显示伤后7天两组间GAP-43表达差异不明显，伤后14天、28天、56天实验组GAP-43表达呈强阳性，对照组表达呈弱阳性。伤后7天、14天、28天、56天实验组GFAP蛋白表达强于对照组。<WP=7>5、RT-PCR结果显示，伤后7天两组GAP-43mRNA表达都较弱,两组之间差异不明显，伤后14天、28天GAP-43mRNA在视网膜组织表达呈强阳性，对照组表达呈弱阳性,两组间表达差异明显。伤后56天实验组GAP-43mRNA仍较高,对照组表达微弱。结论：1、用大号无创血管夹于球后1.5mm处钳夹视神经5秒，可以造成视神经轻度不全损伤；钳夹10秒造成中度不全损伤；钳夹大于20秒造成视神经重度不全损伤。其中视神经中度不全损伤比较适合用于研究各种干预因素对视神经损伤后神经保护与修复的作用。2、rhCNTF玻璃体腔内重复注射可以促进视神经中度不全损伤后RGCs的长期存活，对RGCs起到保护作用；并且可以促进视神经中度不全损伤后视网膜组织GAP-43mRNA、GAP-43蛋白的表达，可能在视神经损伤后的再生、修复中起重要作用。3、rhCNTF玻璃体腔内重复注射可以促进视网膜组织GFAP蛋白的表达，提示rhCNTF可能也通过间接的途径对RGCs起保护作用
雷德强[2]2009年在《视神经损伤后睫状神经营养因子神经保护效应的研究》文中提出第一部分视神经不全损伤后重组人睫状神经营养因子保护效应的研究目的研究重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)不同给药途径对猫视神经不全损伤后的神经保护效应。方法完成猫视神经不全损伤模型的制作；实验组分别给予rhCNTF静脉、前房、玻璃体内注射，对照组给予生理盐水；术后15天双侧上丘、外侧膝状体显微注射DiI逆行神经示踪；不同时间点行视觉诱发电位(P-VEP)检测；术后30天原位心脏灌注；视网膜铺片，视网膜神经节细胞计数；取术侧视神经组织，光镜和电镜观察各组视神经形态变化；视神经完成GAP-43免疫组织化学染色。结果对照组术侧眼P-VEP P-100较实验各组振幅明显减低，潜伏期明显延长，差异显着(P＜0．01)；与对照组相较，实验组视网膜神经节细胞存活数明显增加(P＜0．01)，神经结构更加完整。结论视神经不全损伤后rhCNTF不同途径给药均具有视神经保护效应，但效应存在差异，以玻璃体注射疗效最佳。第二部分重组人睫状神经营养因子联合坐骨神经移植促进视神经损伤后轴突再生的实验研究目的探讨重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)联合坐骨神经移植对猫视神经不全损伤后的神经保护效应。方法完成猫视神经不全损伤模型，并行视网膜坐骨神经移植；CNTF组给予rhCNTF玻璃体内注射，空白对照组给予生理盐水；术后15天双侧上丘、外侧膝状体显微注射DiI逆行神经示踪，坐骨神经残端Fluoro-Gold逆行神经示踪；不同时间点行视觉诱发电位(P-VEP)检测；术后30天原位心脏灌注；视网膜铺片，视网膜神经节细胞计数；取术侧视神经组织，光镜和电镜观察各组视神经形态变化；视神经完成GAP-43免疫组织化学染色。结果空白对照组术侧眼P-VEP P-100较CNTF组振幅明显减低，潜伏期明显延长，差异显着(P＜0．01)；与空白对照组相较，CNTF组视网膜神经节细胞存活数明显增加(P＜0．01)，神经结构更加完整。结论视神经不全损伤后CNTF联合坐骨神经移植具有协同视神经保护效应。第叁部分绿色荧光蛋白、超顺磁氧化铁纳米粒子双标CNTF基因修饰神经干细胞的研究目的1．完成胚胎大鼠神经干细胞分离、培养、传代及鉴定；2．构建睫状神经营养因子(CNTF)基因真核表达载体并观察其在COS-7细胞内的表达；3．建立超顺磁氧化铁(SPIO)、绿色荧光蛋白(EGFP)双标睫状神经营养因子(CNTF)基因修饰神经干细胞(NSCs)。方法1．显微解剖分离E14d胚胎大鼠脑组织，用机械吹打法制成单细胞悬液，接种于含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)及N2的DMEM／F12(1：1)无血清培养基中培养，克隆球形成后进行传代培养。取第叁代培养的细胞分别进行Nestin免疫细胞化学鉴定和诱导分化后GFAP、CNPase、β-Ⅲ-tubulin免疫细胞化学鉴定。2．应用RT-PCR从U-251细胞总RNA中扩增出CNTF CDS，将其克隆至真核表达载体pEGFPN1构建重组质粒pEGFPN1-CNTF，经酶切鉴定及序列分析后，转染COS-7细胞，应用免疫细胞化学、RT-PCR和western blot鉴定CNTF在细胞内的表达。3．重组质粒pEGFPN1-CNTF采用核转染技术转入大鼠胚胎神经干细胞，G418筛选建立CNTF基因修饰神经干细胞，SPIO标记细胞。应用免疫细胞化学、RT-PCR和western blot鉴定CNTF在基因修饰NSCs中的表达；普鲁士蓝染色、透射电镜鉴定SPIO标记率；诱导分化后免疫细胞化学鉴定其分化能力。结果1．E14d胚胎大鼠脑组织细胞培养72h后可形成悬浮生长的神经球，6-7d后即可传代；经传代扩增后得到大量同源的Nestin免疫阳性的细胞克隆球，经诱导分化后细胞呈GFAP、CNPase和β-Ⅲ-tubulin免疫阳性。2．RT-PCR产物为622bp的特异片段，重组质粒pEGFPN1-CNTF经双酶切产生618bp和4．7kb的片段，测序分析结果与文献报道结果一致，其转染COS-7细胞后，免疫细胞化学、RT-PCR和westernblot结果表明CNTF蛋白能在COS-7细胞中正确表达。3．重组质粒pEGFPN1-CNTF转染NSCs12h后EGFP开始表达；免疫细胞化学、RT-PCR和western blot表明CNTF能正确表达；普鲁士蓝染色示标记细胞内可见大量蓝染颗粒，透射电镜示SPIO颗粒位于吞饮小泡和胞浆内；体外诱导分化研究表明SPIO、EGFP双标记不影响其分化。结论成功建立了CNTF真核表达质粒pEGFPN1-CNTF和SPIO、EGFP双标CNTF基因修饰神经干细胞。第四部分睫状神经营养因子基因修饰神经干细胞移植治疗视神经损伤的实验研究目的探讨睫状神经营养因子(CNTF)基因修饰神经干细胞联合坐骨神经移植对猫视神经不全损伤后的神经保护效应。方法完成猫视神经不全损伤模型，并行视网膜坐骨神经移植；联合移植组给予CNTF基因修饰神经干细胞玻璃体内注射，神经移植组给予rhCNTF玻璃体内注射；术后165天双侧上丘、外侧膝状体显微注射DiI逆行神经示踪，坐骨神经残端Fluoro-Gold逆行神经示踪；不同时间点行视觉诱发电位(P-VEP)检测；术后180天原位心脏灌注；视网膜铺片，视网膜神经节细胞计数；取术侧视神经组织，光镜和电镜观察各组视神经形态变化；视神经完成GAP-43免疫组织化学染色。结果神经移植组术侧眼P-VEP P-100较联合移植组振幅明显减低，潜伏期明显延长，差异显着(P＜0．01)；与神经移植组相较，联合移植组视网膜神经节细胞存活数明显增加(P＜0．01)，神经结构更加完整。结论视神经不全损伤后CNTF基因修饰神经干细胞联合坐骨神经移植具有协同视神经保护效应。
佚名[3]2004年在《眼底病专题》文中研究说明S1-01脉络膜新生血管膜治疗新进展严密四川大学附属华西医院眼科S1-02年龄相关性黄斑变性发病机制的研究进展Shikun He(何世坤)Department of Pathology and Ophthalmology,Keek School of Medicine at the University of Southern California,Doheny Eye Institute,Los Angeles
杨小丽[4]2003年在《睫状神经营养因子对视神经损伤保护效应的实验研究》文中提出目的 (1)研究睫状神经营养因子及其受体在视神经损伤后不同时间视网膜中的表达及细胞定位；(2)了解玻璃体内、眼球后及皮下注射时，重组人睫状神经营养因子在SD大鼠重要器官及眼内的分布情况，确定最佳及最易接受的眼部给药方式；(3)探讨眼球后注射外源性CNTF是否对实验性的视神经损伤有保护作用；(4)探讨CNTF对原代培养的人视网膜色素上皮细胞、胶质细胞及晶体上皮细胞生长的影响；(5)了解CNTF在眼局部应用的眼部及全身毒副作用。 方法 (1)采用钳夹视神经的方法建立神经损伤的模型，在损伤后1天、7天、14天、28天获取视网膜，用RT-PCR测定视网膜中CNTFmRNA及其受体CNTFRαmRNA的表达，用West Blotting方法了解CNTF及其受体蛋白水平的表达，用免疫荧光的方法了解CNTF在视网膜各层中的表达和分布情况。(2)采用Iodogen法对rhCNTF进行放射性~(125)I标记，SD大鼠分为皮下注射组、眼球后注射组及玻璃体内注射，分别于注射后30分、1小时、2小时、3小时、24小时检测视网膜、玻璃体、视神经、肾、肝、脑、脾等组织单位质量放射性摄取百分数(％ID／g)。(3)建立钳夹伤视神经损伤模型，分为对照组及CNTF实验组，通过电镜、光镜观察视网膜各层及视神经形态，并计数视网膜各层细胞和测量视网膜各层厚度，通过电生理F-VEP检查来了解视功能。(4)体外培养人RPE、RGC细胞，分离纯化并鉴定，取第4代细胞接种于96孔板，加入不同浓度的CNTF或bFGF，MTT法检测对视网膜两种细胞生长的影响；LEC培养液中加入CNTF，光镜观察形态。(5)选用正常成年兔，实验分为3组，玻璃体内注射不同剂量的CNTF，注射后每天直接检眼镜观察眼底，光镜、电镜观察视网膜及角膜，电生理了解视网膜功能；光镜观察肝肾重要脏器的改变。(6)SPSS10.0进行统计分析。 结果 (1)损伤后1天、7天大鼠视网膜内CNTF-mRNA水平较正常组明显升高(P＜0.001)，而在损伤后14天，表达水平开始下降，到28天时，表达量非常小(P＜0.001)；而在正常大鼠视网膜内无CNTFRαmRNA表达，在损伤后的1天、7天、14天、28天均有一定水平的CNTFRαmRNA的表达(P＜0.001)；损伤后各时间均有CNTF及CNTFRα蛋白的表达，但CNTFRα蛋白的表达较弱；CNTF表达有时间及层面特异性。(2)叁种注射方式时体内相对分布以肾脏、肝脏等较高，其次是脾、肺、肌肉；皮下注射组在眼内仅有少量分布，而眼球后注射在眼内组织及脑组织内有较高分布，眼内组织分布以玻璃体内注射最高。(3)CNTF实验组神经节细胞数明显多于单纯损伤组(P＜0.001)；视网膜各层也无明显变薄；视神经无脱髓鞘改变，轴突内微管、微丝较单纯损伤组明显增多；P1波的潜伏期明显短于对照组(P<0.001)，Pl波的振幅值比对照组高(P(0.001)。(4)CNTF组RGC明显比对照组细胞密集，且细胞密度随CNTF组浓度增大而增大，吸光度值也比对照组高(P<0.001)，而RPE细胞各组间无明显差异，CNTF对LEC的生长无影响。(5)玻璃体腔内注射CNTF后2天，直接眼底镜均发现玻璃体有少量白色混浊物质，未见晶状体混浊，视网膜也未见出血等改变:光镜及透射电镜观察亦未发现视网膜各层有明显的异常改变如变性或坏死;角膜的电镜及光镜亦未见明显的改变;电生理检查各组ERG振幅变化无差异(P>0 .05);各实验组的肝肾组织均未发现与药物有关的肝脏淤血、浊肿、空泡变性等改变。结论(l)神经损伤后CNTF一mRNA的表达先短暂升高以后持续下调，而CNTFRa一mRNA在损伤后4周内均有一定量的表达，提示补充外源性CNTF可能改善神经再生的微环境而发挥保护效应。(2)眼球后注射rhCNTF可被眼内组织吸收，高于玻璃体内注射剂量注射时眼内组织可获得相当的浓度。(3)视神经损伤后注射外源性CNTF能减少视网膜各层细胞的死亡，促进视神经修复及恢复视功能。 (4)CNTF对人RGC生长有促进作用，但对RPE细胞及LEC的生长无促进作用。(5)此剂量下玻璃体内注射CNTF于兔眼是安全的，无明显毒副作用。
佚名[5]2004年在《眼外伤、眼眶病和眼整形》文中提出眼外伤的新进展马志中北京大学眼科中心目的:探索机械眼外伤予后不良的危险因素、手术时机及手术要点。方法:前瞻性研究,统一评价标准,摒除由术者,技术发展时代,手术技术等偏倚因素。236例240只眼经历玻璃体切除术的开放后节眼外伤。结果:随受伤至手术时间的延长,视网膜脱离的发现率和PVR的发生随之增加。伤后30天以后施术者视网膜脱离的发现率为65.64%,30天以内施术者
参考文献：
[1]. 大鼠视神经不全损伤动物模型的建立及重组人睫状神经营养因子对视神经不全损伤后视网膜节细胞保护作用研究[D]. 申永刚. 第叁军医大学. 2003
[2]. 视神经损伤后睫状神经营养因子神经保护效应的研究[D]. 雷德强. 华中科技大学. 2009
[3]. 眼底病专题[C]. 佚名. 中华医学会第九届全国眼科学术大会论文汇编. 2004
[4]. 睫状神经营养因子对视神经损伤保护效应的实验研究[D]. 杨小丽. 复旦大学. 2003
[5]. 眼外伤、眼眶病和眼整形[C]. 佚名. 中华医学会第九届全国眼科学术大会论文汇编. 2004