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蟋蟀神经肽基因Grb-ast2串联体的表达与虫效研究

张世清[1]2004年在《蟋蟀神经肽基因Grb-ast_2串联体的表达与虫效研究》文中研究表明Grb-AST是从蟋蟀(Cryllus bimaculatus)脑中分离的一种保幼激素抑制素,体外实验显示它强烈抑制昆虫咽侧体合成保幼激素。蟋蟀AST基因前体共编码15个AST多肽,Grb-ast_2是编码第2个多肽的序列,这个多肽含有8个氨基酸残基,一级结构为N-LPVYNFGL,所以定名为Grb-AST_2。 根据Grb-AST_2和GKR(AST神经肽之间的连接序列)的编码序列设计合成两对引物。利用改进的“自身模板引物”法进行串联体的构建。先用T4 DNA polymerase构建成模板,再通过高保真DNA聚合酶(Pyrobest~(TM) DNA polymerase)PCR进行扩增,从中得到一个含有17个拷贝的Grb-ast_2的串联体基因。 将Grb-ast_2串联体基因克隆进大肠杆菌pET-44a表达载体,将重组子导入表达宿主菌E.coli BL21(DE3)进行表达,菌液浓度(OD_(600)=0.8)、诱导剂(IPTG)浓度1.0mM、37℃组合进行诱导表达5小时,表达量最高。Uvi光密度扫描分析表明Grb-ast_2基因表达量占细菌总蛋白的37.2%。 表达产物经QIAGEN公司的Ni-NTA Agarose试剂盒纯化目的蛋白后,进行虫效研究,初步实验结果显示对甜菜夜蛾幼虫具有一定的毒杀作用及抑制生长发育。

孙建波[2]2004年在《蟋蟀神经肽基因Grb-AST_6串联体的表达及虫效研究》文中研究指明蟋蟀保幼激素抑制素(allatostatin AST)是蟋蟀脑中分泌的一种多肽类激素物质。体外实验显示它可抑制昆虫咽侧体合成保幼激素。蟋蟀AST基因串联体共编码15个AST多肽,每个多肽抑制咽侧体合成保幼激素的能力不同。分子生物学研究表明,它们拥有共同的C末端序列Y/FXFGL/I/V。 Grb—AST_6编码8个氨基酸残基,其一级结构为N-SRPFGFGL。Grb-AST_6编码15个AST多肽中的第6个多肽。本文采用改进的“自身模版-引物”法构建Grb-ast_6串联体,先设计出一对特异引物,用T4 DNA polymerase构建成模板,再通过Pyrobest~(TM) DNA polymerase进行PCR扩增,从中得到一个含有16个拷贝的Grb-AST_6的串联体。 将构建后的基因串联体分别在大肠杆菌pET表达系统中的pET21,pET22,pET30,pET44a表达载体和pQE表达系统中的pQE30表达载体中进行了表达。从各个表达结果中筛选出表达量高的pQE30/SG13009[pREP4]表达组合。这个组合进行表达的最优条件为菌液浓度OD_(600)=0.8和诱导剂浓度1.0mM。表达蛋白质的分子量为22.9114KD。 用表达产物饲喂甜菜夜蛾,进行虫效实验,实验结果表明Grb-AST_6表达蛋白具有较明显的抑制幼虫生长和杀虫的能力。饲喂Grb-AST_6表达蛋白6天后,处理组死亡率明显高于对照组。第8天死亡率达到高峰,为30.58%。对照组为2.26%。

参考文献:

[1]. 蟋蟀神经肽基因Grb-ast_2串联体的表达与虫效研究[D]. 张世清. 华南热带农业大学. 2004

[2]. 蟋蟀神经肽基因Grb-AST_6串联体的表达及虫效研究[D]. 孙建波. 华南热带农业大学. 2004

本文来源: https://www.lw33.cn/article/e68ca8e58f847aa9814c2d93.html