张领兵[1]2001年在《向日葵恢复系R_9花蕾cDNA文库的构建及Rf_1恢复基因的研究》文中进行了进一步梳理本研究以向日葵恢复系R_9为材料，从花蕾中提取完整的总RNA后，利用PolyATract mRNA Isolation Systems（Promega公司）分离出mRNA，然后利用Universal Riboclone ~RcDNA SynthesisSystem（Promega公司）合成双链cDNA。在cDNA末端连接上EcoRI接头，并克隆至λExCell载体，在国内外首次构建出重组效率达95.2％、滴度为1.6×10~6pfu的向日葵恢复系R_9花蕾cDNA文库。 在已经找到与恢复基因Rf_1相连锁的RAPD分子标记的基础上，将RAPD特异片段进行扩增，从胶中回收0.9kb的特异片段，然后克隆至pMD18-T载体。通过蓝白斑筛选，挑取白色克隆，利用BamHⅠ与HindⅢ进行双酶切鉴定，最终得到含有0.9kb插入片段的重组质粒pRf_1。对插入片段进行序列测定，然后应用分子生物学软件DNASIS对其进行分析。分析结果显示插入片段的大小为860bp，可能含有部分阅读框。 对pRf_1进行BamHⅠ及HindⅢ双酶切，然后从胶中回收860bp的插入片段，用Digoxigenin（DIG）对该片段进行标记，并通过点杂交及Southern印迹杂交对其进行鉴定，然后以此为探针对cDNA文库进行筛选，通过部分筛选获得1个cDNA阳性克隆。释放质粒后，进行酶切鉴定，该阳性克隆cDNA插入片段的大小为2kb左右。本研究为进一步鉴定恢复基因Rf_1及其表达研究奠定了基础。
张爱香[2]2003年在《枸杞叶片、果实cDNA文库的构建及LycB、IPI基因的分离》文中认为本研究以宁夏枸杞叶片及果实为材料，采用异硫氰酸胍—酚—氯仿法提取完整的总RNA，利用PolyATract mRNA Isolation System(Promega公司)分离mRNA，然后利用Universal Riboclone ~RcDNA Synthesis System (Promega公司)合成双链cDNA，在cDNA末端连接上EcoRⅠ接头，并与λExCell载体连接，利用Packagene Lambda DNA Packaging System进行了包装，在国内外首次构建出滴度分别为2.78×10~5 pfu／ml、8.4×10~4 pfu/ml，重组效率为88.1％、86.9％的枸杞叶片及果实cDNA文库。用Digoxigenin(DIG)标记龙胆草LycB探针、IPI探针、PSY探针、ZDS探针、LycE探针，并对枸杞叶片及果实cDNA文库进行筛选，获得8个LycB cDNA阳性克隆及7个IPI cDNA阳性克隆。释放质粒后，进行酶切鉴定，LycB阳性克隆cDNA插入片段的大小为2.1kb左右，IPI阳性克降cDNA插入片段的大小约为1.5kb。本研究为利用基因工程手段来调控类胡萝卜素的生物合成奠定了基础。
参考文献：
[1]. 向日葵恢复系R_9花蕾cDNA文库的构建及Rf_1恢复基因的研究[D]. 张领兵. 中国人民解放军军需大学. 2001
[2]. 枸杞叶片、果实cDNA文库的构建及LycB、IPI基因的分离[D]. 张爱香. 中国人民解放军军需大学. 2003
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